miR-17-5p在肺結(jié)核患者外周血中表達(dá)變化及臨床意義

湯志森 王德志

肺結(jié)核是臨床常見的慢性傳染性疾病，主要由結(jié)核分枝桿菌感染引起，是引起人類死亡率升高的主要傳染病之一[1]。在世界范圍內(nèi)，每年大約有1000萬(wàn)例以上的肺結(jié)核新發(fā)病例及140萬(wàn)例以上的肺結(jié)核死亡病例，在國(guó)內(nèi)每年死亡人數(shù)達(dá)12萬(wàn)，嚴(yán)重威脅人類健康[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，部分病人感染結(jié)核分枝桿菌后并非立即發(fā)病，直到機(jī)體免疫力下降或變態(tài)反應(yīng)增強(qiáng)后，才表現(xiàn)出肺結(jié)核癥狀[4]。而數(shù)據(jù)顯示，國(guó)內(nèi)有近一半的人感染結(jié)核分枝桿菌，及時(shí)診斷肺結(jié)核及其活動(dòng)性并及時(shí)治療具有重要意義[5]。目前肺結(jié)核臨床診斷方法有細(xì)胞因子檢測(cè)、細(xì)菌學(xué)檢測(cè)、抗原檢測(cè)等，但因耗時(shí)長(zhǎng)、對(duì)樣品要求高及可能出現(xiàn)假陰性等缺點(diǎn)，難以準(zhǔn)確診斷肺結(jié)核病情從而延誤治療。因此，尋找與肺結(jié)核發(fā)病相關(guān)的基因，快速準(zhǔn)確的判斷肺結(jié)核發(fā)病及其病情，對(duì)肺結(jié)核治療具有重要意義。微小RNA(microRNA，miRNA)是一種非編碼小RNA分子，長(zhǎng)約20～25個(gè)核苷酸，參與多種疾病生理、病理過程[6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA不僅在傳染性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，且在結(jié)核病病人外周血中穩(wěn)定存在，已作為新的生物標(biāo)志物成為結(jié)核病研究熱點(diǎn)[7-8]。目前有研究證實(shí)，miR-17-5p在調(diào)控巨噬細(xì)胞抗結(jié)核分枝桿菌感染的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[9]，但在肺結(jié)核患者體內(nèi)的表達(dá)尚鮮有研究。本研究將檢測(cè)肺結(jié)核患者外周血miR-17-5p水平，并探討其臨床意義。

資料與方法

一、一般資料

選取2017年10月至2019年8月在本院就診的肺結(jié)核患者(肺結(jié)核組)86例作為研究對(duì)象。根據(jù)肺結(jié)核活動(dòng)性，將肺結(jié)核患者分為非活動(dòng)性肺結(jié)核組(33例)和活動(dòng)性肺結(jié)核組(53例)。選取同期進(jìn)行體檢的健康者(對(duì)照組)90例作為對(duì)照，肺結(jié)核組和對(duì)照組性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)肺結(jié)核及其活動(dòng)性診斷符合中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《肺結(jié)核診斷》及《結(jié)核病分類》[10-11]。(2)臨床資料完整，且受試者依從性高。(3)受試對(duì)象知情同意，并簽署有關(guān)證明文書。

表1 患者一般資料比較

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并臟器損害者。(2)合并惡性腫瘤者。(3)合并全身免疫相關(guān)性疾病者。(4)合并其他肺部疾病者。

二、試劑與儀器

RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：EX1882-50T、RE0510-100T)購(gòu)自金克隆(北京)生物技術(shù)有限公司；miScript SYBR Green PCR kit(貨號(hào)：218076)購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；人腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(貨號(hào)：SEKH-0047、SEKH-0013)及miR-17-5p、U6引物購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

Rotor-Gene?Q實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)QIAGEN公司；SPECTRAmaxM2e型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司。

三、血液采集

肺結(jié)核患者入院第2日晨起抽取肘部空腹靜脈血，對(duì)照組體檢當(dāng)日抽取肘靜脈血，4℃ 3000 r/min離心10 min，取上層血清，分裝、在-80℃冰箱中保存待用。

