李佳歡， 希 娜， 漫 靜， 任 成， 鄧 波*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 北京 100193; 2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院， 沈陽(yáng) 遼寧 110866;3.內(nèi)蒙古大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院， 呼和浩特 內(nèi)蒙古 010021; 4.中國(guó)科學(xué)院植物研究所， 北京 100093)

苜蓿(MedicagosativaL.)是優(yōu)質(zhì)的豆科牧草，蛋白含量高，能與根瘤菌共生形成根瘤，將空氣中的氮?dú)廪D(zhuǎn)變?yōu)榭晒┳陨砝玫陌睉B(tài)氮[1]。根瘤菌接種能夠減少生產(chǎn)中氮肥施用量，緩解施氮引發(fā)的環(huán)境問(wèn)題，目前已廣泛應(yīng)用在豆科植物種植中[2]。然而，根瘤菌的田間接種效果往往不能達(dá)到預(yù)期[3]。影響根瘤菌接種效果的因素包括環(huán)境因素[4-6]、根瘤菌和宿主特性[7]、土著菌的競(jìng)爭(zhēng)[8]、接種技術(shù)[9]等。用來(lái)提高根瘤菌的接種效果的方法有很多，如增大接種量、從土著菌中篩選高效根瘤菌[10]、與其它促生菌雙接種[11-12]、添加外源根系分泌物誘導(dǎo)[13]等，增大接種量和改變接種方式可以顯著的增加根瘤菌在根系定殖率。

增大接種量是最早提出的，也是迄今為止最常見的提高接種效果的方法。研究表明為了使接種菌的田間占瘤率達(dá)到50%，根瘤菌的接種數(shù)量至少要達(dá)到土著菌的1 000倍[14]。然而，增大接種量的方法并不總是有效。在Bogino等的試驗(yàn)中，接種菌數(shù)量提高后，接種菌的田間占瘤率依然小于10%，這可能是因?yàn)楦档纳L(zhǎng)快，根瘤菌的移動(dòng)性較弱，接種菌在根系生長(zhǎng)后期根尖根際定殖量少，根瘤菌不能到達(dá)結(jié)瘤敏感區(qū)，結(jié)瘤數(shù)降低[15-16]。

通過(guò)溝施的方式接種根瘤菌，能有效增大根瘤菌的分布范圍，提高接種菌在田間的競(jìng)爭(zhēng)能力。在溝施的接種方式下，接種菌的接種數(shù)量與土著菌的比例由1∶1提高到999∶1時(shí)，接種菌的田間占瘤率由4%提高到60%[17]。溝施的方法接種根瘤菌還能防止根瘤菌受包衣劑中殺菌劑的傷害[9,18]。值得注意的是，利用溝施的方法接種根瘤菌時(shí)，由于接種菌的分散性與較低的存活率，在根系生長(zhǎng)早期(主根)的結(jié)瘤數(shù)可能偏低。相反的，利用種子包衣的方法接種根瘤菌時(shí)，接種菌聚集在種子周圍，在根系生長(zhǎng)早期有較大的根瘤菌定殖率，較淺的主根部分結(jié)瘤數(shù)較高，但由于根瘤菌的弱移動(dòng)性，深根和側(cè)根的結(jié)瘤數(shù)可能較低。采用種子包衣和溝施的方法接種根瘤菌時(shí)，根瘤在根系上的分布可能存在一定差異。根系的不同部位具有不同的資源吸收特征[19]，這種特性可能使不同部位根瘤的固氮能力存在差異，從而影響根瘤菌的接種效果。然而，鮮有關(guān)于接種方式的研究在說(shuō)明根瘤菌接種效果時(shí)，同時(shí)考慮結(jié)瘤數(shù)、根瘤分布和固氮酶活性差異三種因素。

