黃 瑤，李紅銳，李育曉，孫靜賢，熊 勇，邵金良，黃相中，田 凱

(1.云南民族大學 民族藥資源化學國家民族事務委員會-教育部重點實驗室，云南 昆明 650504；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(昆明)，云南 昆明 650223)

鱗毛蕨屬(DryopterisAdanson)植物在我國分布廣泛并多達300余種，其中已有20余種被列為藥用植物[1-2].有關鱗毛蕨屬植物的藥理活性研究表明，該屬中多種植物具有良好的驅(qū)蟲[3]、抑菌[4]、抗炎[5]、抗腫瘤[6]、抗氧化以及抗病毒等活性[7].

重齒鱗毛蕨(Dryopterisjuxtaposita)與假邊果鱗毛蕨(Dryopteriscaroli-hopei)具有相似的生長環(huán)境，生長于海拔 1 500-2 500 m 的山谷或溪邊林下，在云南、四川、西藏南部等地均有分布.經(jīng)文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)，關于重齒鱗毛蕨和假邊果鱗毛蕨的化學成分和藥理活性的研究較少，楊申明等[8]采用75%乙醇按料液比(m/v,1∶12)回流提取 3 h 得到重齒鱗毛蕨的粗提物并通過分光光度法測得黃酮類化合物提取率可達1.05%.由于黃酮類化合物是普遍存在于蕨類植物中的一類化學成分，不同種蕨類植物的總黃酮含量各有不同，且總黃酮成分復雜不同植物之間化學成分的結構也會存在差異，進而導致各植物的藥理活性也將存在差異[9].重齒鱗毛蕨和假邊果鱗毛蕨在云南地區(qū)資源豐富，為了更好地開發(fā)和利用這2種蕨類植物，文中采用95%的乙醇回流提取重齒鱗毛蕨和假邊果鱗毛蕨藥材獲得乙醇提取物，通過DPPH法、ABTS法、pNPG法以及脂多糖誘導RAW264.7巨噬細胞所建立的炎癥模型探究其抗氧化、降血糖和抗炎活性，為重齒鱗毛蕨和假邊果鱗毛蕨更深入的研究與利用提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗所用重齒鱗毛蕨(Dryopterisjuxtaposita)與假邊果鱗毛蕨(Dryopteriscaroli-hopei)均采自云南省新平縣，經(jīng)云南大學陸樹剛教授鑒定；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)(梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司)；2,2-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺)二氨鹽(ABTS)(梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司)；阿卡波糖(百靈威科技有限公司)；脂多糖(LPS)(Sigma公司)；α-葡萄糖苷酶(Sigma公司)；RAW264.7細胞系(中國科學院昆明動物研究所)；磷酸鹽緩沖液(PBS)(上海源培生物科技股份有限公司)；NO檢測試劑盒(碧云天生物技術公司)；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)(Sigma公司)；無水乙醇(天津市致遠化學試劑有限公司)；DMSO(天津市致遠化學試劑有限公司)；CY-500A型高速多功能粉粹機(上海塞耐機械有限公司)；多功能酶標儀(昆明友寧科技有限公司)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市富華儀器有限公司).

1.2 實驗方法

1.2.1 重齒鱗毛蕨和假邊果鱗毛蕨乙醇提取物的制備

重齒鱗毛蕨和假邊果鱗毛蕨的全草干燥后粉碎，分別稱取粗粉 20.0 g，用體積分數(shù)為95%乙醇回流提取3次，每次提取時間為 2 h，棄除濾渣并對濾液進行收集，通過減壓蒸餾分別得重齒鱗毛蕨乙醇提取物(DJE)和假邊果鱗毛蕨乙醇提取物(DCE).

1.2.2 清除DPPH自由基的活性

參照文獻[10]，分別將DJE和DCE用無水乙醇配制質(zhì)量濃度為：5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg/mL 的樣品待測液，取 2.0 mL 不同質(zhì)量濃度的DJE和DCE各待測溶液，加入 2.0 mL DPPH(0.2 mmol/L)溶液，將溶液充分搖勻后于室溫下進行避光反應，時間為 30 min，反應結束后立即用多功能酶標儀于 517 nm 處測定其吸光度值(A)，每組實驗分別設置3組平行實驗.陽性對照組(Vc)、樣品背景組和空白對照組采用同樣的實驗操作進行測定.

DPPH自由基清除率S(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100,

式中，吸光度A0為 2.0 mL 無水乙醇+2.0 mL DPPH溶液；吸光度A1為 2.0 mL 待測樣品+2.0 mL DPPH溶液；吸光度A2為 2.0 mL 待測樣品+2.0 mL 無水乙醇.

1.2.3 清除ABTS自由基的活性

參照文獻[11]的方法，精確稱取適量的DJE和DCE，按一定的梯度將其質(zhì)量濃度分別配制為5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg/mL，分別取DJE和DCE各待測液 0.2 mL 加入到含有 0.8 mL ABTS+工作液的試管，將其充分混勻后于室溫下進行反應，時間為 6 min，反應結束后立即用多功能酶標儀于 734 nm 處測定其吸光值(A).每組實驗分別設置3組平行實驗，以Vc為陽性對照.