四、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定外周血miR-17-5p表達(dá)水平

將保存于-80℃冰箱的血清樣本200 μL取出，于冰上融化，使用RNA提取試劑盒并按照其說明書抽取總RNA，測(cè)定其濃度、純度、完整性后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒并按照其說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-80℃保存。使用miScript SYBR Green PCR kit并按照其說明書配制實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。以管家基因U6為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法表示miR-17-5p表達(dá)水平。miR-17-5p上游引物：5′-GCCGCAAAGTGCTTACAGTG-3′，miR-17-5p下游引物：5′-TGCAGGGTCCGAGGTAT-3′；U6上游引物：5′-CAAATTCGTGAAGCGTTCCATA-3′，U6下游引物：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′。

五、ELISA法檢測(cè)外周血炎癥因子水平

將保存于-80℃冰箱的血清樣本200 μL取出，于冰上融化，分別使用人TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒，按照其說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(optical density，OD)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線，計(jì)算TNF-α、IL-6表達(dá)水平。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、肺結(jié)核組與對(duì)照組外周血miR-17-5p表達(dá)水平

與對(duì)照組相比，肺結(jié)核組患者外周血miR-17-5p表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)(見表2)。

表2 肺結(jié)核組與對(duì)照組外周血miR-17-5p表達(dá)水平比較

二、肺結(jié)核組與對(duì)照組外周血炎癥因子表達(dá)水平

與對(duì)照組相比，肺結(jié)核組患者外周血TNF-α、IL-6表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)(見表3)。

表3 肺結(jié)核組與對(duì)照組外周血TNF-α、IL-6表達(dá)水平比較

三、肺結(jié)核患者外周血miR-17-5p表達(dá)水平與炎癥因子的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，肺結(jié)核患者外周血miR-17-5p表達(dá)水平與TNF-α、IL-6均呈顯著正相關(guān)(r=0.524、0.595，P<0.05)(見圖1)。

四、活動(dòng)性與非活動(dòng)性肺結(jié)核患者外周血miR-17-5p表達(dá)水平

與非活動(dòng)性肺結(jié)核組相比，活動(dòng)性肺結(jié)核組患者外周血miR-17-5p表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)(見表4)。

表4 活動(dòng)性與非活動(dòng)性肺結(jié)核患者外周血miR-17-5p表達(dá)水平比較

五、外周血miR-17-5p表達(dá)水平對(duì)肺結(jié)核及其活動(dòng)性的診斷價(jià)值分析

ROC曲線分析結(jié)果顯示，外周血miR-17-5p表達(dá)水平區(qū)分肺結(jié)核患者與健康者的ROC曲線下面積為0.905(95%CI：0.861～0.949)，約登指數(shù)為0.684，當(dāng)診斷閾值為1.365時(shí)敏感度為88.4%，特異性為80.0%，見圖2；外周血miR-17-5p表達(dá)水平區(qū)分活動(dòng)性肺結(jié)核患者與非活動(dòng)性肺結(jié)核患者的ROC曲線下面積為0.756(95%CI：0.681～0.831)，約登指數(shù)為0.397，當(dāng)診斷閾值為1.555時(shí)敏感度為48.8%，特異性為90.9%(見圖3)。

圖1 肺結(jié)核患者外周血miR-17-5p表達(dá)水平與TNF-α、IL-6的相關(guān)性分析圖

圖2 ROC曲線分析外周血miR-17-5p表達(dá)水平對(duì)肺結(jié)核的診斷價(jià)值

圖3 ROC曲線分析外周血miR-17-5p表達(dá)水平對(duì)肺結(jié)核活動(dòng)性的診斷價(jià)值

討 論

結(jié)核病是全世界面臨的公共衛(wèi)生問題，是現(xiàn)今人類3大感染性疾病之一，其死亡率位于傳染病榜首。每年均有大量人群感染結(jié)核分枝桿菌，發(fā)展為慢性炎癥疾病，通常以肺結(jié)核病居多。流行病學(xué)顯示，全球肺結(jié)核病人的數(shù)量每年以數(shù)百萬(wàn)的速度增加，防治形勢(shì)仍非常嚴(yán)峻，發(fā)病成為活動(dòng)性肺結(jié)核后可導(dǎo)致死亡率大大增加[12]。因此，及時(shí)診斷肺結(jié)核及其活動(dòng)性具有重要臨床價(jià)值。