本研究設(shè)置3個(gè)接種量與2種接種方式，將根系分為6部分，結(jié)合根瘤在根系的分布和固氮酶活性，在溫室條件下探究根瘤菌接種方式(種子包衣和溝施)及根瘤菌接種數(shù)量(103，105，107個(gè)·株-1)對(duì)苜蓿根瘤菌接種效果的影響，為提高苜蓿根瘤菌的接種效率提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試紫花苜蓿品種為‘中苜1號(hào)’，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所提供。為方便與基質(zhì)中根瘤菌或種子自帶內(nèi)生根瘤菌進(jìn)行區(qū)分，統(tǒng)計(jì)接種菌定殖量與結(jié)瘤數(shù)，供試根瘤菌株為綠色熒光蛋白基因標(biāo)記的Sm1021菌株(gfp-Sm1021)(抗400 mg·L-1硫酸鏈霉素(str)及80 mg·L-1壯觀霉素(spe)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)王濤教授實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，熒光標(biāo)記前后，Sm1021菌株的結(jié)瘤能力并未發(fā)生變化。

1.2 試驗(yàn)方法

培養(yǎng)基質(zhì)準(zhǔn)備：試驗(yàn)在花盆中進(jìn)行(底直徑4 cm，上直徑9 cm，高18 cm)。每盆中裝750 mL滅菌蛭石(高溫高壓，121℃,103 kPa,60 min，重復(fù)2次)，并用低氮營(yíng)養(yǎng)液[20]澆透。

根瘤菌接種液準(zhǔn)備：YEM液體培養(yǎng)基[20]，28℃，180 rmp震蕩培養(yǎng)根瘤菌40 h后(對(duì)數(shù)期)，取適量菌液離心，用無(wú)菌水洗滌2次，根據(jù)試驗(yàn)要求用無(wú)菌水將菌液調(diào)節(jié)至合適濃度。本試驗(yàn)預(yù)設(shè)接菌量約為103，105，107個(gè)·株-1左右(分別為C1，C2，C3)，經(jīng)平板計(jì)數(shù)法測(cè)定，最終菌液濃度為1.3×103個(gè)·株-1(C1)、1.9×105個(gè)·株-1(C2)、6×106個(gè)·株-1(C3)。

種子發(fā)芽：選取飽滿的‘中苜1號(hào)’種子，75%乙醇浸泡5 min后用無(wú)菌水沖洗。紙床培養(yǎng)發(fā)芽，光暗周期為16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，發(fā)芽溫度為光照時(shí)26℃，黑暗時(shí)20℃。

根瘤菌接種與植株培養(yǎng)：種子發(fā)芽4天后(根系長(zhǎng)2～3 cm)，選擇健壯的幼苗移栽至花盆中。移栽同時(shí)接種根瘤菌。以不接菌為對(duì)照組，其余管理手段一致。試驗(yàn)處理如表1所示。試驗(yàn)選用種子接種(Seed Inoculation,SI)(溫室試驗(yàn)中常用種子接種代替田間的種子包衣)和溝施接種(In-furrow Inoculation,FI)2種方式。種子接種辦法為：用低氮營(yíng)養(yǎng)液調(diào)節(jié)蛭石基質(zhì)含水量至田間持水量。準(zhǔn)備好發(fā)芽后的種子(根長(zhǎng)2 cm)，用移液槍移取20 μL接種液接種于植株根系。接種后迅速移栽至蛭石中，每盆2株。溝施接種方式為：移取20 μL接種液至低氮營(yíng)養(yǎng)液中(低氮營(yíng)養(yǎng)液體積與種子包衣處理中相同)，在種子根系滴加20 μL無(wú)菌水，迅速移栽至蛭石中，每盆2株。每個(gè)處理重復(fù)60盆。