ABTS自由基清除率S(%)=(A1-A2)/A1×100,

式中，吸光度A1為 0.2 mL 無水乙醇+0.8 mL ABTS工作液；吸光度A2為 0.2 mL 樣品+0.8 mL ABTS工作液.

1.2.4 抑制α-葡萄糖苷酶的活性

實驗方法參照文獻[12-14]并進行了一定的改動，各化合物采用96孔板對其進行活性測定.將待測的樣品用DMSO配制成終質(zhì)量濃度為：0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6、51.2 μg/mL 的樣品待測液，實驗中設置酶活性組、酶空白組、實驗組、實驗對照組，陽性對照為阿卡波糖.具體實驗反應體系如下表：

表1 待測樣品反應體系各組成的體積 μL

各組加入底物之前先將反應體系于 37 ℃ 進行恒溫孵育，時間為 5 min，加入底物后繼續(xù)將反應體系于相同溫度下孵育 15 min 后向各反應體系中加入終止液.實驗中各組分別設置3個復孔，各孔的總反應體積為 150 μL，其中總體積不足的組分采用PBS進行補足.采用多功能酶標儀于 400 nm 處測定吸光度值(A).

α-葡萄糖苷酶抑制率(%)=[1-(A實驗-A對照實驗)/(A酶活性-A酶空白)]×100.

1.2.5 體外抗炎活性的測定

1)DJE和DES對RAW264.7細胞毒活性測定

參照文獻[15]的方法，將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞加入胰蛋白酶進行消化，制成細胞懸液，并將細胞的密度調(diào)整為 1×105個/L，以 200 μL/每孔接種于96孔培養(yǎng)板中，在條件為 37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，時間為 24 h.培養(yǎng)結束后，分別將DJE和DES待測樣品(終質(zhì)量濃度為：6.25、12.50、25.00、50.00、100.00和 200.00 μg/mL 加入培養(yǎng)板中(50 μL/每孔)，每個樣品的各個濃度設置3個復孔.加樣結束后放回培養(yǎng)箱繼續(xù)進行培養(yǎng)，時間為 24 h，之后將濃度為 5 mg/mL 的MTT溶液分別加在各個孔中，體積為 20 μL，加樣結束后再繼續(xù)進行培養(yǎng)(4～6 h).取出96孔板，輕輕吸棄各孔上清液，再在每孔中加入DMSO溶液(150 μL)，在避光和室溫條件下進行振蕩，時間為 15 min，振蕩結束后立即用多功能酶標儀于波長 490 nm 處測定其吸光度值(A)，對細胞的存活率進行計算:

細胞存活率(%)=(A樣品/A空白)×100.

2)DJE和DES對LPS誘導的RAW264.7細胞NO分泌量的影響

參照文獻[16]的方法，前期細胞培養(yǎng)方法參見(1)，分別將實驗配制的DJE和DCE待測液(終質(zhì)量濃度為：6.25、12.50、25.00、50.00和 100.00 μg/mL)加入培養(yǎng)板中(50 μL/每孔)，每個樣品的各個濃度設置3個復孔.陽性對照組：加入L-NMMA(終質(zhì)量濃度為：12.50 μg/mL).除空白組其余各組均分別以 50 μL/每孔的量加入脂多糖(LPS)刺激細胞，LPS終質(zhì)量濃度為 2 μg/mL.加樣結束后細胞在培養(yǎng)箱中繼續(xù)進行培養(yǎng)，時間為 24 h，培養(yǎng)結束后分別取出各孔的上清液，并按照試劑盒的操作方法對其NO含量進行測定.

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 DPPH自由基清除活性的結果

DJE和DCE對DPPH自由基的清除結果如圖1所示，由實驗結果可知DJE和DCE在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(5.0～100.0 μg/mL)對DPPH自由基具有不同程度的清除活性，且二者活性均呈質(zhì)量濃度依賴性，可隨著質(zhì)量濃度的增加而不斷增強.DJE在5.0～80.0 μg/mL濃度內(nèi)的活性始終弱于陽性對照(Vc)，而當質(zhì)量濃度達80.0～100.0 μg/mL 時，其活性與陽性對照組(Vc)相當.實驗結果顯示：DJE IC50值為(15.21±1.19)μg/mL清除DPPH自由基的活性強于相同濃度下的DCE IC50值為(74.29±2.03)μg/mL.

圖1 DJE和DCE對DPPH自由基的清除活性 圖2 DJE和DCE對ABTS自由基的清除活性

2.2 ABTS自由基清除活性的結果

DJE和DCE對ABTS自由基的清除結果如圖2所示，由結果可知DJE和DCE在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(5.0～100.0 μg/mL)對ABTS自由基的清除活性呈濃度依賴性，可隨著質(zhì)量濃度的增加而不斷增強；當質(zhì)量濃度達到 100.0 μg/mL 的時候，DJE和DCE對ABTS自由基所具有的清除率是83.7%和56.37%.在實驗設定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(5.0～100.0 g/mL)陽性對照Vc對ABTS自由基的清除活性始終強于DJE和DCE，其中DJE和DCE的IC50值分別可達(25.60±2.13)μg/mL和(53.69±1.85)μg/mL.實驗結果顯示：在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)DJE和DCE對ABTS自由基均顯示出良好的清除活性，其中DCE對ABTS自由基的清除活性明顯弱于DJE.

