曲木，唐子鵬，運永光，劉艷，翟勝利

（天津市金水族水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司 天津市水族動物功能性飼料企業(yè)重點實驗室，天津 301800）

錦鯉（Cyprinus carpioL.）源于中國，體色多樣，有“水中活寶石”之稱，歷經(jīng)多年的雜交選育，目前已成為我國養(yǎng)殖的主要觀賞魚種類之一。紅白錦鯉（Cyprinus carpio haematopterus）體表底色為白色，嵌有艷麗的紅色斑紋，是錦鯉的主流品系之一，深受人們的喜愛。錦鯉健康狀況會直接影響其觀賞價值，如果錦鯉免疫力低下或患某些疾病，其體色會變得暗淡。因此，研究錦鯉免疫力及消化酶活力很有必要。

乳酸菌（Lactic Acid Bacteria，LAB）是一類革蘭氏陽性桿菌或球菌、不形成芽胞、不運動、過氧化氫酶反應(yīng)呈陰性及對葡萄糖發(fā)酵能產(chǎn)生50%以上乳酸的細菌的總稱。乳酸菌在自然界中分布廣泛，是一種非常重要的益生菌，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中具有非常廣泛的應(yīng)用前景，可以改善水域環(huán)境、抑制有害微生物、提高機體免疫力及促進水產(chǎn)動物生長等[1]。

本試驗以紅白錦鯉為養(yǎng)殖對象，在飼料中添加不同水平的乳酸菌，探討乳酸菌對紅白錦鯉生長、免疫力、消化酶活性及體色的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試驗用乳酸菌（菌液活菌密度為2×109cfu/mL），河南君安生物科技有限公司；基礎(chǔ)飼料（粗蛋白含量32%），天津市晨輝飼料有限公司。

無水乙醇，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；酸性磷酸酶測定試劑盒、堿性磷酸酶測定試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶測定試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶測定試劑盒、總抗氧化能力測定試劑盒、丙二醛測定試劑盒、過氧化氫酶測定試劑盒、總超氧化物歧化酶測定試劑盒、脂肪酶測定試劑盒及α-淀粉酶測定試劑盒，南京建成生物工程研究所。

HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，力辰儀器科技有限公司；JP-020超聲波清洗機，潔盟清洗設(shè)備有限公司；TD5KR臺式冷凍離心機，長沙東旺實驗儀器有限公司；WH-2微型旋渦混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；Sky-1530酶標儀，Thermo公司；FA-1004電子分析天平，力辰儀器科技有限公司；UV-1800紫外分光光度計，翱藝儀器（上海）有限公司；JZ-350色差儀，深圳市金準儀器設(shè)備有限公司；FSH-2A可調(diào)高速勻漿機，常州市金壇友聯(lián)儀器研究所；BCD-196SMK（E）冰箱，美的集團股份有限公司。

1.2 試驗魚與養(yǎng)殖管理

以紅白錦鯉為養(yǎng)殖對象，選取規(guī)格一致、健康活潑的紅白錦鯉900尾，隨機分為6個組（其中5組為試驗組，1組為對照組），每組3個重復(fù)，每個重復(fù)50尾魚，養(yǎng)殖于18個規(guī)格為3 m×5 m×1 m的水泥池中。試驗開始前對試驗魚進行消毒處理，暫養(yǎng)一周后分組，基礎(chǔ)飼料訓(xùn)化2周后，開始正式試驗，養(yǎng)殖周期為8周。試驗期間養(yǎng)殖水體氨氮含量≤0.2 mg/L、亞硝酸鹽含量≤0.1 mg/L、pH=8.4，養(yǎng)殖期間平均水溫為19 ℃。飼料投喂時間為每日08:00與16:00，按照魚總重的2%稱重飼料后投喂。