表1 根瘤菌接種處理Table 1 Treatments of rhizobial inoculation

取樣及測(cè)定：(1)根長(zhǎng)和根瘤菌定殖量：按時(shí)間順序取樣，分別在接種后第5，8，10 d取根尖以上0～2 cm根系，每次取樣時(shí)每個(gè)處理分別取5盆(10株)，測(cè)定植株根長(zhǎng)和根尖根瘤菌定殖量。利用平板涂布法計(jì)接種根瘤菌在根尖的定殖數(shù),Sm1021在紫外光的照射下為綠色(圖1a)。(2)根瘤菌結(jié)瘤數(shù)：接種40 d后，每個(gè)處理分別取5盆植株(10株)，將根系分為0～4 cm主根、0～4 cm側(cè)根、4～8 cm主根、4～8 cm側(cè)根、8～12 cm主根、8～12 cm側(cè)根六部分，分別測(cè)定接種根瘤菌的結(jié)瘤數(shù)，將根瘤中的根瘤菌在平板上進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，在紫外光照射下呈綠光的即為接種菌侵染形成的根瘤，不發(fā)光則為內(nèi)生根瘤菌或其他根瘤菌形成的根瘤(圖1b)。(3)植株生物量與蛋白含量：接種40 d后，每個(gè)處理取10盆，收獲整株植株，測(cè)定植株地上、地下部分生物量及蛋白含量。(4)根瘤干重與固氮酶活性：根系不同部位根瘤干重和固氮酶活性的測(cè)定均取自FI-C3處理。取20～30個(gè)根瘤置于西林瓶中，70℃烘干48 h至恒重，用萬(wàn)分之一天平稱重后計(jì)算單個(gè)根瘤干重。取20～30個(gè)根瘤置于西林瓶中，采用乙炔還原法測(cè)定根瘤菌的固氮酶活性[21]。利用島津GC-2010氣相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，色譜柱為以三氧化二鋁做填充物的毛細(xì)柱，柱長(zhǎng)為30 m，直徑0.53 mm，膜厚10 μm。溫度設(shè)定：柱溫60℃，進(jìn)樣器溫度130℃，檢測(cè)溫度150℃。檢測(cè)器：氫火焰檢測(cè)器。

圖1 接種根瘤菌gfp-Sm1021定殖量及結(jié)瘤情況測(cè)定Fig.1 Determination of colonization and nodulation of inoculated Rhizobium gfp-Sm1021

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2010整理數(shù)據(jù)；采用SPSS 18.0 進(jìn)行方差分析，使用Duncan法進(jìn)行多重比較，使用SigmaPlot繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種方式與接種數(shù)量對(duì)根瘤菌在根尖定殖量的影響

如圖2所示，隨著主根的生長(zhǎng)，根尖距離根基的距離逐漸增大。種子接種的情況下，根瘤菌在根尖表面和根內(nèi)的定殖量隨著根系的伸長(zhǎng)迅速減少，根系生長(zhǎng)后期幾乎無(wú)根瘤菌在其根尖表面定殖，接種濃度越小，下降趨勢(shì)越明顯。溝施接種的情況下，根瘤菌在根系生長(zhǎng)早期的根尖定殖量少于種子包衣處理，但由于其分布均勻，隨著根系的伸長(zhǎng)，根尖表面根瘤菌的定殖數(shù)量并無(wú)下降趨勢(shì)，在根系生長(zhǎng)至8 cm時(shí)，定殖量基本與種子接種相接近。在根系生長(zhǎng)較長(zhǎng)時(shí)，溝施接種情況下，接種菌在根尖的定殖量超過(guò)種子接種。除圖2中展示的3個(gè)處理外，其它3個(gè)處理的根瘤菌定殖量過(guò)少，利用平板涂布法未能測(cè)出數(shù)值，但依然可以看出，無(wú)論何種接種方式，隨著接種量的增加，根瘤菌的定殖量是增加的，但對(duì)種子接種在根系生長(zhǎng)后期定殖量少的問(wèn)題緩解作用很小。

圖2 根瘤菌gfp-Sm1021在苜蓿根尖表面及根內(nèi)定殖量Fig.2 Viable population of gfp-Sm1021 colonized on root surface and in root

