益腎骨康方對骨轉(zhuǎn)移癌痛大鼠骨質(zhì)破壞的影響

梁 敏，蘆殿榮*，何理玉，馮 利

（1.中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102；2.國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院，北京 100021）

骨骼是腫瘤轉(zhuǎn)移細(xì)胞主要的目標(biāo)器官之一[1]，轉(zhuǎn)移率僅次于肺和肝[2]。乳腺癌、肺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、腎癌、肝癌等是常見發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤[3]。疼痛是骨轉(zhuǎn)移癌較早出現(xiàn)的臨床癥狀，給患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重的影響。多數(shù)患者最初經(jīng)歷間歇性的鈍痛，但隨著病情的進(jìn)展，疼痛逐步轉(zhuǎn)化為持續(xù)性的鈍痛或刀割樣痛，活動時加劇[4]。75%的病人忍受著由癌癥引起的致殘性骨痛，開發(fā)新的藥物及尋找更好的治療方法是目前研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)[5]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，益腎骨康方在治療癌性軀體痛方面具有更好的止痛效果，改善患者生活質(zhì)量，不良反應(yīng)更低[6-9]。本研究通過建立大鼠骨轉(zhuǎn)移癌痛模型，觀察益腎骨康方（專利號：ZL2013 1 0582907.9，專利權(quán)人：馮利）及其拆方對模型大鼠骨質(zhì)破壞的影響，評價益腎骨康方治療骨轉(zhuǎn)移癌痛的止痛以及骨保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動物與細(xì)胞 48 只SPF 級雌性SD 大鼠，體質(zhì)量（200±20 ）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物合格證號：SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)于中央民族大學(xué)中藥學(xué)院動物研究中心，符合動物倫理相關(guān)規(guī)定。大鼠飼養(yǎng)溫度（25±0.5）℃，自由飲食、飲水，于實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。大鼠乳腺癌MRMT-1 細(xì)胞購自美國ATCC 公司，于液氮中保存。

1.2 藥物 益腎骨康方中藥購自中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院門診中藥房，原方劑量120 g，大鼠和人的等效劑量按7 倍換算，成人的體質(zhì)量設(shè)為60 kg。益腎骨康方高劑量組是成人常規(guī)劑量的2 倍，低劑量組為成人常規(guī)劑量的1/2 倍，再分別折算成大鼠的等效劑量。解毒化瘀組、扶正組分別為益腎骨康方原方根據(jù)方意拆方而來。中藥提前浸泡30 min，放入鍋中煎煮約1 h，濃縮，得到4 組中藥生藥終濃度。分別是益腎骨康方高劑量組：2.80 g/mL；益腎骨康方低劑量組：0.70 g/mL；解毒化瘀組：0.58 g/mL；扶正組：0.82 g/mL。

1.3 主要試劑與儀器 DMEM 高糖培養(yǎng)基（批號：C11995500BT）、胰酶溶液（批號：T1300）、胎牛血清（批號：11011-8611）、青霉素/鏈霉素混合液（批號：P1400），均購自北京索寶萊科技有限公司；Forma 370型細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國Thermo 公司；Motic AE2000 型倒置光學(xué)顯微鏡，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；BME404型電子式機(jī)械測痛儀，天津伯爾尼科技有限公司。

1.4 骨轉(zhuǎn)移癌大鼠模型建立 取雌性SD 大鼠，體質(zhì)量為（200 ±20 ）g，用0.3%戊巴比妥鈉，1 mL/100 g，腹腔注射麻醉，待大鼠麻醉成功后，固定于鼠板，右側(cè)后肢剃毛，碘伏消毒，于脛骨內(nèi)側(cè)面脛骨平臺下切開長度約1 cm 的切口，鈍性分離肌肉，暴露骨面，用22 G 針頭在脛骨平臺下約0.5～1 cm 處鉆孔，先垂直于骨面鉆，然后再傾斜45°鉆孔，待鉆孔成功后，用10 uL 微量注射器抽取10 uL 大鼠乳腺癌MRMT-1 細(xì)胞懸液（1×107/mL）注入骨髓腔（對照組注射等量生理鹽水），針頭停留2 min，拔出后，迅速用骨蠟封孔。生理鹽水沖洗溢出的腫瘤細(xì)胞，縫合，碘伏消毒，用紅霉素軟膏涂于創(chuàng)面。

