張梅 楊燕 盛鵬 顧曉穎

摘? ? 要：細(xì)胞若是受到損壞，會(huì)破壞細(xì)胞區(qū)隔作用，同時(shí)氧化物醌類(lèi)物質(zhì)和毒性酚類(lèi)物質(zhì)均會(huì)使組織發(fā)生褐變，使植物組織培養(yǎng)失敗。在組織培養(yǎng)中，褐變情況是由外植體材料、生理狀態(tài)、培養(yǎng)條件等因素共同決定的，對(duì)此可實(shí)施低溫培養(yǎng)、添加抗氧化劑、勤轉(zhuǎn)瓶的方式把控褐變。文章主要闡述植物組織培養(yǎng)中褐化現(xiàn)象控制方法，以供參考。

關(guān)鍵詞：植物;組織培養(yǎng);褐化現(xiàn)象;控制方法

文章編號(hào)：1005-2690（2022）03-0091-03? ? ? ?中國(guó)圖書(shū)分類(lèi)號(hào)：Q943.1? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

植物組織培養(yǎng)主要應(yīng)用在種質(zhì)資源保存、無(wú)病毒苗木培育和植物離體快繁等內(nèi)容中，但也會(huì)有培養(yǎng)物或者外植體褐化現(xiàn)象。褐化屬于植物組織培養(yǎng)的現(xiàn)象，決定組織培養(yǎng)的最終結(jié)果。因此要結(jié)合實(shí)際情況制訂不同的解決措施，同時(shí)在實(shí)踐中進(jìn)行探索，找到理想化的防褐方法，以便于實(shí)現(xiàn)最佳效果。

1 褐化相關(guān)概述

褐化現(xiàn)象是指在植物組織培養(yǎng)中，外植體由于自身分泌的酚類(lèi)化合物的影響導(dǎo)致外植體褐變褐化，是植物組織培養(yǎng)中一種常見(jiàn)的現(xiàn)象，直接影響到組織培養(yǎng)能否取得成功。多酚氧化酶氧化為醌類(lèi)物質(zhì)，使酶的活性受到抑制，培養(yǎng)材料無(wú)法正常生長(zhǎng)，甚至?xí)霈F(xiàn)死亡。探究外植體褐化可知，褐化作用根據(jù)生物基發(fā)生機(jī)制可劃分為兩種：非酶促褐化和酶促褐化。酶促褐變是植物組織培養(yǎng)中產(chǎn)生的褐化現(xiàn)象，多數(shù)是由酶促褐變所引發(fā)，常見(jiàn)的是多酚氧化酶，在天然底物酚類(lèi)物質(zhì)下產(chǎn)生。通常情況下，細(xì)胞中含有的醌類(lèi)和酚類(lèi)物質(zhì)，兩種物質(zhì)處于動(dòng)態(tài)平衡。醌類(lèi)物質(zhì)水平低，氧化酶和底物會(huì)在細(xì)胞的各部位平分，酚類(lèi)物質(zhì)在細(xì)胞的液泡內(nèi)分布，而酶儲(chǔ)存于細(xì)胞質(zhì)和其他質(zhì)體內(nèi)，此種區(qū)域性分布質(zhì)膜會(huì)將酶和底物分開(kāi)。培養(yǎng)材料和外植體會(huì)分布在細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞衰老區(qū)域中，會(huì)損壞釋放或合成的氧化酶，若是此時(shí)的溫度和pH值合適，則酚類(lèi)物質(zhì)和酚氧化酶會(huì)有酶促氧化反應(yīng)出現(xiàn)，形成棕褐色醌類(lèi)物質(zhì)，進(jìn)而產(chǎn)生褐變。同時(shí)組織病變或老化，也會(huì)使酚氧化酶出現(xiàn)激活，而產(chǎn)生褐變。

非酶促褐變指的是細(xì)胞由于受到脅迫等不利條件因素的影響，使細(xì)胞出現(xiàn)了死亡或程序化死亡的情況，此種情況便會(huì)出現(xiàn)褐變，不會(huì)產(chǎn)生酚類(lèi)物質(zhì)，這些不利條件均會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生程序化的死亡，因此要實(shí)施有效措施，確保愈傷組織不會(huì)發(fā)生褐變。

深入探究酶和底物，進(jìn)而研究酶促反應(yīng)體系。在組織培養(yǎng)中，酚類(lèi)物質(zhì)含量和褐化率有直接關(guān)系，酚類(lèi)物質(zhì)若是在正常的植物組織發(fā)育時(shí)，不會(huì)有褐變出現(xiàn)。

