阿托伐他汀抑制TRPM2表達(dá)和開放對(duì)血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激的影響

俞榮耀，于子豪，朱海洋，沈晨嵐，郭佳音，茹筱晨

(湖州師范學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，浙江 湖州 313000)

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

阿托伐他汀原藥購自輝瑞公司；苯腎上腺素(phenylephrine, PE)、乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)、MTT、H2O2、膠原酶(C9891)、TRPM2抗體、β-tubulin抗體購自Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco公司；ECM培養(yǎng)基購自ScienCell公司；Flou-4 AM、Pluronic acid F-127、PBS購自Invitrogen公司；山羊抗兔IgG購自碧云天公司.Krebs-Henseleit(K-H)液組分(mmol/L)：NaCl 118.00、KCl 4.70、CaC121.25、KH2PO41.20、MgSO41.20、NaHCO325.00、葡萄糖 10.00、pH 7.4.NPSS緩沖液組分(mmol/L)：CaCl21.00、NaCl 140.00、KCl 1.00、MgCl21.00、glucose 10.00、Hepes 5.00、pH 7.4.

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

TRPM2基因敲除(TRPM2-/-)小鼠和野生型(WT)小鼠，小鼠為10～12周齡.將小鼠置于無特異病原體(specific pathogen free, SPF)級(jí)的飼養(yǎng)條件下，保持12 h光照和12 h黑暗循環(huán)，室溫保持20～23 ℃，在此期間小鼠自由進(jìn)食和進(jìn)水.所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序均符合美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)公布的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理與使用指南.

1.3 小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(MAEC)的分離與培養(yǎng)

用CO2對(duì)小鼠實(shí)施安樂死，并迅速分離其胸主動(dòng)脈，將其置于4 ℃磷酸鹽緩沖液(PBS)中，并移入生物安全柜，用PBS清洗3次；在體視顯微鏡下去除血管周圍的脂肪和結(jié)締組織，剪碎血管后移至10 mL離心管中，加入5 mL 0.2%膠原酶溶液(PBS 配制)，置于37 ℃水浴搖床中震蕩20 min，待消化完全后加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化；1 200 g離心5 min，棄上清，加入1 mL ECM培養(yǎng)基重懸，移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，再加入適量的ECM完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；1 h后，待細(xì)胞貼壁，換液后繼續(xù)培養(yǎng)；用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代[10].

1.4 TRPM2檢測(cè)Western blot蛋白表達(dá)

用阿托伐他汀(10-5mol/L)孵育MAEC 7天，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞總蛋白；采用 7.5% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白，分離完畢濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用5%的脫脂奶粉室溫封閉90 min，再用兔源TRPM2抗體(1∶500)、兔源β-tubulin抗體(1∶500)4 ℃ 孵育過夜，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶10 000)，室溫孵育1 h；洗膜，ECL反應(yīng)，膠片曝光顯影.采用Image J軟件分析條帶OD值.TRPM2表達(dá)水平用β-tubulin標(biāo)準(zhǔn)化的相對(duì)豐度表示.

1.5 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度測(cè)定

將培養(yǎng)的MAEC接種于圓形蓋玻片上，待細(xì)胞融合度約為60%時(shí)棄培養(yǎng)基，再用NPSS緩沖液清洗3次，加入200 μL含5×10-6mol/L鈣離子熒光探針Fluo-4 AM和0.02% Pluronic acid F-127的NPSS緩沖液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱避光孵育1 h；換液，將蓋玻片置于特制的共聚焦小皿內(nèi)，并加入500 μL NPSS 緩沖液.實(shí)驗(yàn)中加入5×10-4mol/L H2O2誘導(dǎo)鈣內(nèi)流.用激光掃描共聚焦顯微鏡(FV1000，奧林巴斯，日本)，在激發(fā)波長為488 nm、發(fā)射波長為515 nm的條件下，實(shí)時(shí)連續(xù)地記錄細(xì)胞內(nèi)鈣熒光變化.鈣熒光相對(duì)強(qiáng)度用實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度和加入H2O2前基礎(chǔ)熒光強(qiáng)度的比值來表示(F1/F0).

