蔣 超,王 超,任曉楠,周曉輝

(復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心,上海 201508)

慢性腎疾病(chronic kidney disease,CKD)是當(dāng)前一個全球性的疾病,嚴(yán)重危害人類的生命健康,成為了衛(wèi)生健康和經(jīng)濟(jì)領(lǐng)域的巨大負(fù)擔(dān)。根據(jù)國際腎病預(yù)后組織(kidney disease improving global outcomes,KDIGO)的定義,腎功能減退,腎小球濾過率不到60mL/(min·1.73m2)或者具有腎損傷的標(biāo)志物,如蛋白尿、電解質(zhì)紊亂、尿沉渣異常、組織學(xué)異常和影像學(xué)檢測結(jié)構(gòu)異常等,并且癥狀至少持續(xù)3個月即可被認(rèn)為是CKD[1]。CKD可由多種疾病及相關(guān)因素引起,造成腎功能和結(jié)構(gòu)進(jìn)行性喪失和不可逆的損傷,其中高血壓和糖尿病等疾病占據(jù)主要原因,除此之外還包括單基因、多基因遺傳因素、表觀遺傳因素和不良環(huán)境因素影響等[1]。對于CKD的患病率及危險因素的調(diào)查分析也表明年齡、高血壓和糖尿病等與CKD有著密切的關(guān)系[2]。目前分布在全球各個地區(qū)和國家CKD患者的患病率約在3.0%～18.0%,患者分布各個年齡層,其中老年人居多。造成患病率的差異因素包括年齡、收入、地理位置、環(huán)境、飲食和氣候影響等[3]。

早期階段的CKD癥狀不容易發(fā)現(xiàn),因此一旦發(fā)現(xiàn)癥狀一般都在CKD較嚴(yán)重階段。常規(guī)治療不能阻止大多數(shù)CKD病情進(jìn)展到終末期腎疾病(end stage kidney disease,ESKD)階段,最后通常需要腎透析或者腎移植。腎透析雖然能夠提高患者的生存率,但這與透析前后細(xì)心護(hù)理有很大關(guān)系,而且還需要考慮昂貴的醫(yī)療費用和病人的生活質(zhì)量。腎移植是治療ESKD的有效方法,但是由于缺少供體來源的器官而受到限制,而且移植腎的病人需要長期使用免疫抑制藥物,這容易導(dǎo)致病人感染其它疾病[4]。因此仍需要探索更有效的CKD治療方案。

干細(xì)胞(stem cells,SCs)是一種具有自我更新和多向分化能力的細(xì)胞,根據(jù)其來源可以分為3類:胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell,ESC)、誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)和成體干細(xì)胞(somatic stem cell,SSC)。其中SSC包括間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSC)、造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell,HSC)和神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell,NSC)等[5-6]。近年來,對SCs深入和突破性的研究給臨床上多種疾病的治療帶來了希望,包括CKD[7]。SCs治療CKD的機(jī)制如旁分泌作用、促進(jìn)細(xì)胞自噬、抗炎癥、抗凋亡和介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)等已經(jīng)被逐漸闡明,同時SCs自身也具有多向分化潛能。正因為SCs的自身優(yōu)勢,故可通過體外培養(yǎng)形成腎類器官,然后移植入體內(nèi),修復(fù)替代損傷腎;或者直接將SCs移植入宿主體內(nèi)發(fā)揮多向分化潛能、旁分泌作用、抗炎癥和介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)等方面的功能,促進(jìn)腎功能改善和結(jié)構(gòu)修復(fù)[7-8]。本文將從MSC、ESC和iPSC在治療CKD方面的應(yīng)用潛力進(jìn)行闡述。

1 SCs治療CKD的潛力

1.1 MSC治療CKD的潛力

MSC屬于多能成體干細(xì)胞,具有強(qiáng)大的自我更新和多譜系分化潛能,能夠從骨髓、脂肪組織、外周血和臍帶血等部位分離出來[9]。近年來一些研究已經(jīng)逐漸發(fā)現(xiàn)了MSC的一些功能特點,如MSC定位于受損組織器官部位,定向分化為器官特異性細(xì)胞,修復(fù)受損組織或者通過旁分泌和內(nèi)分泌作用產(chǎn)生生物活性因子,如細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子和胞外泡(extracellular vesicles,EV)發(fā)揮促細(xì)胞增殖、抗纖維化、抗炎、抗凋亡和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等作用[10-11]。這些功能特點使MSC在治療CKD方面顯示出強(qiáng)大的潛力。

