付 薇， 陳 偉， 周 麗， 蔡 璐， 王小利， 韓永芬*， 孟軍江

(1.貴州省草業(yè)研究所， 貴州 貴陽 550006；2.貴州金農(nóng)富平生態(tài)農(nóng)牧科技有限公司， 貴州 松桃 554100；3.貴州省生物技術(shù)研究所， 貴州 貴陽 550006)

高丹草是禾本科(Gramineae)一年生C4飼草，鮮草產(chǎn)量高，再生能力強、抗倒伏、營養(yǎng)品質(zhì)佳、適口性好[1-2]。高丹草夏季生長旺盛，南方氣候多雨濕潤不宜干草加工。青貯調(diào)制不僅可以最大程度保留其營養(yǎng)成分[3]，還可有效解決南方草料季節(jié)性供應(yīng)不均衡問題。尤思涵等[3]、張歡等[4]開展了高丹草與不同牧草適宜混貯比例研究，白春生等[1]研究了不同施氮量和留茬高度對高丹草青貯發(fā)酵的影響，但不同乳酸菌類型復(fù)合添加對高丹草青貯品質(zhì)的影響研究國內(nèi)外并不多見。

植物乳桿菌和短乳桿菌是較為常見的青貯發(fā)酵乳酸菌，前者屬于同型發(fā)酵乳酸菌，能快速提升乳酸含量降低pH值，減少青貯發(fā)酵過程中的營養(yǎng)損失[5]，后者屬于異型發(fā)酵乳酸菌，青貯時產(chǎn)生大量乙酸，有效抑制開窖后酵母菌、霉菌等有害微生物生長，較好防止青貯有氧腐敗變質(zhì)[6]。國內(nèi)有關(guān)二者按不同比例混合添加對高丹草青貯開窖前后營養(yǎng)成分、微生物變化規(guī)律、有氧穩(wěn)定性影響的深入研究較少。項目組利用前期從青貯玉米中篩選獲得的2株植物乳桿菌和短乳桿菌制作復(fù)合乳酸菌劑，研究該復(fù)合乳酸菌不同添加比例對高丹草青貯發(fā)酵效果和有氧穩(wěn)定性的影響，為優(yōu)良乳酸菌篩選利用和高丹草青貯調(diào)制技術(shù)研發(fā)提供科學依據(jù)與技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青貯原料為‘蜀草1號’高丹草，于2019年4月16日播種于貴州省草業(yè)研究所松桃縣高產(chǎn)飼草基地，種植面積為2 hm2，種植行距為50 cm×20 cm，2019年8月3日蠟熟初期收割，營養(yǎng)成分見表1。供試菌株植物乳桿菌LP06和短乳桿菌LBR02部分生理生化特性見表2。

表1 青貯原料營養(yǎng)成分和微生物數(shù)量Table 1 Nutritional composition and microbial quantity of silage materials

表2 菌株LP06和LBR02部分生理生化特性Table 2 Some physiological and biochemical characteristics of LP06 and LBR02

1.2 試驗方法

將高丹草晾曬至水分含量在60%～70%，切碎至3～5 cm長度，裝入聚乙烯袋(塑料袋規(guī)格為600 mm×500 mm)，每袋1 500 g。真空密封機抽氣密封，每個處理3個重復(fù)，常溫貯藏60 d。設(shè)置8個添加處理(每個處理乳酸菌添加總量約5.0×106cfu·mL-1)：1.CK(對照，無乳酸菌添加)；2.LP06(LP06∶LBR02=1∶0)；3.LBR02(LP06∶LBR02=0∶1)；4.F-1(LP06∶LBR02=4∶1)；5.F-2(LP06∶LBR02=3∶2)；6.F-3(LP06∶LBR02=2∶3)；7.F-4(LP06∶LBR02=1∶4)；8.F-5(LP06∶LBR02=1∶1)。將2種菌種分別活化后接入液體乳酸細菌培養(yǎng)基(De-man rogosasharpe,MRS)，37℃培養(yǎng)72 h，用蒸餾水調(diào)整至菌落總數(shù)1.0×106cfu·mL-1，按5 mL·kg-1的總劑量混合各乳酸菌組合，10倍無菌蒸餾水稀釋后均勻噴灑至高丹草原料上，以等體積無菌蒸餾水作為對照。