1.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

將MAEC接種于96孔培養(yǎng)板，在細(xì)胞融合前用含0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行同步化處理24 h；以H2O2(5×10-4mol/L)處理細(xì)胞4 h，換液，每孔加入5 g/L MTT 20 μL，再培養(yǎng)4 h；傾去培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μL/孔；待紫色結(jié)晶完全溶解后，用酶聯(lián)免疫儀在波長570 nm處讀取吸光度(OD).取8個(gè)平行孔的OD值均數(shù)按公式計(jì)算細(xì)胞存活率.細(xì)胞存活率(%)=試驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD×100%.

1.7 小鼠胸主動(dòng)脈環(huán)的制備

用阿托伐他汀(50 mg·kg-1·d-1)連續(xù)對(duì)小鼠灌胃14天，對(duì)照組以等體積的PEG(溶媒)灌胃；對(duì)小鼠以CO2實(shí)施安樂死，打開小鼠胸腔，取胸主動(dòng)脈,并將其置于4 ℃的Krebs-Henseleit(K-H)液中，去除血管周圍的脂肪和結(jié)締組織，剪成約3 mm長的血管環(huán)；將胸主動(dòng)脈環(huán)懸掛于微血管張力測(cè)定系統(tǒng)(610 M，DMT公司，丹麥)的浴槽內(nèi)，記錄血管環(huán)張力變化；浴槽內(nèi)加有37 ℃ K-H液，持續(xù)通入95% O2+5% CO2的混合氣體；調(diào)節(jié)基礎(chǔ)張力至3 mN，每隔15 min換液1次，平衡1 h后加入KCl(6×10-2mol/L)收縮血管環(huán)，重復(fù)3次，以激發(fā)血管環(huán)活性；重新平衡血管環(huán)30 min，加入PE(10-6mol/L)，激發(fā)血管環(huán)收縮，待張力穩(wěn)定后，用ACh(10-6mol/L)檢驗(yàn)血管內(nèi)皮是否完整，若加入ACh后血管舒張幅度大于60%，視為內(nèi)皮基本完整，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.8 小鼠胸主動(dòng)脈環(huán)舒張功能檢測(cè)

將H2O2(5×10-4mol/L)加入到K-H液中，以復(fù)制胸主動(dòng)脈環(huán)過氧化損傷，即將H2O2加入到浴槽中，孵育30 min后加入PE(10-6mol/L)，以激發(fā)血管環(huán)收縮；當(dāng)收縮達(dá)到峰值后，累積加入ACh(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)，以檢測(cè)各組血管環(huán)對(duì)ACh的舒張反應(yīng).血管的舒張性能以加入ACh后的血管張力幅度與PE誘發(fā)的最大收縮幅度的比值反映.

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 阿托伐他汀對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞TRPM2蛋白表達(dá)和通道開放的影響

經(jīng)阿托伐他汀預(yù)孵育MAEC 7天后的Western blot結(jié)果顯示，TRPM2蛋白表達(dá)水平顯著降低，蛋白相對(duì)豐度下降約26%，提示阿托伐他汀對(duì)TRPM2蛋白表達(dá)有抑制作用.由細(xì)胞內(nèi)鈣熒光試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：對(duì)WT組MAEC，由H2O2引起的細(xì)胞內(nèi)鈣濃度明顯升高，經(jīng)阿托伐他汀預(yù)孵育7天，可抑制由H2O2引起的鈣內(nèi)流；對(duì)TRPM2-/-組MAEC，由H2O2引起的細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高幅度顯著低于WT組，且阿托伐他汀對(duì)鈣內(nèi)流的抑制作用消失，見圖1；對(duì)WT組MAEC，經(jīng)阿托伐他汀急性預(yù)處理30 min，可抑制由H2O2引起的細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高.這些結(jié)果提示，阿托伐他汀可通過抑制TRPM2通道的表達(dá)和功能來抑制氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高，見圖2.

