葉建州，李元策，尹力玄，尹俊林

(1.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 皮膚病?？漆t(yī)院，云南 昆明 500021；2.云南民族大學(xué) 民族醫(yī)藥學(xué)院 民族藥資源化學(xué)國家民委-教育部重點實驗室，云南 昆明 650500)

銀屑病(psoriasis)是一種具有遺傳傾向免疫介導(dǎo)的炎癥性皮膚病[1].不同人種發(fā)病率差異較大，在全球范圍內(nèi)發(fā)病率為2%～3%，我國的發(fā)病率為0.13%～1.23%,近年來我國銀屑病發(fā)病率在逐年升高[2].銀屑病主要病理表現(xiàn)為表皮角質(zhì)化過度及角化不全、角化不全區(qū)可見Munro微膿腫.顆粒層明顯減少或消失，棘層肥厚，表皮突向下延伸，真皮乳頭上方棘層變薄，毛細血管擴張，延伸并迂曲，周圍可見淋巴細胞、中性粒細胞等浸潤[3].臨床上將銀屑病分為四類：尋常型銀屑病、關(guān)節(jié)病型銀屑病、膿胞型銀屑病及紅皮病型銀屑病[4].其中尋常銀屑病占其中的90%[5],同時，銀屑病患者并發(fā)癥如糖尿病、肥胖癥、心血管疾病及高膽固醇的幾率也顯著增高[6].臨床上常用的外用治療銀屑病的藥物有維生素D3類似物卡泊三醇、糖皮質(zhì)激素、阿維A等，其中卡泊三醇刺激較大且價格較高，糖皮質(zhì)激素長期使用導(dǎo)致局部皮萎縮、阿維A乳膏長期涂抹會導(dǎo)致皮膚干燥[7]，因此目前市面上仍沒有較為理想的治療銀屑病的藥物.

目前對于銀屑病的發(fā)病機理尚不明確，但目前的研究表明銀屑病發(fā)病與自身免疫有著密切關(guān)系.對于銀屑病發(fā)病機制的研究，最早的時候研究發(fā)現(xiàn)銀屑病患者體內(nèi)的interferon(IFN-γ)、tumor necrosis factorα(TNF-α)、interleukin 2(IL-2)、IL-1、IL-12等T helper-1(Th1)型細胞因子高表達，所以這些細胞因子一度被認為是銀屑病發(fā)病的關(guān)鍵因素[8].其中特別是IFN-γ，其能夠上調(diào)趨化因子和粘附分子[9]，將淋巴細胞集中到炎癥部位并刺激樹突狀細胞產(chǎn)生IL-1和IL-23，這2種炎癥因子與銀屑病嚴重程度明顯相關(guān)[10].外源刺激可以影響CD4+中Th1和Th2的比例，其中銀屑病患者中炎癥性Th1細胞顯著增加，Th2細胞數(shù)量相對減少[11].

近年來從T細胞中發(fā)現(xiàn)了新的Th17類型，其通過分泌IL-17和IL-22等細胞因子，作用于上皮部分的CD11c+樹突狀細胞(DCs)[12]，進而能夠刺激其分泌各種細胞因子，刺激角質(zhì)形成細胞KC過度增殖.隨后又發(fā)現(xiàn)Th17/Treg比例的改變可以刺激樹突狀細胞分泌細胞因子，造成角質(zhì)細胞過度增殖，單核細胞浸潤等癥狀.

最近對于銀屑病發(fā)病機制的研究集中在IL-23/Th17作用軸上，其作用機制首先是真皮中DCs細胞產(chǎn)生IL-23活化Th17細胞，并使其產(chǎn)生并釋放Th17類的細胞因子，如IL-17A、IL-17F、IL-22等促炎性的細胞因子，這些細胞因子作用于角質(zhì)形成細胞KC上，使KC細胞產(chǎn)生抗菌肽、趨化因子以及多種細胞因子，進一步維持和加重銀屑病的癥狀[13].在這個過程中KCs與免疫細胞相互作用，互相刺激形成了正向循環(huán).