2.2 接種方式與接種數(shù)量對(duì)根瘤菌結(jié)瘤數(shù)的影響

增大接種量與接種范圍均顯著提高苜蓿總結(jié)瘤數(shù)(表2)。接種量由C1增加至C3時(shí)，在種子接種(SI)和溝施接種(FI)處理下，單株總結(jié)瘤數(shù)分別增加了54.66 %和75.30 %。C2與C3處理間植株結(jié)瘤數(shù)無(wú)顯著差異。接種量相同時(shí)，溝施接種時(shí)植株結(jié)瘤數(shù)顯著高于種子接種處理(P<0.001)。接種量為C1，C2，C3時(shí)，溝施接種處理中測(cè)得的根瘤數(shù)分別比種子接種多63.81%，70.54%和85.66%。種子包衣處理中，C2，C3和C1相比，增大接種量增加了0～4 cm主根、8～12 cm主根和8～12 cm側(cè)根結(jié)瘤數(shù)。溝施接種處理中，C2，C3和C1相比，增大接種量主要增加了0～4 cm主根、0～4 cm側(cè)根、4～8 cm側(cè)根、8～12 cm主根和8～12 cm側(cè)根結(jié)瘤數(shù)。與種子包衣相比，溝施接種增加了0～4 cm側(cè)根、4～8 cm主根、4～8 cm側(cè)根和8～12 cm側(cè)根結(jié)瘤數(shù)。

表2 根瘤菌gfp-Sm1021在苜蓿根系不同位置的結(jié)瘤數(shù)及根瘤菌接種方式和接種數(shù)量對(duì)結(jié)瘤數(shù)影響的方差分析Table 2 Nodule numbers of gfp-Sm1021 rhizobia in different positions of alfalfa root system and two-way analysis of variance (ANOVA) for the effects of inoculation method and inoculant population on nodule numbers

2.3 接種方式與接種數(shù)量對(duì)植株干重及蛋白質(zhì)含量的影響

根瘤菌接種量、接種方式及其交互作用均顯著影響苜蓿植株地上和地下生物量(圖3a)。與對(duì)照(未接菌處理)相比，接種根瘤菌后，苜蓿地上生物量顯著增加。利用種子包衣的方式進(jìn)行接種時(shí)，接種量越大，植株地上生物量越大，但C2與C3接種量處理間無(wú)顯著差異。溝施接種時(shí)，接種量C1處理的植株地上生物量最大，C2與C3處理間無(wú)顯著差異，均小于C1處理。接種量為C1時(shí)，溝施接種處理的地上生物量高于種子接種處理；接種量為C2和C3時(shí)，溝施接種的地上生物量低于種子接種處理。

根瘤菌接種可以提高苜蓿地下生物量，三個(gè)接種量C1，C2和C3間具有顯著差異，接種量越大，地下生物量越小(圖3a)。接種量為C1和C2時(shí)，植株地下生物量與對(duì)照相比顯著增加；接種量為C3時(shí)，植株地下生物量與對(duì)照間無(wú)顯著差異。接種量為C1和C2時(shí)，溝施接種處理的地下生物量顯著低于種子接種處理；接種量為C3時(shí)，溝施接種與種子接種處理間地下生物量無(wú)顯著差異。根瘤菌接種量顯著影響苜蓿植株蛋白含量，但接種方式及其與接種量間的交互作用對(duì)蛋白含量影響不顯著(圖3b)。與對(duì)照(未接菌處理)相比，接種根瘤菌后，苜蓿蛋白含量顯著增加，接種量越高，蛋白含量越高。種子接種時(shí)，C2與C3接種量間植株蛋白含量差異不顯著。溝施接種時(shí)，C3接種量處理時(shí)，植株蛋白含量顯著小于C2。