1.5 分組與給藥 將48 只大鼠按隨機(jī)數(shù)表法分為益腎骨康方高劑量組、益腎骨康方低劑量組、扶正組、解毒化瘀組、對照組、模型組，每組8 只。除對照組外其余各組建立大鼠骨轉(zhuǎn)移癌痛模型，于造模后第2天開始給藥，各中藥組大鼠給予對應(yīng)的中藥湯藥，對照組和模型組給予生理鹽水，均按1 mL/100 g進(jìn)行灌胃，每日1 次，連續(xù)2 周。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多個實(shí)驗(yàn)組均數(shù)之間比較采用單因素方差分析，以 α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 大鼠骨癌痛模型行為學(xué)觀察

2.1 一般狀態(tài) 造模后每日觀察大鼠飲食、飲水、精神狀態(tài)、創(chuàng)面愈合情況。于造模前、造模后第3、7、14 天測量體質(zhì)量。

2.2 腫瘤體積 建模第15 天，引頸處死大鼠，剪下右后肢，并將后肢皮膚和肌肉組織剝離，暴露出帶有轉(zhuǎn)移腫瘤的脛骨，用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑和短徑。腫瘤體積=（腫瘤長徑×腫瘤短徑2）/ 2。

2.3 病理學(xué)評價

2.3.1 取材 建模第15 天，每組隨機(jī)抽取3 只大鼠取右側(cè)脛骨，將脛骨放于4%多聚甲醛中常溫固定。使用EDTA 脫鈣45 d，每3 日換1 次，EDTA 濃度為10%，pH 7.0～7.4，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片。

2.3.2 HE 染色 80°烤片1 h 后，將切片置于二甲苯中脫蠟3 次，每次10 min；分別于100%、95%乙醇中梯度脫水5 min，各2 次；流水沖洗2 min 后蘇木素染色5 min；依次進(jìn)行1%鹽酸酒精溶液分化5～10s；自來水返藍(lán)25 min；0.5%伊紅染色2 min；95%、100%乙醇中梯度脫水5 min，各2 次；二甲苯中透明2 次，每次5 min，染色結(jié)束后委托北大三院病理科進(jìn)行鏡下觀察。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠體質(zhì)量變化比較 對照組體質(zhì)量從建模前到建模后第 14 天呈持續(xù)增長趨勢；各建模組大鼠從建模后第7 天開始，體質(zhì)量持續(xù)降低；與對照組比較，建模后第 7 天、第 14 天，各建模組大鼠體質(zhì)量明顯降低（P＜0.05）；建模后第14 天，扶正組（P=0.03）、低劑量組（P=0.023）體質(zhì)量高于模型組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，解毒化瘀組、高劑量組體質(zhì)量均高于模型組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化比較（，n =8）g

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化比較（，n =8）g

注：與對照組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

3.2 腫瘤體積 由于對照組沒有接種腫瘤細(xì)胞，所以腫瘤體積為（0.00±0.00），與模型組及各給藥組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），說明腫瘤接種成功。與模型組比較，各給藥組平均腫瘤體積有減小趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能與個體差異較大有關(guān)。見表2。

表2 各組大鼠腫瘤體積比較（，n =8）

表2 各組大鼠腫瘤體積比較（，n =8）

注：與對照組比較，# P ＜0.05

3.3 病理學(xué)評價 對照組骨髓腔內(nèi)未見腫瘤細(xì)胞浸潤，骨皮質(zhì)發(fā)育良好，骨皮質(zhì)厚薄程度基本均一，骨小梁排列緊密。模型組骨組織被嚴(yán)重破壞，腫瘤細(xì)胞彌漫浸潤骨髓腔，腫瘤細(xì)胞占骨組織的百分比約50%～60%，可見大片腫瘤性壞死，并向骨外侵襲，骨小梁受損及其明顯，骨皮質(zhì)破壞嚴(yán)重，出現(xiàn)骨皮質(zhì)變薄。解毒組及扶正組骨髓腔內(nèi)可見少量腫瘤細(xì)胞浸潤，骨小梁輕微破壞或完整，骨皮質(zhì)約0.5～0.6 μm，受損程度較模型組減輕。低劑量組及高劑量組骨皮質(zhì)較完整，骨髓腔內(nèi)可見腫瘤細(xì)胞灶狀浸潤，骨小梁受損較輕。見圖1。

