顧恰敏，趙傳欣，劉敏,3*，陳高云，李丹

（1.陸軍防化學院，北京 102205；2.66072部隊，北京 100041；3.國民核生化災害防護重點實驗室，北京 102205）

神經(jīng)性毒劑對人類和社會有極大的危害，沙林作為經(jīng)典的神經(jīng)性毒劑，殺傷速度快、致死率高，尋找到能夠高效降解神經(jīng)性毒劑尤其是降解沙林的方法具有重要的現(xiàn)實意義。有機磷水解酶（Organophosphorus Hydrolase，OPH）廣泛用于生物降解有機磷神經(jīng)毒劑和生物技術洗消有機磷農(nóng)藥殘留。OPH是一種最初從黃桿菌屬和缺陷假單胞菌中分離純化得到的酯酶[1-2]。OPH由有機磷水解酶基因（opd）編碼，廣泛存在于多種生物體內(nèi)，具有較寬的底物范圍，能夠斷裂P-O、P-S、P-F和P-CN等化學鍵[3]。這種酯酶可以水解包括有機磷神經(jīng)性毒劑（如沙林、梭曼等）和對氧磷、對硫磷、甲基對硫磷等廣泛使用的殺蟲劑在內(nèi)的有機磷酸酯類化合物。傳統(tǒng)降解有機磷酸酯類化合物多采用化學法，即利用“三合二”等強氧化性物質(zhì)催化水解。此類化合物大多具有強酸或強堿性，腐蝕性高，不適用于環(huán)境和精密儀器的洗消。酶類水解有機磷酸酯類化合物反應條件溫和、無二次污染，對環(huán)境污染修復和保障人員健康具有重大意義。有機磷水解酶是一種公認的在處理有機磷酸酯類化合物方面很有前景的酶。但野生的有機磷水解酶活性不高、分泌表達不理想，不能滿足實際應用的需要。本文通過蛋白質(zhì)工程技術設計改良有機磷水解酶的結構和表達方式，尋找更加高效、廣譜、經(jīng)濟和環(huán)保的降解有機磷酸酯類化合物的手段。

本文選用枯草芽孢桿菌表達體系分泌表達有機磷水解酶，以解決其在天然生物體中存在的產(chǎn)量低、純化困難等問題?？莶菅挎邨U菌是一種安全性高、遺傳背景清晰、便于基因工程改造的革蘭氏陽性研究模式菌[4]，其無密碼子偏愛性[5]，多種外源基因都可以高效翻譯表達[6]，且對培養(yǎng)要求簡單、操作方便。通用的大腸桿菌表達體系易形成無活性的包涵體[7]，而枯草芽孢桿菌具有很強的蛋白分泌能力，可以將外源性的蛋白直接分泌到胞外且具有生物活性，這對蛋白質(zhì)的后期純化與實際使用有著重要的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌RIK1285（Bacillus subtilis）、載體pBE-S、有機磷水解酶基因及突變體，防化學院生物實驗室保存；沙林（Sarin，GB）純品，防化學院生物實驗室儲存。

質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒、NdeⅠ內(nèi)切酶、PstⅠ內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA Marker及蛋白Marker，均采購自天根生化科技（北京）有限公司；NTA金屬螯合親和層析介質(zhì)，購自中科森輝微球技術（蘇州）有限公司。

1.1.2 儀器與設備

BSC-1000II超凈工作臺，蘇州博萊爾凈化設備有限公司；SynergyHTX/2/H1多功能微孔板檢測儀，美國伯騰儀器有限公司；2720型PCR儀，美國應用生物系統(tǒng)公司；SPX智能生化培養(yǎng)箱，寧波海曙賽福實驗儀器廠；LX-B立式壓力蒸汽滅菌器，合肥華泰醫(yī)療設備有限公司；CR22G高速冷凍離心機，日本日立有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基配方

LB培養(yǎng)基（1 L）：氯化鈉10 g，酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，pH值為7.4（加2%瓊脂即為固體培養(yǎng)基）。

10×最低鹽溶液（100 mL）：14 g K2HPO4，6 g KH2PO4，2 g (NH4)2SO4，1 g檸檬酸鈉（Na3C6H5O7·2H2O），0.2 g MgSO4·7H2O。