1.3 測定指標及方法

1.3.1發(fā)酵品質(zhì)測定 發(fā)酵第60 d測定青貯pH值、氨態(tài)氮(Ammonium nitrogen，NH3-N)、乳酸、乙酸含量。開窖后第6 d再次測定pH。pH采用酸度計(PHS-25)測定，NH3-N含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法分析[8]，乳酸、乙酸含量采用高效液相色譜法分析[8]。

1.3.2常見營養(yǎng)成分測定 發(fā)酵第60 d測定干物質(zhì)(Dry matter，DM)、粗蛋白質(zhì)(Crude protein，CP)、可溶性碳水化合物(Water-soluble carbohydrates，WSC)、酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber，ADF)、中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber，NDF)含量。開窖后第6 d測定青貯DM，CP，WSC含量。DM含量采用烘干重量法測定[9]，CP含量采用凱氏定氮法測定[9]，WSC含量采用蒽酮-硫酸比色法測定[9]，ADF和NDF含量采用范氏(VanSoest)洗滌纖維法測定[10]。

1.3.3微生物數(shù)量及多樣性測定 發(fā)酵第60 d和開窖第6 d分別測定乳酸菌、酵母菌、霉菌數(shù)量。稱取20 g樣品于180 mL無菌生理鹽水(0.85%NaCl)中，4℃下振蕩1 h后制備系列梯度稀釋液(10-7～100)[7]。各微生物均采用菌落計數(shù)法計數(shù)，將稀釋液涂布于MRS培養(yǎng)基，于37℃下恒溫厭氧培養(yǎng)72 h，統(tǒng)計乳酸菌菌落數(shù)。在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上涂布稀釋液，25℃下恒溫有氧培養(yǎng)72 h后統(tǒng)計酵母菌菌落數(shù)。于馬丁培養(yǎng)基上涂布稀釋液，25℃下恒溫有氧培養(yǎng)72 h，統(tǒng)計霉菌菌落數(shù)。

1.3.4有氧穩(wěn)定性測定 有氧穩(wěn)定性是指青貯飼料在開窖后隨著pH、溫度升高依然保持新鮮、氣味酸香的持續(xù)時間[11]。將溫度計插入樣品中，每隔2 h記錄青貯幾何中心溫度，有氧穩(wěn)定性以中心溫度不高于環(huán)境溫度2℃所持續(xù)的時間表示。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用Excel 2007軟件對基礎(chǔ)數(shù)據(jù)進行整理。采用SPSS v18.0統(tǒng)計軟件進行單因子方差分析，并用鄧肯氏(Duncan)法進行組間差異顯著性分析，P<0.05代表差異顯著。根據(jù)試驗數(shù)據(jù)分析結(jié)果，采用模糊數(shù)學隸屬函數(shù)法對青貯60 d、開窖后有氧穩(wěn)定性、開窖第6 d的測定指標進行綜合評價[12]，計算公式如下：

式中：Uxi(+)為各指標正相關(guān)隸屬函數(shù)值，Uxi(-)為各指標負相關(guān)隸屬函數(shù)值，Xi為某指標測定值，Xmin和Xmax分別為某指標所有測定值中的最小值和最大值。以全部指標隸屬函數(shù)值平均值大小進行排名。

2 結(jié)果與分析

2.1 高丹草青貯60 d各處理發(fā)酵品質(zhì)比較和主要微生物數(shù)量變化

不同菌劑添加比例對高丹草青貯60 d發(fā)酵品質(zhì)的影響如表3所示。青貯60 d后，全部處理pH值下降至4.1以下。LP06，F(xiàn)-1，F(xiàn)-2處理NH3-N含量顯著低于CK(P<0.05)。LP06和F-1處理乳酸含量最高，分別為4.23%，4.40%。青貯60 d后，乙酸含量隨著短乳桿菌添加比例的增加而增加。