1.3 飼料配方

將菌液按照體積分數(shù)0.25%、0.75%、2.25%、6.75%和20.25%溶入純水中，均勻噴灑基礎(chǔ)飼料（粗蛋白含量32%）表面，乳酸菌添加量分別為0.05×108cfu/g、0.15×108cfu/g、0.45×108cfu/g、1.35×108cfu/g和4.05×108cfu/g，所配制試驗飼料依次記為Diet 1、Diet 2、Diet 3、Diet 4和Diet 5，對照組噴灑相同體積的純水。試驗飼料在投喂前一天噴灑，在陰涼通風(fēng)處晾干，置于-20 ℃冰箱保存。

1.4 樣本采集及指標測定

1.4.1 樣本采集

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，取樣，每個重復(fù)取9尾魚，共27尾。血樣采集方法為尾靜脈采血，解剖后取肝胰臟、中腎、脾、肌肉和腸等組織，血液在冰浴條件下用離心機4 000 r/min離心15 min取其上清液，所取樣本于冰箱-20 ℃中冷凍保存。

1.4.2 指標測定

（1）生長指標測定。計算增重率、特定生長率、餌料系數(shù)、蛋白質(zhì)效率及肝體比等，具體公式為：

式中：WGR為增重率，%；SGR為特定生長率，%/d；FCR為飼料系數(shù)；PER為蛋白質(zhì)效率；HIS為肝體比，%；Mt為終末體重，g；M0為初始體重，g；t為試驗天數(shù)，d；F為飼料攝入量干重，g；CP為飼料粗蛋白質(zhì)含量，g；m為肝重，g。

（2）免疫指標及消化酶活性測定。免疫指標需要測定酸性磷酸酶（Acid Phosphatase，ACP）、堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，AKP）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Glutamic-Oxalacetic Transaminase，GOT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Glutamic-Pyruvic Transaminase，GPT）、總抗氧化能力（Total Antioxidant Capacity，T-AOC）、丙二醛（Malonaldehyde，MDA）、過氧化氫酶（Catalase,CAT）、總超氧化物歧化酶（Total Superoxide Dismutase，SOD）、脂肪酶（Lipase，LPS）和α-淀粉酶（α-Amyiase,α-AMS）10個指標，其中血清室溫融化后直接進行指標測定，按照組織∶0.85%生理鹽水=1∶4制成20%勻漿液，根據(jù)試劑盒測定需要在此基礎(chǔ)上進行稀釋，指標測定嚴格按照南京建成生物工程研究所所研制的試劑盒說明書進行。

（3）ΔL*、Δa*、Δb*值測定。養(yǎng)殖初始與養(yǎng)殖終末分別用色差儀測定紅白錦鯉紅斑處L*、a*、b*值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗各試驗組間差異顯著性，若差異達到顯著水平（P＜0.05），則進行Duncan氏法多重比較分析。試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差（±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉生長指標及肝體指數(shù)的影響

飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉生長指標及肝體指數(shù)的影響見表1。在所有處理中，紅白錦鯉增重率在Diet 1（乳酸菌水平為0.05×108cfu/g）飼料組達到最高，且顯著高于其他組（P＜0.05）；特定生長率在Diet 1組最高，與Diet 2（乳酸菌水平為0.15×108cfu/g）、Diet 3（乳酸菌水平為 0.45×108cfu/g）組無顯著性差異（P＞0.05），但顯著高于其他各組（P＜0.05）；餌料系數(shù)在Diet 2飼料組最低，與Diet 1、Diet 3飼料組差異不顯著（P＞0.05）；Diet 2飼料組蛋白質(zhì)效率顯著升高（P＜0.05）；肝體比在Diet 4（乳酸菌水平為1.35×108cfu/g）飼料組最低，且與Diet 1、Diet 5（乳酸菌水平為4.05×108cfu/g）飼料組差異不顯著（P＞0.05），但顯著低于其他飼料組（P＜0.05）。