注：Con為對(duì)照組，Ator為阿托伐他汀組，為數(shù)據(jù)，“*”為P<0.05 vs. Con,n=8. 圖1 阿托伐他汀對(duì)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞TRPM2蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effect of atorvastatin on TRPM2 expression in mouse aortic endothelial cells

注：(a)和(b)為阿托伐他汀預(yù)處理7天，(c)和(d)為阿托伐他汀預(yù)處理30 min，Con為對(duì)照組，Ator為阿托伐他汀組，WT為 野生型，TRPM2-/-為TRPM2基因敲除，為數(shù)據(jù)，“*”為P<0.05, “**”為P<0.01 vs. WT-Con,n=6. 圖2 阿托伐他汀對(duì)H2O2誘導(dǎo)的小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)鈣升高的影響Fig.2 Effect of atorvastatin on H2O2-induced [Ca2+]i rise in mouse aortic endothelial cells

2.2 阿托伐他汀對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響

阿托伐他汀對(duì)MAEC的存活率無明顯影響.以H2O2作為外源性氧化應(yīng)激源，復(fù)制內(nèi)皮細(xì)胞過氧化損傷模型，結(jié)果顯示：暴露在H2O2(5×10-6、5×10-5、5×10-4mol/L)中4 h，WT組MAEC存活率有不同程度的下降，5×10-4mol/L H2O2可以引起細(xì)胞存活率明顯降低(表1)；經(jīng)阿托伐他汀預(yù)孵育7天，可顯著抑制由H2O2引起的細(xì)胞死亡(表2).對(duì)TRPM2-/-組MAEC，由H2O2引起的細(xì)胞死亡較WT組顯著減少，而阿托伐他汀預(yù)處理組與H2O2損傷組的細(xì)胞存活率無顯著差異，提示阿托伐他汀可能會(huì)通過抑制 TRPM2 通道來減輕內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷.

表1 H2O2對(duì)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響(n=5)

表2 阿托伐他汀對(duì)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用(n=6)

2.3 阿托伐他汀對(duì)胸主動(dòng)脈環(huán)內(nèi)皮依賴性舒張功能的影響

將WT小鼠胸主動(dòng)脈環(huán)暴露于H2O230 min后，由ACh誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)減弱，而經(jīng)阿托伐他汀灌胃14天，可使由H2O2損傷后的胸主動(dòng)脈環(huán)舒張反應(yīng)有顯著改善，血管舒張幅度高于單獨(dú)H2O2損傷組，但仍低于對(duì)照組(圖3(a)，表3).對(duì)TRPM2-/-小鼠胸主動(dòng)脈環(huán)，H2O2暴露引起ACh誘導(dǎo)的胸主動(dòng)脈環(huán)舒張反應(yīng)減弱，但較WT小鼠明顯減輕，而經(jīng)阿托伐他汀預(yù)灌胃對(duì)由H2O2引起的血管舒張功能損傷無顯著影響(圖3(b)，表3)，提示阿托伐他汀對(duì)血管功能的保護(hù)作用與TRPM2通道有關(guān).

注：Control為對(duì)照組，Ator為阿托伐他汀組，WT為野生型，TRPM2-/-為TRPM2基因敲除， 為數(shù)據(jù)，“*”P<0.05,“**”為P<0.01 vs.Control,“##”為P<0.01 vs. H2O2,n=8. 圖3 阿托伐他汀對(duì)小鼠胸主動(dòng)脈環(huán)舒張功能的保護(hù)作用Fig.3 Protective effect of atorvastatin on the vasodilation of mouse thoracic aortic rings

表3 乙酰膽堿誘導(dǎo)的最大血管舒張效應(yīng)(n=8)

3 討 論

由氧化應(yīng)激(ROS的過量產(chǎn)生)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能紊亂，在心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展中具有較大的影響作用，是動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等多種心腦血管疾病的共同病理基礎(chǔ)[1-2].血管內(nèi)皮細(xì)胞可分泌多種血管活性物質(zhì)，包括一氧化氮(NO)、前列環(huán)素(PGI2)和內(nèi)皮源性超極化因子(EDHF)，以調(diào)節(jié)血管的收縮.在高血脂、炎癥等損傷性因素刺激下，血管組織內(nèi)的ROS大量產(chǎn)生，從而損傷了血管內(nèi)皮細(xì)胞，使得NO、PGI2和EDHF分泌減少，最終導(dǎo)致血管舒張障礙[11].而血管內(nèi)皮受損可進(jìn)一步引發(fā)炎性反應(yīng)，引起血小板聚集、炎癥細(xì)胞趨附，以及中膜平滑肌細(xì)胞的遷移和大量增殖，從而導(dǎo)致血管壁增厚、硬化[7,12-13].本研究以H2O2為外源性氧化應(yīng)激源，觀察到H2O2暴露可使MAEC存活率下降，并使小鼠胸主動(dòng)脈環(huán)的內(nèi)皮依賴性舒張功能減弱.