不同菌劑添加比例對高丹草青貯60 d微生物數(shù)量的影響如表3所示。各處理乳酸菌數(shù)量顯著高于CK(P<0.05)，其中LP06，F(xiàn)-5處理乳酸菌數(shù)量較高(>8.00 lg cfu·g-1FM)。F-3處理酵母菌數(shù)量最低，各處理均未檢測到霉菌。

表3 不同菌劑添加比例對高丹草青貯60 d發(fā)酵品質(zhì)和主要微生物數(shù)量的影響Table 3 Effects of mixing ratio of additive ingredients onfermentation quality andmajor microbial quantity of Sorghum hybrid Sudan grassafter 60 days silage

2.2 高丹草青貯60 d各處理營養(yǎng)成分比較

不同菌劑添加比例對高丹草青貯60 d營養(yǎng)成分的影響如表4所示。CP損耗整體隨著植物乳桿菌添加比例的增加而降低。CK處理WSC營養(yǎng)損失最少，含量為4.15%，顯著高于其它處理(P<0.05)。

表4 不同菌劑添加比例對高丹草青貯60 d營養(yǎng)成分的影響Table 4 Effects of mixing ratio of additive ingredients on nutritional components of sorghum hybrid sudan grass after 60 days silage

2.3 高丹草青貯開窖后各處理有氧腐敗抑制效果比較

不同菌劑添加比例對高丹草青貯開窖后有氧腐敗抑制效果的影響如表5所示。開窖第6 d，CK，LP06和F-1處理pH值出現(xiàn)了較大幅度上升，LBR02，F(xiàn)-3，F(xiàn)-4，F(xiàn)-5處理pH穩(wěn)定在4.3以下。LBR02，F(xiàn)-4，F(xiàn)-5處理DM含量略有上升。CK處理WSC損失幅度最大，為33.49%，F(xiàn)-5處理損失幅度最小，為16.23%，全部短乳桿菌添加處理的WSC含量高于植物乳桿菌LP06單獨添加。LBR02，F(xiàn)-4和F-3有氧穩(wěn)定性分別達192.33 h，184.37 h和179.06 h，顯著高于其它處理(P<0.05)。各處理青貯飼料乳酸菌數(shù)量顯著高于CK(P<0.05)。隨著短乳桿菌添加量增加，青貯酵母菌數(shù)量逐步降低，LBR02，F(xiàn)-3，F(xiàn)-4和F-5處理未檢測出霉菌。

表5 各處理有氧穩(wěn)定性及開窖6 d后pH值、營養(yǎng)成分、主要微生物數(shù)量比較Table 5 Comparison of aerobic stability,pH value,nutritional components and major microbial quantity of each treatment after 6 days cellar opening

2.4 各處理青貯效果綜合評價

為綜合評價各處理對高丹草青貯品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性的影響，本研究利用隸屬函數(shù)法對8個處理青貯60 d和開窖6 d兩個試驗階段的指標進行綜合評價，其中乳酸、乙酸、DM,CP,WSC,乳酸菌含量為6個正向指標，pH,NH3-N,NDF,ADF,酵母菌、霉菌含量為6個負向指標。根據(jù)6個正向指標和6個負向指標的平均隸屬函數(shù)值對8個處理進行綜合價值評定，平均值越高表明該處理綜合應(yīng)用價值越高，從高到低依次為：F-3(0.63)>F-5(0.61)>LBR02(0.58)=F-2(0.58)>F-4(0.57)>LP06(0.56)>F-1(0.40)>CK(0.30)。

表6 不同菌劑添加比例對高丹草青貯效果的綜合評價Table 6 Comprehensive evaluation ofmixing ratio of additive ingredients on sorghum hybrid sudan grass silage effects