表1 飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉生長指標及肝體指數(shù)的影響

2.2 飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉免疫力的影響

2.2.1 飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉ACP活性的影響

飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉ACP活性的影響見表2。在所有處理中，紅白錦鯉肝胰臟和血清中ACP活性在Diet 5飼料組最低，且顯著低于Diet 1、Diet 2飼料組（P＜0.05），但與其他飼料組差異不顯著（P＞0.05）；紅白錦鯉腎中ACP活性在Diet 4飼料組最低，且顯著低于Diet 1、Diet 2飼料組（P＜0.05），但與其他飼料組差異不顯著（P＞0.05）；紅白錦鯉脾中ACP活性在Diet 3飼料組最低，且與Diet 4、Diet 5飼料組差異不顯著（P＞0.05），但顯著低于其他飼料組（P＜0.05）。

表2 飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉ACP活性的影響

2.2.2 飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉AKP活性的影響

飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉AKP活性的影響見表3。在所有處理中，Diet 2飼料組紅白錦鯉肝胰臟中AKP活性顯著高于其他各組（P＜0.05）；中腎中AKP活性在Diet 1飼料組顯著升高（P＜0.05）；飼料乳酸菌水平對紅白錦鯉脾中AKP活性無顯著性影響（P＞0.05）；血清中AKP活性在Diet 1飼料組最低，且與Diet 4、Diet 5飼料組差異不顯著（P＞0.05），但顯著低于其他飼料組（P＜0.05）。

表3 飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉AKP活性的影響

2.2.3 飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉GOT、GPT活性的影響

飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉GOT、GPT活性的影響見表4。在所有處理中，紅白錦鯉肝胰臟中GOT活性在Diet 1飼料組達到最高，與Diet 2、Diet 3飼料組差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于其他飼料組（P＜0.05）；Diet 1飼料組血清中GOT活性顯著高于其他各組（P＜0.05）。錦鯉肝胰臟中GPT活性在Diet 1飼料組達到最高，與Diet 2飼料組差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于其他飼料組（P＜0.05）；Diet 2飼料組血清中GPT活性顯著高于其他各組（P＜0.05）。

表4 飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉GOT、GPT活性的影響

2.2.4 飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉T-AOC的影響

飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉T-AOC的影響見表5。在所有處理中，紅白錦鯉肝胰臟及脾中T-AOC在Diet 1飼料組達到最高，與Diet 2飼料組沒有顯著差異（P＞0.05），但顯著高于其他飼料組（P＜0.05）；中腎中T-AOC在對照組最高，且顯著高于其他各組（P＜0.05）；Diet 1飼料組紅白錦鯉血清中T-AOC顯著高于其他各組（P＜0.05）。

表5 飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉T-AOC的影響

2.2.5 飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉MDA含量的影響

飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉MDA含量的影響見表6。在所有處理中，紅白錦鯉肝胰臟中MDA的含量在Diet 1飼料組最低，且顯著低于Diet 3、對照組（P＜0.05），與其他飼料組差異不顯著（P＞0.05）；中腎中MDA的含量在Diet 1飼料組最低，與Diet 2、Diet 3飼料組差異不顯著（P＞0.05），但顯著低于其他飼料組（P＜0.05）；脾中MDA的含量在Diet 2飼料組最低，與Diet 3飼料組差異不顯著（P＞0.05），但顯著低于其他飼料組（P＜0.05）；血清中MDA的含量在Diet 2飼料組達到最低，且與Diet 1、Diet 4飼料組差異不顯著（P＞0.05），但顯著低于其他飼料組（P＜0.05）。

表6 飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉MDA含量的影響

2.2.6 飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉CAT活性的影響

飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉CAT活性的影響見表7。在所有處理中，紅白錦鯉脾中CAT活性在Diet 2飼料組達到最高，且顯著高于其他飼料組（P＜0.05）；中腎中CAT活性在Diet 2飼料組達到最高，與Diet 1飼料組差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于其他飼料組（P＜0.05）；血清中CAT活性在Diet 1飼料組達到最高，與Diet 2飼料組差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于其他飼料組（P＜0.05）。