黃金萬紅膏是云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制備的一種用于治療皮膚病的醫(yī)院中藥制劑，應(yīng)用于臨床數(shù)十年[14]，由紫草、地黃、黃連、當歸、虎杖、冰片等制成.具有清熱解毒、祛腐生肌的功效，用于燒傷、燙傷、嬰兒紅臀屬熱毒內(nèi)盛者.動物試驗表明黃金萬紅膏對豚鼠完整皮膚及破損皮膚均無刺激[15]，在臨床實際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)對多種皮膚病具有良好的治療效果，在近30年的臨床治療對銀屑病有較顯著的療效.

為探索黃金萬紅膏在小鼠實驗中對銀屑病的療效機制，本文利用IMQ誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型，對黃金萬紅膏治療銀屑病的藥效學(xué)進行研究.為進一步深入探索萬紅膏的功效提供理論基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

體重18～22 g，Babl/c小鼠，周齡為6～8周，雌雄各半(湖南斯萊克景達實驗動物有限公司).

1.1.2 試劑及儀器

黃金萬紅膏(云南省中醫(yī)醫(yī)院);脫毛膏(廣州夢希藍化妝品有限公司)；凡士林乳膏(山東德新康醫(yī)療科技有限公司)；咪喹莫特乳膏(四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司);卡泊三醇乳膏(利奧制藥有限公司，愛爾蘭)；IL-17、IL-22、TNF-α ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)；DMIL LED三目倒置顯微鏡(Leica，德國)；SpectraMax i3x酶標儀(Molecular Devices，美國).

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立

將60只18～22 g，6～8周，雌雄各半Babl/c小鼠分為空白對照組10只，模型組50只.在小鼠背部用脫毛膏脫毛形成 2 cm×3 cm 的造模區(qū)域，觀察兩日無新毛長出后，模型組每只每日均勻涂抹5%咪喹莫特乳膏 62.5 mg 于背部造模區(qū)域，空白對照組每天涂抹等量凡士林連續(xù)涂抹6日.造模完成后觀察是否有云母狀鱗屑、紅斑及角質(zhì)增厚等癥狀.

1.2.2 銀屑病模型動物的治療

造模成功后將50只模型組小鼠分為萬紅膏高劑量組(200 mg/d)、萬紅膏中劑量組(100 mg/d)、萬紅膏低劑量組(50 mg/d)、卡泊三醇組(200 mg/d)、咪喹莫特組，每組10只.萬紅膏高劑量組每只每天涂抹 200 mg 萬紅膏、中劑量組每天涂抹 200 mg(質(zhì)量比，凡士林∶萬紅膏=1∶1)混合制劑、低劑量組每天涂抹 200 mg(質(zhì)量比，凡士林∶萬紅膏=3∶1)混合制劑、卡泊三醇組每天涂抹 200 mg 5%卡泊三醇乳膏、咪喹莫特組每天涂抹 200 mg 凡士林，除此之外，各模型組每天繼續(xù)涂抹 62.5 mg 5%咪喹莫特乳膏維持銀屑病癥狀.空白對照組每只每天共涂抹 262.5 mg 凡士林.治療結(jié)束后觀察各組小鼠的背部造模區(qū)域的銀屑病癥狀，觀察各組間的表觀差異.初步簡單判斷給藥組是否對小鼠銀屑病有治療效果.

1.2.3 小鼠體重測量

在小鼠治療過程中每天對各組小鼠體重進行測量并記錄，取每組平均值，繪制成折線圖，并利用數(shù)據(jù)分析軟件對各組數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析.

1.2.4 PASI評分

在銀屑病小鼠治療過程中，觀察其小鼠銀屑病癥狀，并根據(jù)小鼠PASI評分標準進行打分.PASI評分主要分為鱗屑、紅斑和角質(zhì)增厚3部分，每個部分從無到全覆蓋為0～4分(表1).取每組的平均值，繪制成折線圖，觀察各治療組于模型組之間的差異，進行差異顯著性分析.