圖1 各組大鼠脛骨圖片（HE 染色，×20）

4 討論

臨床上骨轉(zhuǎn)移癌常以自發(fā)性骨痛和局部壓痛為首發(fā)癥狀，骨轉(zhuǎn)移引起的疼痛是骨轉(zhuǎn)移癌癥患者較早出現(xiàn)、常見、難忍受的癥狀之一，常伴隨功能障礙、病理性骨折等骨相關(guān)事件。目前臨床上對于骨癌痛的治療策略主要集中在放射治療和阿片類藥物，但阿片類藥物會引起一些嚴(yán)重的不良反應(yīng)，往往對治療效果和患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響，臨床仍需要積極尋找可持續(xù)替代的新藥[10]。近年來，中醫(yī)藥豐富的治療手段如湯劑內(nèi)服、中藥外敷、針灸、穴位注射等治療取得了良好的臨床療效，起效快，且不良反應(yīng)小，易被患者接受，在治療癌性軀體痛方面具有明顯優(yōu)勢[11-13]。

骨轉(zhuǎn)移屬中醫(yī)學(xué)“骨瘤”“骨蝕”“骨瘺瘡”“壞死”“骨痹”等范疇。明代《醫(yī)學(xué)入門》云：“腎主骨，勞傷骨水，不能榮骨而為腫曰骨瘤。”清代《外科證治書》曰：“有骨瘤，骨生，甚痛?！敝嗅t(yī)理論研究疼痛有虛實(shí)兩個方面，即“不通則痛”和“不榮則痛”，前者多因?qū)嵭圆±懋a(chǎn)物所致，后者多見于虛證。清代名醫(yī)吳謙在《醫(yī)宗金鑒·外科心法要訣·癭瘤》曰：“骨瘤尤宜補(bǔ)腎散堅(jiān)，行瘀利竅”。骨轉(zhuǎn)移癌疼痛的病機(jī)為腎陰不足，不能養(yǎng)髓生骨，脾氣不足，氣血不能濡養(yǎng)筋脈導(dǎo)致“不榮則痛”，加之氣滯、血瘀、痰凝、熱毒、寒凝等阻礙氣血運(yùn)行形成“不通則痛”。益腎骨康方具 有補(bǔ)腎健脾，解毒化瘀，滲濕消腫，抗癌止痛的功效，適用于骨轉(zhuǎn)移癌痛患者。

惡病質(zhì)常見的病因是惡性腫瘤，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，患者表現(xiàn)為進(jìn)行性消瘦，體質(zhì)量比原始體質(zhì)量（診斷時）下降≥7.5%，或體質(zhì)量指數(shù)＜80%，體質(zhì)量是評價放化療臨床獲益的重要指標(biāo)之一。本研究發(fā)現(xiàn)，對照組大鼠體質(zhì)量從建模前到建模后第 14 天呈持續(xù)增長趨勢，而各建模組大鼠從建模后第7 天開始體質(zhì)量持續(xù)降低，建模后第14 天，扶正組、低劑量組體質(zhì)量下降不明顯，扶正組拆方和低劑量組可緩解大鼠體質(zhì)量進(jìn)行性的下降。與模型組相比，各給藥組平均腫瘤體積有減小趨勢，說明各給藥 組在一定程度上可抑制腫瘤的進(jìn)展，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與個體差異較大有關(guān)。

惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，預(yù)防和減少骨質(zhì)破壞是其關(guān)鍵治療手段。本研究中從大鼠脛骨病理組織學(xué)上可以看出，模型組骨組織被嚴(yán)重破壞，腫瘤細(xì)胞彌漫浸潤骨髓腔，并向骨外侵襲，骨小梁受損明顯，骨皮質(zhì)破壞嚴(yán)重，出現(xiàn)骨皮質(zhì)變薄。解毒組及扶正組骨髓腔內(nèi)可見少量腫瘤細(xì)胞浸潤，骨小梁輕微破壞或完整，骨皮質(zhì)受損程度較模型組減輕。低劑量組及高劑量組骨皮質(zhì)較完整，骨髓腔內(nèi)可見腫瘤細(xì)胞灶狀浸潤，骨小梁受損較輕，其中解毒化瘀組和扶正組效果較明顯，說明解毒化瘀類中藥和扶正類中藥聯(lián)合運(yùn)用能夠協(xié)同發(fā)揮止痛和骨保護(hù)的作用。