2.3 體外抑制α-葡萄糖苷酶活性的結果

一分子pNPG經(jīng)α-葡萄糖苷酶催化后可分解為一分子對硝基酚和一分子葡萄糖，對硝基酚在 400 nm 出現(xiàn)特征吸收峰，且pNPG和葡萄糖在該波長下吸收很弱可忽略，因此采用pNPG法測定反應體系在 400 nm 處的吸光值可用于評價待測樣品對α-葡萄糖苷酶抑制能力的強弱[16].DJE和DCE兩者的體外降血糖活性可根據(jù)其對α-葡萄糖苷酶的抑制活性而進行評價，其結果如表2所示.當質(zhì)量濃度為(0.8～51.2)μg/mL時，待測樣品DJE和DCE對α-葡萄糖苷酶具有良好的抑制作用，二者的IC50值分別可達(1.04±0.27)μg/mL和(5.73±1.18)μg/mL.與陽性對照Acarbose相比，重齒鱗毛蕨和假邊果鱗毛蕨粗提物在均較低的濃度就對α-葡萄糖苷酶顯示出明顯的抑制作用.

表1 DJE和DCE對α-葡萄糖苷酶的體外抑制活性

2.4 體外抗炎活性的測定

2.4.1 DJE和DCE對RAW264.7細胞增殖的影響

DJE和DCE對RAW264.7細胞增殖的影響結果如圖3所示，由實驗結果可知，DJE和DCE在濃度為6.25～12.50 μg/mL 時對RAW264.7細胞的正常生長與繁殖沒有顯著的影響.隨著兩者質(zhì)量濃度的不斷增加，細胞的存活率呈現(xiàn)出降低的趨勢，尤其是當DJE質(zhì)量濃度為 200.00 μg/mL 時，RAW264.7細胞的存活率低于50%.

圖3 DJE和DCE對RAW264.7細胞存活率的影響 圖4 不同質(zhì)量濃度的DJE和DCE對LPS刺激的RAW264.7細胞NO分泌量的影響

2.4.2 DJE和DCE對LPS誘導的RAW264.7細胞NO分泌量的影響

通過脂多糖誘導的小鼠巨噬細胞RAW264.7炎癥模型探究DJE和DCE的抗炎活性，實驗結果見圖4,與空白組相比，###表示p<0.001；與模型組相比，***、**和*分別表示p<0.001、p<0.01和p<0.05.與空白組相比，模型組RAW264.7細胞經(jīng)LPS誘導后分泌出大量NO(p<0.01)，表明細胞模型建立成功.實驗組經(jīng)不同濃度的DJE和DCE待測樣品干預后，NO的釋放量均有不同程度的降低.綜合考慮DJE和DCE對RAW264.7細胞增殖影響，在不影響細胞正常增殖的情況下，即DJE樣品質(zhì)量濃度為6.25～12.50 μg/mL 時以及DCE樣品質(zhì)量濃度為6.25～50.00 μg/mL 時，2種植物的乙醇提取物均能不同程度抑制炎癥細胞釋放NO，具有潛在的抗炎活性.

3 結語

DJE和DCE均有清除DPPH和ABTS自由基的活性且有濃度依賴性，2種抗氧化活性評價方法均顯示DJE的抗氧化活性強于DCE，尤其是當DJE濃度為80.0～100.0 μg/mL 時，其活性與陽性對照(Vc)相當.DJE和DCE均能不同程度地抑制α-葡萄糖苷酶的活性，IC50值分別為(1.04±0.27)μg/mL 和(5.73±1.18)μg/mL.當待測樣品濃度為6.25～12.50 μg/mL 時，DJE和DCE對RAW264.7細胞的正常生長與繁殖沒有顯著的影響，然而隨著兩者濃度的增大，細胞存活率逐漸減小.在抗炎活性測試中，實驗組經(jīng)不同質(zhì)量濃度的DJE和DCE待測樣品干預后，NO的釋放量均有不同程度的降低，在不影響細胞正常增殖的情況下，DJE樣品濃度為6.2～12.50 μg/mL 時以及DCE樣品質(zhì)量濃度為6.25～50.00 μg/mL 時，2種植物的乙醇提取物均能不同程度抑制炎癥細胞釋放NO，具有潛在的抗炎活性.綜上所述，DJE和DCE均具有良好的抗氧化、降血糖以及抗炎活性，但蕨類植物的化學成分復雜，具體的功效成分尚不明確，本實驗研究為今后更深入地研究重齒鱗毛蕨和假邊果鱗毛蕨的有效成分和作用機制提供了實驗依據(jù).