SPⅠ培養(yǎng)基：2 mg/mL L-色氨酸2.5 mL，10%酵母溶液1 mL，5%水解酪蛋白溶液0.4 mL，50%葡萄糖溶液1 mL，1×最低鹽溶液95 mL。

SPⅡ 培 養(yǎng) 基：2 mg/mL L-色 氨 酸 0.5 mL，0.5 mol/L MgCl2溶液0.5 mL，0.1 mol/L CaCl2溶液0.5 mL，10%酵母溶液0.04 mL，5%水解酪蛋白溶液0.08 mL，50%葡萄糖溶液1 mL，1×最低鹽溶液97.5 mL。

1.2 實驗方法

1.2.1 構建蛋白表達質(zhì)粒pBE-S-opd

根據(jù)載體pBE-S圖譜，選擇酶切位點，設計His標簽在C端的引物，擴增野生型有機磷水解酶基因（opd）和含有H254R-H257Y-L303T突變位點的有機磷水解酶基因（RYT-opd）。引物序列片段見表1。

表1 引物序列片段

1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段。雙酶切載體pBE-S和擴增產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳后，回收酶切的質(zhì)粒和目的基因片段。用T4連接酶將目的基因片段連接到pBE-S中，轉化E.coliDH5α后，涂板含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板，過夜培養(yǎng)后，挑取陽性單克隆，用含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基平板，搖12 h后，提取質(zhì)粒，對連入的目的基因進行測序驗證，保存測序正確的單克隆質(zhì)粒。

我把習慣上課回頭的學生請到身邊，告訴他我的所見：“我總是看到你上課扭過頭來，后面的人并不理你啊，怎么回事呢？”我以為他會說課聽不進去，想跟后面的人講話。結果他說：“啊？我不知道，可能是習慣了。”扭頭只是他的慣性動作，他潛意識里壓根兒不知道自己扭頭了。

1.2.2 轉化B. subtilis RIK1285感受態(tài)細胞

在LB平板上劃線活化RIK1285，放入37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取活化的菌斑到2 mL液體LB培養(yǎng)基，28 ℃搖培16 h。取50 μL菌液到5 mL的SPⅠ培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)至菌體生長至對數(shù)期。將pBE-S-opd質(zhì)粒轉化到RIK1285感受態(tài)細胞剛穩(wěn)定期。取0.5 mL的菌體到4.5 mL SPⅡ培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)90 min。加入50 μL的100 mmol/L乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸在37 ℃搖培5～10 min。將培養(yǎng)基按300 μL/支分裝至10 mL圓底離心管。加入1 μg質(zhì)粒DNA至1支分裝的感受態(tài)細胞中，在30 ℃搖培90 min，然后涂板含10 μg/mL的卡那霉素（Ka）LB培養(yǎng)基，放入37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取單克隆，37 ℃搖菌后，保存菌種，并用于后續(xù)實驗。

1.2.3 OPH的分泌表達和收集

將轉化后的RIK1285-pBE-S-opd株從-80 ℃冰箱取出，在LB+Ka（10 μg/mL）的平板劃線，放入37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜。挑取平板上長好的單克隆，至600 mL LB液體培養(yǎng)基（1 L三角瓶，加入終濃度為10 μg/mL的Ka抗生素），放入37 ℃，180 r/min的搖床培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)好的菌液倒入500 mL離心瓶中（分2個離心瓶收集，每瓶250 mL菌液），配平后，8 000 r/min、25 ℃離心15 min，小心地將上清倒入干凈的1 L三角瓶中，將沉淀棄掉。OPH分子量約為36 kD，將上清液用截留分子量為10 kD的超濾濃縮管在4 ℃，4 000 r/min離心濃縮至150 mL。

1.2.4 分泌蛋白的鎳柱純化

將總容積為20 mL的蛋白純化柱固定在鐵架臺后，將NTA金屬螯合親和層析介質(zhì)從4 ℃冰箱中取出顛倒混勻，取出5 mL NTA金屬螯合親和層析介質(zhì)，加入蛋白純化柱柱底，取下柱子下方的止水塞，將NTA金屬螯合親和層析介質(zhì)中的乙醇沿重力自然流干，沿柱面輕輕加入15 mL裂解緩沖液，沿重力流干，然后再重復一次。分次將裂解的上清蛋白液輕輕沿柱面加入，重力過柱；沿柱面輕輕加入15 mL沖洗緩沖液1，沿重力流干；分別使用15 mL沖洗緩沖液2沖洗2次，15 mL沖洗緩沖液3沖洗2次；沿柱面分3次，輕輕加入15 mL洗脫緩沖液，收集流出液，即為純化的蛋白。用ddH2O將截留分子量為10 kD的蛋白超濾濃縮管清洗2次，然后將蛋白加入到超濾管中，4 000 r/min、4 ℃離心約30 min，將蛋白濃縮至1.5 mL。