目前不少研究已經(jīng)成功的將MSC培養(yǎng)成為腎小球系膜細(xì)胞、足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞等[12-13]。Machiguchi等[13]將人類MSC誘導(dǎo)培養(yǎng)成腎小管上皮細(xì)胞,然后將其移植入免疫缺陷大鼠的腎皮質(zhì),可檢測到新生的腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)。也有研究表明MSC能夠延緩CKD進(jìn)一步發(fā)展,保護(hù)腎功能、減輕組織損傷和腎纖維化等[14-15]?，F(xiàn)在大多數(shù)研究認(rèn)為MSC主要是通過旁分泌生物活性因子發(fā)揮對腎的保護(hù)作用。日本研究小組利用細(xì)胞片工程技術(shù)(cell sheet engineering technology),把能夠分泌人肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)的間皮細(xì)胞片移植到單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)大鼠的腎包膜表面,發(fā)現(xiàn)移植的細(xì)胞片能夠較長時間存活于體內(nèi),且能夠不斷分泌HGF抑制腎小管和腎盂的擴(kuò)張,維持腎小管周圍毛細(xì)血管密度和腎血流量,從而控制大鼠腎纖維化進(jìn)展[16]。然后又將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片(bone marrow mesenchymal stem cell sheets,BM-MSC sheets)移植到大鼠缺血再灌注損傷(ischemiareperfusion injury,IRI)模型腎表面,發(fā)現(xiàn)BM-MSC sheets也能夠存活在腎表面且能夠分泌HGF和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),從而保護(hù)腎小管、減輕內(nèi)皮損傷、維持微血管密度和控制腎纖維化進(jìn)展。該研究第1個將BMMSC sheets應(yīng)用于腎疾病治療,證明了細(xì)胞片療法具有治療腎疾病包括CKD的潛力[17]。

近年來,MSC分泌的EV在一些疾病治療中也具有重要的作用。EV中包含蛋白質(zhì)、MicroRNA和脂質(zhì)分子等,MSC可旁分泌EV作用于其它細(xì)胞傳遞細(xì)胞信號,從而在損傷組織中發(fā)揮一定的作用[18]。Nassar等[19]臨床研究實驗證明臍血MSC來源的EV能夠改善整體腎功能,包括腎小球濾過率、血肌酐和血尿素氮水平都有所改善,同時還能減輕炎癥免疫反應(yīng),而且通過一年的臨床評估表明該治療方法是安全的。血管鈣化是CKD的常見并發(fā)癥,實驗表明來源于BM-MSC的外泌體(exosomes,EV的一種類型)具有改善人主動脈血管平滑肌細(xì)胞鈣化的功能,因此研究推測外泌體也可能改善CKD引起的血管鈣化[20]。Wang等[21]也發(fā)現(xiàn)來源于MSC的EV包含了相關(guān)MicroRNA分子,這些小分子可能通過影響TGF-β分子介導(dǎo)下游信號傳遞,從而在腎纖維化進(jìn)展中起到關(guān)鍵作用。

但是CKD引起的病理生理狀況和體內(nèi)不良環(huán)境會影響MSC的植入和存活,從而影響MSC的治療效果。近年來已經(jīng)有研究策略來解決這些問題,如低氧預(yù)處理MSC可以提高其對體內(nèi)不良環(huán)境的抵抗力、促進(jìn)其存活增殖和增強(qiáng)促血管生成的能力[22]。一些生物活性因子如表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor,IGF)等預(yù)處理MSC也可提高其存活增殖率、遷移能力和旁分泌活性[23]。此外,用激素如褪黑素(melatonin)預(yù)處理MSC對其抵抗體內(nèi)惡劣微環(huán)境有著重要作用[24]。一項研究證明褪黑素預(yù)先處理BM-MSC可以增強(qiáng)其歸巢和存活能力,并增強(qiáng)對腎的保護(hù)作用[25]。另一項研究也認(rèn)為褪黑素刺激細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體可增強(qiáng)CKD病人MSC的功能,包括提高其線粒體功能、抑制其衰老、促進(jìn)其增殖和增強(qiáng)產(chǎn)生血管生成細(xì)胞因子的能力。通過小鼠體內(nèi)實驗也驗證該方法能夠提高移植的MSC存活率,并保護(hù)小鼠的腎血管[26]。因此基于這些預(yù)處理策略可進(jìn)一步提高M(jìn)SC的治療效果。

可見MSC在保護(hù)腎結(jié)構(gòu)、改善腎功能和控制腎纖維化等方面顯示出強(qiáng)大的潛能。雖然MSC具有多向分化潛能,但是以上研究表明MSC主要是通過旁分泌多種生物活性因子發(fā)揮保護(hù)和修復(fù)腎的作用。

1.2 ESC治療CKD的潛力

ESC是來源于囊胚時期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的一種多潛能干細(xì)胞,具有自我更新和分化為所有細(xì)胞類型的細(xì)胞,被廣泛研究并用于再生醫(yī)學(xué)方面[27]。