表1 銀屑病PASI評分標準

1.2.5 小鼠銀屑病組織病理學(xué)觀察

于治療 6 d 后取小鼠背部造模區(qū)域皮膚組織，浸泡于福爾馬林中 24 h,置于包埋盒內(nèi)自來水沖洗 1 h.分別浸泡于75 %、85 %、95 %、100 %乙醇、二甲苯中脫水 1 h，共 5 h.石蠟浸泡3次，每次 40 min，共 2 h.包埋后，放到冰上靜置.將包裹好的蠟塊切成 4 nm 蠟片，平鋪于載玻片上，蘇木素浸染 5 min.沖洗2次，0.5 %鹽酸酒精分化 3 s.沖洗2次，伊紅染色 2 min.沖洗1次，蒸餾水漂洗2次，每次 30 s.接著用85%、95%乙醇分別泡 2 min，100 %乙醇泡2次，每次 2 min，二甲苯浸泡2次，每次 5 min.吹干，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察.

1.2.6 q-PCR檢測小鼠背部造模組織IL-17A、IL-17F、IL-23 mRNA表達量

將組織液氮低溫粉碎后加入RNAios Plus(TaKaRa，9109)，室溫靜置 5 min.移入 1.5 mL 離心管，吹勻后加入 100 μL 氯仿，混勻靜止 10 min.4 ℃，12 000 r/min 離心 10 min，棄上清.加入 200 μL 異丙醇，冰上靜止 10 min，離心.加入 500 μL 75 %乙醇.離心 10 min 去上清.按HIScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR(Vazyme，R323-01)試劑盒步驟進行反轉(zhuǎn)，去除gDNA、反轉(zhuǎn)錄為cDNA，加入引物、DNA模板等在定量PCR儀上進行q-PCR檢測(見表2).

表2 q-PCR檢測引物序列

1.2.7 ELISA法檢測小鼠血清中IL-17A、TNF-α、IL-22的含量

實驗結(jié)束后，采用眼球取血法取走小鼠血液，靜置 30 min 后離心提取血清.分別將標準品和樣品加入ELISA試劑盒(聯(lián)科生物，EK222HS-96；EK282HS-96；EK217HS-96)的反應(yīng)孔中(100 μL/孔)，封板膠封孔，37 ℃ 孵育 90 min.洗板4次，加入生物素化抗體工作液.洗板4次，加入酶結(jié)合物工作液(100 μL/孔).洗板4次，加入顯色劑(100 μL/孔)，37 ℃ 孵育10～20 min.加入終止液(100 μL/孔)，混勻后即刻測量OD450值(5 min 內(nèi)).以標準品濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，用計算機軟件進行回歸擬合生成標準曲線.將測得的樣品OD值帶入到標準曲線中算出樣品濃度.

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準誤差表示，用 SPSS 17.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析.采用student t檢驗對各治療組與IMQ組進行差異顯著性檢測，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.

2 結(jié)果

2.1 小鼠體重變化結(jié)果

從小鼠的治療過程中體重變化結(jié)果顯示，雌鼠雄鼠變化差異一致，無明顯性別差異.空白對照組在第0、3、6天，小鼠體重分別為(23.22±1.04)g、(22.71±1.14)g、(23.48±1.18)g上升了1%，說明小鼠體重在治療過程中無明顯變化；黃金萬紅膏高劑量組在第0、3、6天，小鼠體重分別為(18.79±1.10)g、(19.39±1.07)g、(19.5±1.33)g上升了3.7%，說明小鼠體重在治療過程中無明顯變化；黃金萬紅膏中劑量組在第0、3、6天，小鼠體重分別為(17.86±0.94)g、(18.6±0.89)g、(18.00±0.89)g，上升了0.7%，說明小鼠體重在治療過程中無明顯變化；黃金萬紅膏低劑量組在第0、3、6天，小鼠體重分別為(18.98±0.76)g、(18.86±0.86)g、(17.67±1.43)g，下降了6%，說明小鼠體重在治療過程中無明顯變化；卡泊三醇組組在第0、3、6天，小鼠體重分別為(19.61±1.24)g、(18.83±1.12)g、(16.54±0.97)g，說明小鼠體中在治療過程中從第3天開始出現(xiàn)明顯下降，共降低15.6%.以上實驗結(jié)果說明卡泊三醇對小鼠體重具有降低作用，黃金萬紅膏對小鼠體重?zé)o明顯影響.見圖1A圖，圖1所有數(shù)據(jù)來源于10次獨立實驗,所得數(shù)據(jù)以均mean±SE表示,各組與卡泊三醇組進行T檢驗,*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001.