1.2.5 純化蛋白濃度測定

考馬斯亮藍法：將2 mg/mL的BSA蛋白標準品梯度稀釋后，向每個標準品中加入1 mL考馬斯亮藍蛋白濃度測定液；同樣取20 μL待測樣品，加入1 mL考馬斯亮藍染液，混勻后，吸出200 μL至平底透明96孔板中，檢測595 nm下的吸光值。

1.2.6 重組有機磷水解酶的活性測定

沙林標準曲線的繪制：稱取100 μg/mL的沙林標準液 0 μL、50 μL、100 μL、150 μL、200 μL 和250 μL，分別加入 0.01 mol/L PBS 溶液至 500 μL，再依次加入125 μL丙酮、125 μL 0.5%聯(lián)苯胺水溶液和500 μL 0.25%過硼酸鈉水溶液。測定406 nm處的吸光值。

聯(lián)苯胺定量法檢測酶活：過硼酸鈉在堿性水中分解出過氧化氫，過氧化氫與G類毒劑作用生成過氧磷酸，此過氧磷酸有強的氧化能力，能氧化聯(lián)苯胺生成有色的偶氮染料，并在波長406 nm處有特異吸收峰，檢測樣品在406 nm處的吸光值，進而計算剩余沙林的含量和酶的活性。

反應體系（1.25 mL）：0.01 mol/L PBS溶液稀釋酶液使蛋白質(zhì)濃度一致；取250 μL稀釋后酶液加入250 μL 100 μg/mL沙林，室溫反應5 min后，依次加入125 μL丙酮、125μL 0.5%聯(lián)苯胺水溶液和500 μL 0.25%過硼酸鈉水溶液，測定吸光值并計算剩余沙林含量和酶的活性。將每分鐘每毫克蛋白酶降解的沙林毫克數(shù)定義為有機磷水解酶的酶活單位。實驗重復3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

BIOVIA Discovery Studio 2020 蛋白模擬軟件。由NCBI數(shù)據(jù)庫中查找野生型OPH結構，導入BIOVIA Discovery Studio后，修改OPH關鍵位置氨基酸，建模有機磷水解酶突變體結構，生成結構示意圖，分析有機磷水解酶突變體的性質(zhì)。

2 結果與分析

2.1 含有機磷水解酶基因的枯草芽孢桿菌

根據(jù)1.2.1及1.2.2構建含有機磷水解酶基因的枯草芽孢桿菌重組菌株，所獲得的菌株提取質(zhì)粒，經(jīng)鑒定其基因序列與預期一致。質(zhì)粒利用NdeⅠ和PstⅠ水解酶雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳圖見圖1。

圖1 質(zhì)粒雙酶切凝膠電泳圖

2.2 有機磷水解酶蛋白濃度

根據(jù)1.2.5繪制蛋白曲線并確定純化后的有機磷水解酶濃度。根據(jù)表2可得，蛋白的標準曲線方程為y=1.764 6x+0.002 6，相關系數(shù)R2=0.998。

表2 標準蛋白溶液吸光度

純化后野生型有機磷水解酶的蛋白濃度為0.461 mg/mL，含有H254R-H257T-L303Y突變位點的有機磷水解酶突變體的蛋白濃度為0.429 mg/mL。