表7 飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉CAT活性的影響

2.2.7 飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉SOD活性的影響

飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉SOD活性的影響見表8。在所有處理中，紅白錦鯉肝胰臟中SOD活性在Diet 2飼料組達到最高，且顯著高于其他飼料組（P＜0.05）；中腎SOD活性在Diet 2飼料組達到最高，且顯著高于Diet 3、對照組（P＜0.05）；脾中SOD活性在Diet 1飼料組達到最高，顯著高于Diet 5飼料組（P＜0.05），但與其他飼料組差異不顯著（P＞0.05）。

表8 飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉SOD活性的影響

2.3 飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉消化酶活性的影響

2.3.1 飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉LPS活性的影響

飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉LPS活性的影響見表9。在所有處理中，紅白錦鯉肝胰臟及中腎LPS活性在Diet 2飼料組最高，與Diet 5飼料組無顯著差異（P＞0.05），但顯著高于其他各組（P＜0.05）；Diet 2飼料組紅白錦鯉脾中LPS活性顯著高于對照組（P＜0.05），血清中LPS活性顯著高于其他各組（P＜0.05）；腸中LPS活性在Diet 2飼料組最高，且顯著高于Diet 1及Diet 3飼料組（P＜0.05）。

表9 飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉LPS活性的影響

2.3.2 飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉α-AMS活性的影響

飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉α-AMS活性的影響見表10。在所有處理中，紅白錦鯉肝胰臟、中腎、腸及血清中α-AMS活性在Diet 2飼料組達到最高，且顯著高于其他飼料組（P＜0.05）；脾中α-AMS活性在Diet 1飼料組達到最高，與Diet 2飼料組差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于其他飼料組（P＜0.05）。

表10 飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉α-AMS活性的影響

2.4 飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉體色的影響

飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉體色的影響見表11。在所有處理中，紅白錦鯉ΔL*值、Δb*值在Diet 1飼料組達到最高，顯著高于其他飼料組（P＜0.05）；Δa*值在Diet 3飼料組達到最高，與Diet 1飼料組差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于其他飼料組（P＜0.05）。

表11 飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉體色的影響

3 討論

3.1 飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉生長性能的影響

乳酸菌可以產(chǎn)生多種酶以分解不易吸收的大分子量蛋白質(zhì)，使水產(chǎn)動物的營養(yǎng)得到保證，同時可以降解飼料消化過程中產(chǎn)生的抗營養(yǎng)因子，提高動物的攝食率，在養(yǎng)殖水體中潑灑乳酸菌亦可有效提高幼魚的運動和攝食能力[2]。趙倩等[3]研究表明，添加乳酸菌可以促進草魚的生長，降低餌料系數(shù)，提高飼料利用率，同時增加其肥滿度。史東杰等[4]研究證明，添加含有乳酸菌的微生態(tài)制劑對錦鯉的生長有促進作用，增重率與特定生長率均顯著增加，且餌料系數(shù)顯著降低。SON等[5]研究證明，將乳酸菌添加到石斑魚飼料中投喂28 d后，石斑魚的增重率以及蛋白質(zhì)效率顯著提高。以上試驗結(jié)果均與本試驗結(jié)果相似，證明在飼料中添加不同水平的乳酸菌可以促進紅白錦鯉的生長，并降低餌料系數(shù)。相同的研究結(jié)果也見于石斑魚、草魚的研究中[6-7]。