近年來，miRNA已被發(fā)現(xiàn)廣泛參與細(xì)胞各種生物學(xué)行為及各種生理、病理反應(yīng)的調(diào)控，包括微生物感染后機(jī)體的免疫應(yīng)答、炎癥等反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，宿主被結(jié)核分枝桿菌感染后，巨噬細(xì)胞表面的Toll樣受體可識(shí)別病原體，引發(fā)炎癥反應(yīng)及多種免疫防御機(jī)制，進(jìn)而清除入侵的結(jié)核分枝桿菌[13]。而在結(jié)核分枝桿菌感染的過程中，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的特異性miRNA，可在肺結(jié)核病人血液中被檢測(cè)到。因此，在結(jié)核患者體內(nèi)差異表達(dá)的miRNA，可能參與巨噬細(xì)胞調(diào)控的炎癥反應(yīng)、免疫防御過程，有潛力成為診斷結(jié)核病及其病情的生物標(biāo)識(shí)。康雪雪等[14]研究表明，hsa-miR-17-5p在哮喘兒童血清中高表達(dá)，其機(jī)制可能與炎癥、免疫有關(guān)，有望成為診斷哮喘的標(biāo)志物。張?zhí)O等[15]研究表明，丙型肝炎患者血清hsa-miR-17-5p相對(duì)表達(dá)量顯著升高，與丙型肝炎病毒感染及致病密切相關(guān)，有望成為丙肝患者肝損傷判斷的潛在分子標(biāo)志物。而張帆等[9]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌感染可下調(diào)miR-17-5p表達(dá)，而miR-17-5p可通過靶向抑制SIRPα表達(dá)，上調(diào)細(xì)胞因子TNF-α表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控巨噬細(xì)胞抗結(jié)核分枝桿菌的炎癥反應(yīng)。洪丹彤等[16]從自噬角度亦發(fā)現(xiàn)，miR-17-5p在巨噬細(xì)胞抗結(jié)核分枝桿菌感染過程中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，肺結(jié)核組患者外周血miR-17-5p表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高，提示miR-17-5p參與肺結(jié)核的發(fā)生過程。肺結(jié)核組患者外周血TNF-α、IL-6表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高，同時(shí)肺結(jié)核組患者外周血miR-17-5p表達(dá)水平與外周血TNF-α、IL-6表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)，提示肺結(jié)核患者體內(nèi)miR-17-5p的表達(dá)與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，并推測(cè)miR-17-5p水平升高可能是機(jī)體的內(nèi)源保護(hù)反應(yīng)，可能促進(jìn)TNF-α、IL-6表達(dá)，調(diào)控肺結(jié)核患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而清除感染的結(jié)核分枝桿菌。

由于miRNA在血液等臨床樣本中穩(wěn)定性高，可以快速準(zhǔn)確定量，有望成為反映疾病發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)指標(biāo)。侯新月等[2]研究顯示，miR-24-3p區(qū)分肺結(jié)核患者與健康體檢者的敏感度、特異度分別為86%和90%。本研究使用外周血miR-17-5p表達(dá)水平診斷肺結(jié)核的敏感度、特異性分別為88.4%、80.0%，提示外周血miR-17-5p表達(dá)水平對(duì)肺結(jié)核具有較高的診斷價(jià)值。肺結(jié)核的活動(dòng)性，關(guān)系到患者的治療措施，及時(shí)診斷肺結(jié)核活動(dòng)性對(duì)肺結(jié)核患者治療至關(guān)重要[17]。本研究結(jié)果顯示，活動(dòng)性肺結(jié)核組患者外周血miR-17-5p表達(dá)水平較非活動(dòng)性肺結(jié)核組顯著升高，提示外周血miR-17-5p表達(dá)水平與肺結(jié)核患者活動(dòng)性密切相關(guān)。侯新月等[2]研究顯示，miR-24-3p區(qū)分活動(dòng)性肺結(jié)核患者與非活動(dòng)性肺結(jié)核患者的敏感度、特異度分別為53.3%和100%。周冰等[5]研究表明，miR-144區(qū)分活動(dòng)性肺結(jié)核患者與健康志愿者的敏感度、特異度分別為96.88%和96.77%。本研究使用外周血miR-17-5p表達(dá)水平診斷肺結(jié)核患者活動(dòng)性的敏感度、特異性分別為48.8%和90.9%，提示外周血miR-17-5p表達(dá)水平診斷肺結(jié)核患者活動(dòng)性的特異性較好，具有一定臨床參考價(jià)值。

綜上所述，miR-17-5p在肺結(jié)核患者外周血中高表達(dá)，在活動(dòng)性肺結(jié)核患者外周血中表達(dá)更高，其水平與炎癥因子TNF-α、IL-6水平明顯相關(guān)，可用于輔助診斷肺結(jié)核及其活動(dòng)性。