2.3 有機磷水解酶水解沙林活性測定

根據(jù)1.2.6方法繪制沙林標準曲線，根據(jù)表3可得，沙林的標準曲線方程為y=0.003 2x+0.061 2，相關系數(shù)R2=0.995。

表3 沙林標準溶液吸光度

根據(jù)1.2.6測試枯草芽孢桿菌分泌表達的有機磷水解酶水解沙林的酶活性，實驗結果見表4。5 min時，野生型有機磷水解酶對沙林的水解率為42.72%，酶活為 0.407 mg/（min·mg）。含有 H254R-H257YL303T突變位點的有機磷水解酶突變體對沙林的水解率為82.88%，酶活為0.790 mg/（min·mg），酶活提高了94.1%。實驗表明，枯草芽孢桿菌所分泌表達的有機磷水解酶具有較好的酶活性，并且H254RH257Y-L303T三個突變位點聯(lián)合突變，顯著提高了有機磷水解酶降解沙林的能力。

表4 野生型有機磷水解酶和突變體水解沙林的能力

2.4 有機磷水解酶結構分析

通過BIOVIA軟件對有機磷水解酶的結構進行分析，結構見圖3。發(fā)現(xiàn)H254R-H257Y-L303T突變體的能量低于野生型有機磷水解酶，推測突變體的蛋白結構更加穩(wěn)定，這對有機磷水解酶的儲存、活性保持和熱穩(wěn)定性均有著積極的意義，是一種理想的突變方式。

圖3 含H254R-H257Y-L303T突變位點的有機磷水解酶

3 結論

本研究成功構建了枯草芽孢桿菌分泌表達有機磷水解酶的表達體系，將有機磷水解酶基因插入pBE-S載體后轉入枯草芽孢桿菌中。重組枯草芽孢桿菌表達體系培養(yǎng)48 h，通過超濾濃縮和鎳柱純化后，有機磷水解酶濃度為0.4 mg/mL。本研究構建的枯草芽孢桿菌分泌表達體系使得有機磷水解酶的獲得和純化更為簡易快捷，為后續(xù)有機磷水解酶的實際應用和工業(yè)生產(chǎn)提供了一定的基礎。

本研究在分泌表達野生型有機磷水解酶的基礎上，選擇了一種含有H254R-H257Y-L303T三個位點聯(lián)合突變的有機磷水解酶突變體進行表達，并比較了突變體和野生型水解神經(jīng)性毒劑沙林的水解效果。結果表明，5 min時，含有H254R-H257Y-L303T突變位點的有機磷水解酶突變體對沙林的水解率為82.88%，酶活為0.790 mg/（min·mg），比野生型有機磷水解酶的酶活提高了94.1%。H254R-H257YL303T三個位點聯(lián)合突變是本課題組在前期單點突變的基礎上構建的新突變組合。其中，H254和H257位點處于OPH的活性中心大疏水口袋（H254、H257和L271），通過分析蛋白質(zhì)結構，將極性帶正電荷且親水的組氨酸突變?yōu)榫彼岷蜆O性不帶電荷且疏水的酪氨酸，這可能改變了疏水口袋的電荷情況并使疏水口袋的疏水性得到加強，促進了該口袋結構與底物分子取代基的作用。303位點處于小疏水口袋（M317、G60、I106、L303和S308），雖然在前期實驗中，L303位點非極性的亮氨酸突變?yōu)闃O性的蘇氨酸后，水解酶的水解能力受到抑制，但當H254R-H257Y與L303T聯(lián)合突變，水解酶的水解能力得到了明顯促進作用，這可能是因為H254R-H257Y與L303T聯(lián)合突變同時改變了大小口袋，促進沙林水解鍵位的斷裂和官能團的去除。

本實驗構建了枯草芽孢桿菌分泌表達有機磷水解酶的表達體系并驗證了所表達的有機磷水解酶具有良好的活性。分泌表達了含有H254R-H257YL303T三點突變的有機磷水解酶突變體，一定程度提高了野生型有機磷水解酶水解沙林的能力，表明改變有機磷水解酶的活性中心位點的氨基酸種類能夠有效的影響其酶活性。后續(xù)研究中，可以結合蛋白質(zhì)空間結構分析，篩選出更多的影響較大的活性位點和更加合理的突變氨基酸種類，以期找到更優(yōu)的重組型和分泌表達體系。隨著科研探索的逐漸深入，期望獲得性能優(yōu)良、底物范圍廣、實用價值高的水解酶，并能夠將這些新型降解工具從實驗室向實際應用推廣，為降解神經(jīng)性毒劑和殺蟲劑等有機磷酸酯類化合物提供一個高效、經(jīng)濟、綠色、環(huán)保的新手段。