圖3 不同接種處理下苜蓿地上、地下生物量和蛋白含量Fig.3 Above and below ground biomass and protein content of alfalfa in different treatments注：不同小寫字母代表在同一接種方式下，不同根瘤菌接種數(shù)量間差異顯著(P<0.05)；*代表接種量相同時(shí)，不同根瘤菌接種方式(種子包衣與溝施)間差異顯著(P<0.05)Note:Lowercase letters represent the significant difference between inoculation population under the same inoculation method at the 0.05 level. * represent the significant difference between seed inoculation and in-furrow inoculation in the same inoculant population treatment at the 0.05 level

2.4 根系不同部位根瘤干重及固氮酶活性

根系不同位置形成的根瘤干重和固氮酶活性(乙烯生成速率)均具有顯著差異(圖4)。主根的根瘤干重顯著高于側(cè)根(圖4a)。上部分根系形成的根瘤固氮酶活性較高，其中，0～4 cm主根、0～4 cm側(cè)根和4～8 cm主根的根瘤固氮酶活性顯著高于其它部位，8～12 cm側(cè)根形成根瘤固氮酶活性最低(圖4b)。

圖4 根系不同位置根瘤的干重及固氮酶活性Fig.4 Dry weight and of nodules nitrogen-fixing ability of nodules located on different root segments.注：不同小寫字母代表不同根段間根瘤的干重和固氮酶活性差異顯著(P<0.05)Note:Lowercase letters represent the significant difference of dry weight and nitrogenase activity of nodules located on different root segments at the 0.05 level

3 討論

接種高效根瘤菌可提高豆科植物的生物固氮量，促進(jìn)植株生長(zhǎng)，提高土壤肥力[22-23]。由于與土著菌競(jìng)爭(zhēng)時(shí)接種菌的競(jìng)爭(zhēng)能力較弱，根瘤菌的田間接種效果并不理想。分布范圍小是接種菌競(jìng)爭(zhēng)能力弱的主要原因之一。根瘤菌需要通過(guò)根毛進(jìn)入植株根系[24]，植株根系具有結(jié)瘤活性的細(xì)胞位于根尖成熟根毛區(qū)以下尚未完全發(fā)育成熟的位置，隨著根系生長(zhǎng)，細(xì)胞結(jié)瘤活性在幾小時(shí)內(nèi)消失[25]。根瘤菌在結(jié)瘤活性位點(diǎn)處的根際定殖是侵染結(jié)瘤的前提。根瘤菌的運(yùn)動(dòng)主要依靠鞭毛進(jìn)行，移動(dòng)性差[26-27]，隨著根系的伸長(zhǎng)，種子接種方式接種的根瘤菌在根尖的定殖數(shù)量減少。研究表明，在沒有滲透水的情況下，菌株Rhizobiumjaponicum的垂直移動(dòng)距離不足2.7 cm[28]。在本試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，隨著根系的生長(zhǎng)，種子接種根瘤菌在根尖表面和內(nèi)部的定殖量快速下降。增大接種量可在一定程度上增大接種菌的定殖量與定殖范圍，但并不能從根本上改善種子接種的束縛性。溝施接種處理中根瘤菌均勻分布在植株生長(zhǎng)基質(zhì)中，由于密度較小，在根尖的定殖量雖在根系生長(zhǎng)早期少于種子接種處理，但在根系的整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中保持在穩(wěn)定水平。