他汀類藥物是目前臨床治療高膽固醇血癥的首選藥物，能抑制HMG-CoA還原酶，減少甲羥戊酸的生成，從而對(duì)減少膽固醇的合成發(fā)揮降脂作用.研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物尚有許多非調(diào)脂效應(yīng)，如抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移、對(duì)抗血管氧化應(yīng)激損傷、改善血管功能和降低血壓，且這些作用在血漿膽固醇水平降低之前即出現(xiàn)，并獨(dú)立于其調(diào)脂作用[3-5].但其具體的作用靶點(diǎn)及細(xì)胞分子機(jī)制尚未完全闡明.本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)阿托伐他汀預(yù)處理，可使小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞TRPM2蛋白表達(dá)減少，并抑制由H2O2誘導(dǎo)的TRPM2通道開放介導(dǎo)的鈣內(nèi)流，提示阿托伐他汀能抑制TRPM2通道.由此猜測(cè)，TRPM2可能是介導(dǎo)阿托伐他汀抗氧化效應(yīng)的一個(gè)機(jī)制.

Ca2+作為重要的第二信使，在血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中起著關(guān)鍵作用.TRP通道是一類主要位于細(xì)胞膜上的非選擇性陽離子通道，參與細(xì)胞的Ca2+內(nèi)流.研究發(fā)現(xiàn)，TRP通道是細(xì)胞內(nèi)外多種理化刺激的感受器，廣泛參與細(xì)胞的多種生理活動(dòng)[6].在血管系統(tǒng)中，TRP通道在調(diào)節(jié)血管張力、血管通透性、血管細(xì)胞的生長和凋亡中起著重要作用[14].目前發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物的TRP蛋白分為TRPC、TRPM、TRPV、TRPA、TRPP和TRPML 6個(gè)亞家族.TRPM2是亞家族TRPM的成員.一般認(rèn)為，TRPM2通道為同源四聚體，可被ROS和ADP核糖激活，是ROS的主要細(xì)胞效應(yīng)器[7].TRPM2在血管內(nèi)皮細(xì)胞中有較高的表達(dá).TRPM2通道可介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)H2O2的鈣超載反應(yīng)，并參與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，下調(diào)內(nèi)源性TRPM2可減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷[9].進(jìn)一步研究顯示，敲除TRPM2基因，能顯著減輕由H2O2引起的MAEC死亡(表2)和小鼠胸主動(dòng)脈環(huán)舒張功能損傷.因此，TRPM2在血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激損傷中起著關(guān)鍵作用.

研究結(jié)果顯示：經(jīng)阿托伐他汀預(yù)處理7天，能使MAEC的TRPM2表達(dá)減少，并能抑制由H2O2引起的鈣內(nèi)流；經(jīng)阿托伐他汀急性預(yù)處理30 min，可抑制由H2O2引起的鈣內(nèi)流，從而提示阿托伐他汀能抑制TRPM2的表達(dá)及通道功能；經(jīng)阿托伐他汀預(yù)處理，可抑制由H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞死亡，減輕由H2O2暴露引起的胸主動(dòng)脈環(huán)內(nèi)皮依賴性舒張功能損傷；對(duì)TRPM2-/-組MAEC，阿托伐他汀對(duì)由H2O2引起的細(xì)胞鈣內(nèi)流和細(xì)胞死亡無抑制作用，對(duì)血管舒張功能也無改善作用.由此說明，TRPM2是阿托伐他汀對(duì)抗內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)和發(fā)揮血管保護(hù)作用的重要靶點(diǎn).

本研究揭示了阿托伐他汀可通過抑制TRPM2通道的表達(dá)和開放來減輕血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激損傷.TRPM2通道參與了他汀類對(duì)血管的非調(diào)脂效應(yīng)，是他汀類發(fā)揮抗氧化作用和改善血管內(nèi)皮功能的作用靶點(diǎn).