ESC可分化為腎各種類型的細(xì)胞,具有再生腎能力[28]。許多研究學(xué)者也證實了ESC的強(qiáng)大再生能力。Narayanan等[29]將人類ESC體外培養(yǎng)分化成具有腎近端小管功能特征的細(xì)胞,然后移植到嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠皮下,可以形成簡單的腎上皮。來自日本研究小組兩項研究分別將鼠和人的ESC體外誘導(dǎo)形成腎小管細(xì)胞,經(jīng)過培養(yǎng)也產(chǎn)生了腎小管結(jié)構(gòu)[30-31]。Takasato等[32]通過在特定培養(yǎng)條件下分階段添加骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bone morphogenetic protein4,BMP4)、激活素A(activin A)、成纖維細(xì)胞生長因子9((fibroblast growth factor 9,FGF9)、維甲酸(retinoic acid,RA)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bone morphogenetic protein7,BMP7)等體外誘導(dǎo)人類ESC形成后原始條紋(posterior primitive streak)和中間中胚層(intermediate mesoderm,IM),然后發(fā)現(xiàn)了腎祖細(xì)胞(nephron progenitor cells,NPCs)和相關(guān)腎結(jié)構(gòu)的形成。而且用另外2種因子CHIR99021(Wnt信號通路激動劑)和FGF9,誘導(dǎo)效果更好,并且認(rèn)為在形成腎結(jié)構(gòu)過程中細(xì)胞間能夠相互影響,自組織形成早期腎單位。這與其它的兩項研究結(jié)果相似[33-34],其中Morizane等[34]以更加有效的方案將人類ESC誘導(dǎo)為NPCs,有效率達(dá)到90.0%,并通過2D或者3D培養(yǎng)NPCs形成了具有足細(xì)胞、近端小管、Henle環(huán)和遠(yuǎn)端小管的腎類器官。由于體外研究證明了ESC的分化潛能,因此也有體內(nèi)實驗研究將人ESC經(jīng)過2D培養(yǎng)形成NPCs,皮下移植到免疫缺陷鼠中,形成的結(jié)構(gòu)基本上包含了腎單位各組分,包括毛細(xì)血管網(wǎng)、足細(xì)胞、基底膜和系膜細(xì)胞等,并且形成的腎小球也具有濾過功能。相比于體外2D和3D培養(yǎng),體內(nèi)的環(huán)境可以更好的促進(jìn)NPCs形成較為成熟和完整的腎單位結(jié)構(gòu)[35]。但是要產(chǎn)生完全成熟的腎還需要更多的研究。最近一項新的研究將ESC培養(yǎng)產(chǎn)生未完全成熟的腎類器官,該研究描述了腎類器官每個發(fā)育階段的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化,概括了腎發(fā)育的過程,并表明基因調(diào)控對腎發(fā)育至關(guān)重要,對未來研究腎發(fā)育和體外產(chǎn)生成熟的腎提供了重要的參考策略[36]。

除了以上將ESC通過分化培養(yǎng)為具有腎單位結(jié)構(gòu)的腎類器官的研究,也有研究將載有ESC的細(xì)胞明膠(gelatin microcryogels,GMs)植入5/6腎切除CKD的大鼠腎中,發(fā)現(xiàn)可以減緩大鼠CKD的進(jìn)展,其中血漿尿素氮水平、腎小管損傷和腎小球硬化指數(shù)都有不同程度的改善[37]。此外,Tan等[38]將小鼠來源的ESC分化為輸尿管芽(ureteric bud,UB)祖細(xì)胞,然后與后腎間充質(zhì)(metanephric mesenchyme,MM)細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生腎類器官,并將該腎類器官用于藥物和化學(xué)物質(zhì)的毒性檢測。

雖然ESC為CKD以及其它多種疾病的治療帶來了希望,但是ESC需要從胚胎中分離,從而限制了其獲取來源;另外移植的ESC也會形成畸胎瘤和產(chǎn)生機(jī)體免疫排斥的問題,因此限制了其臨床應(yīng)用[39]。

綜上所述,這些實驗研究說明ESC能夠被誘導(dǎo)分化為腎譜系細(xì)胞,通過培養(yǎng)可產(chǎn)生腎類器官,并用于移植和腎藥物毒性檢測等。這為ESC治療CKD提供了堅實的數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1.3 iPSC治療CKD的潛力

日本科學(xué)家用4種因子Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4成功的誘導(dǎo)出iPSC。該iPSC能夠表現(xiàn)出ESC的形態(tài)和生長特性,并且能夠產(chǎn)生三胚層各種組織,因此與ESC一樣具有多系分化能力[40]。