增大接種量可顯著提高植株結(jié)瘤數(shù)，這與Bogino等人研究結(jié)果相同[17]。種子包衣處理時(shí)，增加的根瘤主要集中在0～4 cm主根部分，下部分根系及側(cè)根的結(jié)瘤數(shù)很少，與根瘤菌的定殖動(dòng)態(tài)基本平行，這再次印證了種子接種的局限性。接種量達(dá)到C2時(shí)，繼續(xù)增大接種量無(wú)法提高根瘤菌結(jié)瘤數(shù)，說(shuō)明當(dāng)接種根瘤菌達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，接種量已不是限制接種菌結(jié)瘤數(shù)的主要因素。同一接種量下，增大接種范圍可以增加根瘤菌的分布范圍，從而提高根瘤菌的結(jié)瘤數(shù)[29]。在本試驗(yàn)中，溝施接種處理時(shí)，主根的結(jié)瘤數(shù)與種子接種處理間無(wú)顯著差異，側(cè)根的結(jié)瘤數(shù)顯著高于種子接種。說(shuō)明相比于種子包衣，溝施的接種方式可以提高接種菌的分布范圍，增加其在側(cè)根的定殖率，從而增加側(cè)根的結(jié)瘤數(shù)。

根瘤能固定空氣中的氮素，將氣態(tài)氮轉(zhuǎn)變?yōu)榘睉B(tài)氮，供應(yīng)植物吸收利用，提高植株干重及蛋白含量[20]。本試驗(yàn)中，接種根瘤菌后，植株地上和地下干重均增加。接種量越大，植株根瘤數(shù)越多，地上生物量越高。然而，溝施接種情況下，接種量C2與C3處理間的植株結(jié)瘤數(shù)雖高于C1處理，但地上生物量小于C1處理。植物-微生物間的關(guān)系隨著植株養(yǎng)分需求量的變化而改變。當(dāng)植株獲得養(yǎng)分足夠時(shí)，植物與共生菌之間的共生關(guān)系轉(zhuǎn)變?yōu)榧纳鶾30-31]，削弱植株生長(zhǎng)。溝施接種C2和C3接種量處理中，過(guò)多的根瘤可能消耗了大量的碳水化合物，導(dǎo)致地上生物量的降低。此外，通過(guò)測(cè)定根系不同部位根瘤的固氮酶活，發(fā)現(xiàn)0～4 cm主根、0～4 cm側(cè)根、4～8 cm主根處根瘤的固氮酶活性更高。溝施接種中，增加的根瘤多位于4～8 cm側(cè)根、8～12 cm主根與8～12 cm側(cè)根，增加的根瘤并未起到較高的固氮作用，反而消耗了植株的碳水化合物。這可能也是C2和C3接種量下，溝施接種比種子接種的結(jié)瘤數(shù)多但地上生物量低的原因。Bogino等在花生(ArachishypogaeaL.)上的研究也發(fā)現(xiàn)，根瘤菌菌株C-145在溝施時(shí)雖然能在植株根系形成更多的根瘤，但生物量降低。然而，在研究中并未繼續(xù)探究該現(xiàn)象的原因[8]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在接種量低(C1)的情況下，通過(guò)溝施接種增加根瘤菌的接種范圍，可提高苜蓿結(jié)瘤數(shù)與地上生物量。在接種量高(C2，C3)的情況下，溝施接種處理中側(cè)根增加的根瘤大部分固氮酶活性較差，使溝施接種的優(yōu)勢(shì)降低，這在以往關(guān)于接種方式的研究中一直被忽略，導(dǎo)致溝施的作用被高估。根系是植株養(yǎng)分吸收的主要器官，其生長(zhǎng)具有可塑性。為了獲得充足的養(yǎng)分資源，植株向根系分配更多的碳水化合物，根系生物量增加。隨著結(jié)瘤數(shù)的增加，根系的生物量降低，也從側(cè)面表明根瘤是特殊的氮素資源。

4 結(jié)論

在一定接種量范圍內(nèi)，增加接種量能提高苜蓿根瘤菌的接種效率。接種量較低時(shí)，溝施接種的效果比種子包衣好，但在接種量較高時(shí)，溝施接種的優(yōu)勢(shì)消失，主要是由于溝施接種增加的根瘤多位于側(cè)根且固氮酶活性較低。因此，在田間進(jìn)行根瘤菌接種時(shí)，以種子包衣為優(yōu)，適當(dāng)增大接種量可提高接種效果。