2.2 小鼠表觀癥狀及PASI評分結(jié)果

小鼠表觀癥狀PASI評分結(jié)果顯示：黃金萬紅膏高劑量組在第0、3、6天PASI評分分別為10.66±0.21、2.16±0.16、1.16±0.40；黃金萬紅膏中劑量組在第0、3、6天PASI評分分別為10.83±0.16、3.66±0.21、2±0.25；萬紅膏低劑量組在第0、3、6天PASI評分分別為10.83±0.16、4.66±0.49、3±0.516；卡泊三醇組組在第0、3、6天PASI評分分別為10.83±0.16、3.66±0.49、2.16±0.40；模型對照組在第0、3、6天PASI評分分別為10.66±0.21、6.83±0.47、5.66±0.33；萬紅膏各劑量組與模型對照組相比評分明顯降低.黃金萬紅膏高劑量組與IMQ組相比角質(zhì)增厚明顯降低，鱗屑 明顯減少，紅斑變少(見圖1B).總體來看，黃金萬紅膏高劑量組于IMQ組之間存在顯著性差異，表明黃金萬紅膏對銀屑病的癥狀有明顯的治療效果.

圖1 治療過程中小鼠體重變化(A)及小鼠PASI評分(B)

2.3 HE染色切片觀察病理學(xué)變化結(jié)果

從圖2A中可以看出相較于模型對照組IMQ組各治療組鱗屑,A圖紅斑明顯減少證明萬紅膏對小鼠銀屑病模型具有一定的治療效果.從病理切片HE染色的結(jié)果來看，黃金萬紅膏高、中、低3個劑量組的角化不全及角化過度相較于IMQ組有明顯的減輕(圖2B,藍色箭頭).黃金黃金萬紅膏高劑量組相對于IMQ組,棘層明顯變薄，細胞層是明顯減少；萬紅膏中劑量組相對于高劑量組，棘層變厚，但相對于IMQ組明顯變薄；黃金萬紅膏低劑量組相對于IMQ組，棘層無明顯變薄(圖2B, 紅色箭頭).上述結(jié)果表明黃金萬紅膏能夠減少銀屑病導(dǎo)致的角化不全及角化過度的現(xiàn)象，同時能夠降低棘層厚度.

圖2 為治療結(jié)束后各組小鼠中具有代表性的圖片(A)及H&E染色圖(B)

2.4 q-PCR檢測小鼠背部組織IL-17A、IL-17F、IL-23的mRNA的變化結(jié)果

小鼠背部組織IL-17A、IL-17F、IL-23的mRNA的變化結(jié)果顯示，黃金萬紅膏高劑量組IL-17F mRNA相對含量為0.191±0.005，中劑量組為0.320±0.052，低劑量組為0.43±0.005，卡泊三醇組為0.015±0.005.黃金萬紅膏各治療組相對于IMQ組有明顯的降低，從高到低分別降低了0.809、0.68、0.57.同時隨著給藥量的增加IL-17F mRNA相對含量逐漸降低.黃金萬紅膏高劑量組的IL-23 mRNA相對含量為0.186±0.021，中劑量組為0.450±0.057，低劑量組為0.611±0.093，卡泊三醇組為0.015±0.005，萬紅膏各治療組相對于IMQ組有明顯的降低，從高到低分別降低了0.814、0.55、0.389，同時隨著給藥量的增加IL-23 mRNA相對含量逐漸降低.黃金萬紅膏高劑量組的IL-17A mRNA相對含量為0.325±0.055，中劑量組為0.66±0.060，低劑量組為1.245±0.175，卡泊三醇組為0.015±0.005，其中黃金萬紅膏高劑量組與中劑量組的IL-17A的mRNA的表達量相對于IMQ組顯著降低，高劑量組降低了0.675，中劑量組降低了0.34，萬紅膏低劑量組略有上升.總之，黃金萬紅膏能夠降低銀屑病相關(guān)的炎癥因子IL-17A、IL-23、IL-17F 的mRNA的表達(圖3A).