目前已經(jīng)有一些方案將iPSC分化為腎譜系細(xì)胞,進(jìn)行腎發(fā)育和腎重建的研究[41]。Takasato等[42]用CHIR9902和FGF9兩種因子誘導(dǎo)出UB和MM,經(jīng)過3D培養(yǎng)形成了具有腎皮質(zhì)、腎髓質(zhì)、腎小球、腎近端小管、遠(yuǎn)端小管和集合管等結(jié)構(gòu),表明iPSC可形成較成熟的腎成分。Morizane等[43]用更加有效、特異和簡化的誘導(dǎo)方案體外將iPSC誘導(dǎo)成為NPCs,通過培養(yǎng)也產(chǎn)生了包含近端小管、遠(yuǎn)端小管和Henle環(huán)等多節(jié)段類似于體內(nèi)的腎單位結(jié)構(gòu)。Tsujimoto等[44]用人類iPSC(hiPSC)來源的NPCs與UB體外培養(yǎng)產(chǎn)生了腎類器官,形成的腎小球、腎小管和集合管能夠自組織相互連接。移植到免疫缺陷小鼠腎包膜下產(chǎn)生的血管化網(wǎng)絡(luò)可與宿主腎相互連接。此外,也有研究用hiPSC建立腎類器官疾病模型,如先天性腎病綜合征(congenital nephrotic syndrome)和常染色體隱性遺傳性多囊腎(ARPKD)等。這些模型可用于腎疾病藥物的開發(fā)及治療效果的評估檢測[41,45]。

目前大多數(shù)研究是將iPSC誘導(dǎo)成NPCs進(jìn)而形成腎類器官,從而修復(fù)和重建腎。而將iPSC細(xì)胞直接用于治療CKD的動物模型研究報道較少。研究發(fā)現(xiàn)促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)對治療CKD引起的腎貧血具有一定的療效[46]。Hitomi等[46]將肝來源的hiPSC細(xì)胞誘導(dǎo)為能夠產(chǎn)生EPO的細(xì)胞(hiPSC-EPO),該類細(xì)胞在體內(nèi)和體外都具有產(chǎn)生EPO的能力,并且能夠改善小鼠的腎貧血。因此,hiPSC-EPO可以作為治療腎貧血一個方法策略。也有研究表明直接移植hiPSC能夠保護(hù)CKD大鼠腎、減輕腎間質(zhì)纖維化、腎小管萎縮和腎小球硬化等,從而抑制CKD進(jìn)展[47]。另外iPSC來源的MSC(iPSC-MSC)也可以保護(hù)CKD大鼠腎功能,經(jīng)過iPSC-MSC治療的大鼠尿肌酐水平和尿蛋白都有所降低,殘余腎部分和腎小管損傷也得到了保護(hù)和改善[48]。

綜上,用iPSC進(jìn)行腎再生是一個很好的策略方法。這些再生的腎類器官可用于移植、構(gòu)建疾病模型進(jìn)行藥物開發(fā)檢測等方面。但是當(dāng)前存在的不足之處是體外形成腎類器官在大小、組分和功能等方面都不夠成熟,而且體內(nèi)不能有效的連接到血管,從而無法發(fā)揮與宿主腎相同的作用。因此我們?nèi)匀恍枰剿饔行У哪I重建方案來解決當(dāng)前的問題,如種間囊胚互補(bǔ)、將細(xì)胞種植到腎支架上和3D生物打印技術(shù)等。這些方案也可能為重建結(jié)構(gòu)功能成熟的腎提供了技術(shù)路線[49]。

2 總結(jié)和展望

CKD嚴(yán)重危害人類的生命健康,成為全球衛(wèi)生健康和經(jīng)濟(jì)鄰域一個巨大的負(fù)擔(dān),目前還沒有有效的治療手段來應(yīng)對CKD。近年來研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞療法在治療CKD方面有一個很好的應(yīng)用前景。本文總結(jié)了MSC、ESC和iPSC3種SCs治療CKD的應(yīng)用潛力。MSC主要是通過旁分泌各種細(xì)胞因子和EV促進(jìn)腎修復(fù)、腎功能改善、抑制腎纖維化和鈣化等,但因MSC易受到體內(nèi)環(huán)境影響而降低了其治療效果。ESC和iPSC更多用于體外和體內(nèi)形成腎類器官修復(fù)損傷腎,研究腎發(fā)育機(jī)制,建立疾病模型用于開發(fā)和評估治療藥物等。3種SCs優(yōu)缺點及應(yīng)用潛力詳見表1。雖然現(xiàn)在大多數(shù)研究還不能夠產(chǎn)生完全和體內(nèi)大小、功能相同的腎用于移植,但是這些方法策略為以后的研究打下了堅實的基礎(chǔ)。因此,隨著未來對干細(xì)胞治療研究的更加深入,干細(xì)胞技術(shù)有很大希望能夠治療CKD以及其它腎相關(guān)類型的疾病。

表1 三種SCs優(yōu)缺點的比較Table1 Comparison of the advantages and disadvantages of three kinds of stem cells