3 討論

3.1 乳酸菌添加比例對高丹草青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

飼草通過青貯發(fā)酵能夠快速降低pH，減少有害菌活動代謝，降低營養(yǎng)損耗，因此pH值的大小可以體現(xiàn)飼料品質(zhì)。本研究中，全部處理發(fā)酵60 d后的pH值均低于4.1，pH整體隨著同型發(fā)酵乳酸菌比例增加而降低，進一步表明在青貯中加入同型發(fā)酵乳酸菌更有利于加快青貯進程[13-14]。青貯發(fā)酵過程中，蛋白被多種厭氧微生物消耗代謝轉(zhuǎn)化成NH3-N和胺類物質(zhì)，因此NH3-N含量可間接反映出青貯飼料中蛋白質(zhì)營養(yǎng)消耗情況[15]。青貯60 d，LP06，F(xiàn)-1和F-2處理NH3-N含量較低，推測可能是3組處理植物乳桿菌添加比例較高，發(fā)酵前期能快速主導發(fā)酵進程形成良好的厭氧酸性環(huán)境抑制了有害微生物對蛋白質(zhì)的分解所致。研究指出，同、異型乳酸菌單獨添加或復(fù)合添加，均提高青貯中的乳酸含量[16-17]，各處理乳酸含量均高于CK，隨著植物乳桿菌添加比例增加，乳酸含量也呈增加趨勢，該結(jié)果與pH試驗結(jié)果相吻合，進一步體現(xiàn)了同型發(fā)酵乳酸菌在增加體系內(nèi)乳酸含量方面的優(yōu)勢。

3.2 乳酸菌添加比例對高丹草青貯營養(yǎng)成分和主要微生物的影響

CP是評價青貯飼料營養(yǎng)成分的重要指標，蛋白質(zhì)降解影響氮的利用率，從而影響飼料營養(yǎng)成分。CP含量整體隨著植物乳桿菌添加比例增加而增加，可能是植物乳桿菌發(fā)酵前期代謝活動強于短乳桿菌，添加比例越高越易較早形成酸性環(huán)境，一定程度上抑制了蛋白質(zhì)分解酶的作用所致[18]。青貯后全部處理組WSC含量較低，可能是WSC被添加的乳酸菌作為碳源營養(yǎng)來源大量利用，造成WSC含量的顯著降低。

青貯過程是一個復(fù)雜的微生物代謝過程，而乳酸菌則是決定青貯發(fā)酵成功與否的重要微生物。青貯60 d后，7組乳酸菌添加處理的乳酸菌數(shù)量較高，進一步證實在發(fā)酵過程中額外添加乳酸菌制劑可以加速發(fā)酵進程。酵母菌數(shù)量隨著短乳桿菌添加比例增加而顯著降低，短乳桿菌異型發(fā)酵生成乙酸，乙酸對酵母菌和霉菌有較強抑制作用，在抑制好氧微生物生長、防止青貯飼料腐敗方面有積極作用[13，19]。

3.3 乳酸菌添加比例對高丹草青貯有氧腐敗抑制效果的影響

開窖第6 d，隨著短乳桿菌添加比例增加，DM含量略微有所上升，可能是有氧腐敗和物質(zhì)損耗相對較少，DM含量因青貯滲出液的流失短暫增加所致。開窖有氧暴露后，酵母菌、霉菌逐步活躍，乳酸、CP,WSC等物質(zhì)被這些好氧微生物快速繁殖利用，CK和植物乳桿菌高比例添加組(LP06，F(xiàn)-1，F(xiàn)-2)因乙酸含量較低，好氧微生物生長抑制作用弱，營養(yǎng)物質(zhì)被迅速代謝消耗，更易發(fā)生變質(zhì)腐敗[20]。隨著短乳桿菌比例的增加，有氧穩(wěn)定性顯著增加，以短乳桿菌LBR02單獨添加表現(xiàn)最為突出，有氧穩(wěn)定性比植物乳桿菌LP06單獨添加高出89.69 h，由此盡管植物乳桿菌具有較快的發(fā)酵特性，發(fā)酵過程中在降低NH3-N含量、減少CP損失方面具有優(yōu)勢，但對青貯開窖后有氧腐敗抑制效果不顯著[21-22]。

4 結(jié)論

青貯60 d時，增加植物乳桿菌LP06的添加比例可以降低高丹草NH3-N含量、減少CP損失、增加乳酸菌數(shù)量；開窖有氧暴露后，增加青貯飼料中短乳桿菌LBR02的添加比例，可以有效抑制好氧微生物生長、防止青貯飼料腐敗變質(zhì)。綜合分析，植物乳桿菌LP06和短乳桿菌LBR02以2∶3比例混合添加，高丹草青貯效果綜合表現(xiàn)最優(yōu)。