3.2 飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉免疫指標的影響

目前，乳酸菌已經(jīng)被大量應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，其主要是通過乳酸菌菌體或其他代謝產(chǎn)物對腸道黏膜免疫的作用來在水產(chǎn)動物體內(nèi)發(fā)揮免疫增強作用。王永勝等[8]研究發(fā)現(xiàn)，使用乳酸菌飼喂凡納濱對蝦可使其血清、肌肉及肝臟中的SOD、AKP活性顯著高于對照組。王之怡等[9]研究了乳酸乳球菌Q-9胞外多糖對AKP、T-AOC、T-SOD、CAT活性及MDA含量的影響，發(fā)現(xiàn)鯉魚的AKP活性、MDA含量顯著降低，而T-AOC、T-SOD、CAT得到顯著提升。關(guān)素華等[10]采用擁擠試驗來研究德式乳酸桿菌對黃河鯉抗應(yīng)激能力的影響，發(fā)現(xiàn)添加乳酸菌組的黃河鯉在應(yīng)激前后SOD和CAT均顯著高于對照組，而MDA含量顯著降低。曾慶輝等[11]用德氏乳酸菌含量分別為0 cfu/g、1×105cfu/g、1×106cfu/g、1×107cfu/g和 1×108cfu/g的飼料飼喂黃河鯉，發(fā)現(xiàn)當乳酸菌含量為1×106～1×107cfu/g時黃河鯉皮膚黏液中AKP、SOD、CAT、T-AOC活性均顯著高于對照組，同時MDA含量顯著降低。鄭玉[6]發(fā)現(xiàn)在飼料中加入適量的乳酸菌可以顯著提高棕點石斑魚以及凡納濱對蝦體內(nèi)ACP和AKP的活性。本試驗測定了紅白錦鯉組織及血清中ACP、AKP、GOT、GPT、T-AOC、MDA、CAT和SOD八個指標，發(fā)現(xiàn)乳酸菌添加量為0.05×108～0.15×108cfu/g時，紅白錦鯉免疫指標達到最佳。

3.3 飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉消化酶活性的影響

消化酶是魚體消化過程的重要代謝酶，其中脂肪酶和淀粉酶分別代表了魚體對脂肪及糖類的消化利用能力。王穎等[7]研究發(fā)現(xiàn)在草魚飼料中添加2%富含枯草芽孢桿菌、乳酸菌及酵母菌的微生態(tài)制劑可以顯著提高草魚中腸淀粉酶和脂肪酶活性，并且可以豐富腸道菌群種類，提高有益菌數(shù)量；林艾影等[12]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌可以顯著提高軍曹魚幼魚腸道內(nèi)α-AMS及LPS的活性，這與本試驗結(jié)果相同?，F(xiàn)有的乳酸菌對養(yǎng)殖動物消化酶活性及腸道菌群影響的研究多集中于肉雞等食用動物，在水產(chǎn)品養(yǎng)殖方面的研究較少，其相關(guān)作用機理還需進一步研究。

3.4 飼料不同乳酸菌水平對紅白錦鯉體色的影響

體色是反映紅白錦鯉外表是否美觀的重要指標，但有關(guān)于乳酸菌對動物體色的影響還未見報道。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，在乳酸菌添加量為0.05×108cfu/g時，紅白錦鯉各色度值均顯著高于其他試驗組，因此紅白錦鯉飼料中乳酸菌的建議添加量為0.05×108cfu/g。

4 結(jié)論

在本試驗條件下，由試驗結(jié)果可得出以下結(jié)論。（1）乳酸菌的添加量為0.05×108～0.15×108cfu/g時，紅白錦鯉生長指標達到最佳，在該添加量下可提高紅白錦鯉增重率、蛋白質(zhì)效率及特定生長率，同時降低餌料系數(shù)，促進了紅白錦鯉的增長。（2）乳酸菌的添加量為0.05×108～0.15×108cfu/g時，紅白錦鯉免疫指標達到最佳，提高了紅白錦鯉的抗氧化能力。（3）乳酸菌的添加量為0.15×108cfu/g時，紅白錦鯉組織及血清中消化酶活性顯著提高。（4）乳酸菌的添加量為0.05×108cfu/g時紅白錦鯉紅斑處ΔL*、Δb*值最高，添加量為0.45×108cfu/g時紅白錦鯉紅斑處Δa*值最高，但與0.05×108cfu/g無顯著差異。

綜上所述，在本試驗條件下，紅白錦鯉飼料中乳酸菌的最適添加量為0.05×108～0.15×108cfu/g。