2.5 ELISA小鼠血清中IL-17A、TNF-α、IL-22的含量結(jié)果

小鼠血清中IL-17A、TNF-α、IL-22的含量的檢測結(jié)果顯示，IMQ組中TNF-α含量為(447.94±89.86)pg/mL，黃金萬紅膏高劑量組含量為(50.10±2.56)pg/mL，中劑量組含量為(110.84±5.89)pg/mL，低劑量組含量為(113.52±20.44)pg/mL，卡泊三醇組含量為(97.19±14.09)pg/mL.黃金萬紅膏高劑量組中TNF-α的含量降低了 397.84 pg/mL,下降幅度為88.81%.IMQ組中IL-22的含量為(53.01±0.537)pg/mL，萬紅膏高劑量組的含量為(33.07±7.153)pg/mL，黃金萬紅膏中劑量組的含量為(47.97±8.742)pg/mL，萬紅膏低劑量組的含量為(48.03±1.773)pg/mL，卡泊三醇組的含量為(39.28±6.063)pg/mL，其中萬紅膏高劑量組中IL-22的含量下降了19.94 IL-22的含量pg/mL,下降幅度為37.6%.IMQ組中IL-17A的含量為(57.13±1.737)pg/mL，萬紅膏高劑量組的含量為(11.65±1.076)pg/mL，萬紅膏中劑量組的含量為(14.17±2.612)pg/mL，萬紅膏低劑量組的含量為(16.10±3.606)pg/mL，卡泊三醇組的含量為(4.31±0.592)pg/mL，其中萬紅膏高劑量組中IL-17A的含量降低了 45.48 pg/mL,下降幅度為79.6 %(圖3B).萬紅膏各劑量組中TNF-α及IL-17A的含量均顯著下降，萬紅膏高劑量組中IL-22的含量顯著下降，說明萬紅膏能夠降低血清中TNF-α、IL-17A及IL-22的含量.圖3所有數(shù)據(jù)來源于10次獨立實驗,所得數(shù)據(jù)以均mean±SE表示,各治療組與IMQ組對比進行t檢驗,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

圖3 各組小鼠qPCR檢測造模皮膚中相關(guān)細胞因子的mRNA表達量及ELISA檢測血清中相關(guān)細胞因子含量

3 結(jié)語

在治療過程中卡泊三醇組小鼠體重出現(xiàn)明顯下降是由于卡泊三醇具有明顯的刺激以及對腎臟的副作用[16]，黃金萬紅膏不同劑量治療組在治療過程中體重?zé)o明顯變化，說明黃金萬紅膏與常用的治療銀屑病的臨床藥物卡泊三醇相比，對小鼠的刺激明顯減輕，治療效果更為溫和.治療后，小鼠銀屑病鱗屑、角質(zhì)增厚、紅斑明顯減少，銀屑病相關(guān)的促炎因子IL-17A、IL-17F、IL-23的mRNA的表達量均下降，推測其可能是通過抑制Th17細胞的激活過程從而降低了IL-17A、IL-17F、IL-23的表達.經(jīng)黃金萬紅膏治療后，小鼠的TNF-α、IL-17A、IL-22的表達量均有下降，結(jié)果與mRNA檢測結(jié)果一致，顯示黃金萬紅膏能夠降低TNF-α、IL-17A、IL-22等銀屑病相關(guān)的炎癥因子的產(chǎn)生.上述的分子指標均為與IL-23/Th17軸相關(guān)的炎癥因子，據(jù)此推測黃金萬紅膏可能通過改變Th17的增殖分化來對銀屑病產(chǎn)生影響，該研究結(jié)果將為進一步研究萬紅膏治療銀屑病的機制研究提供新的思路及理論基礎(chǔ).