2 褐化影響因素

在植物組織培養(yǎng)中，經(jīng)常會(huì)有褐化現(xiàn)象產(chǎn)生。植物材料出現(xiàn)褐變因素多種多樣，要注意以下幾點(diǎn)內(nèi)容。

2.1 培養(yǎng)基組成

培養(yǎng)基成分決定培養(yǎng)外植體的褐變與集合化程度。第一，激素類(lèi)型和濃度比例。培養(yǎng)基中褐變受植物生長(zhǎng)的類(lèi)型、濃度影響，培養(yǎng)基中的激素類(lèi)型搭配不同，褐化程度也存在差異。細(xì)胞分裂素的物質(zhì)會(huì)使褐化產(chǎn)生，生長(zhǎng)素也能延緩酚類(lèi)物質(zhì)的合成，避免發(fā)生褐化。培養(yǎng)基中激素濃度高，也會(huì)加速褐化的產(chǎn)生。培養(yǎng)過(guò)程中雜質(zhì)較多的白糖會(huì)有嚴(yán)重的褐化，甚至出現(xiàn)死亡，而化學(xué)蔗糖純度較高，褐化率低。由此可知，以葡萄糖作為碳源開(kāi)展的培養(yǎng)工作，能避免發(fā)生褐化。因此，糖類(lèi)也會(huì)使褐化受到影響，培養(yǎng)基中的附加成分也影響褐化產(chǎn)生。若是發(fā)現(xiàn)有谷氨酰胺或水解酪，則對(duì)褐化產(chǎn)生有利。第二，無(wú)機(jī)鹽的含量和類(lèi)型。在培養(yǎng)基中，無(wú)機(jī)鹽的濃度和類(lèi)型影響外植體生長(zhǎng)，因此培養(yǎng)基中含有的無(wú)機(jī)物可能是氧化酶合成所必備的。若是無(wú)機(jī)鹽濃度高，則會(huì)使外植體酚類(lèi)外溢出現(xiàn)氧化，加速產(chǎn)生褐化的效率。由此可知，鹽分大，褐化程度高，外植體在各培養(yǎng)基上出現(xiàn)褐化不同[1]。

2.2 外植體情況

第一，材料大小。材料的年齡與組織影響褐化程度，如果外植體老化程度高，會(huì)提高木質(zhì)素含量，容易產(chǎn)生褐化，因此外植體成齡材料要比幼齡材料的褐化程度高，使用桑樹(shù)基部的幼芽褐化程度低于上部的枝條壯芽褐化程度，外植體產(chǎn)生的褐化程度輕，幼齡樹(shù)產(chǎn)生的褐化率低。時(shí)間短的材料，組織培養(yǎng)容易成功，時(shí)間長(zhǎng)的材料，植物胚需要完整接種胚珠，避免隨著成熟度的上升，加重褐化程度。外植體大小影響褐化性，主要是材料越小越容易有褐化產(chǎn)生;材料大，則產(chǎn)生的褐化程度輕。切口大，酚類(lèi)物質(zhì)容易被氧化，加速褐化的程度。而植物莖尖越短，褐化越嚴(yán)重，植物莖尖越長(zhǎng)，褐化程度越輕。第二，取材的位置和時(shí)間。植物酚類(lèi)化合物，多酚氧化酶的活性在各季節(jié)有不同變化，通常情況下，生長(zhǎng)季節(jié)酚類(lèi)化合物含量多，活性高。冬季褐化率低，而夏季和秋季會(huì)加速褐化產(chǎn)生，接種后存活率較低。而6月和9月屬于植物生長(zhǎng)的旺盛期，會(huì)加速褐化率。在取材位置上可發(fā)現(xiàn)，幼嫩莖枝通常不會(huì)有褐化產(chǎn)生，而木質(zhì)化程度高的位置在使用藥劑處理會(huì)加速褐化的產(chǎn)生。第三，消毒情況。在接種時(shí)，化學(xué)消毒劑會(huì)傷害到外植體，從而引發(fā)褐化，消毒劑和消毒時(shí)間存在差異，外植體也會(huì)出現(xiàn)不同程度的傷害，甚至?xí)泻只霈F(xiàn)。消毒時(shí)間長(zhǎng)、效果好，但會(huì)產(chǎn)生褐變。消毒時(shí)間長(zhǎng)，褐化效率高，只有將消毒時(shí)間需要控制在合理范圍內(nèi)，才能使外植體成活率得到保證。消毒后使用磁力攪拌器，將材料充分清洗，有效減輕褐化[2]。

2.3 培養(yǎng)條件

第一，溫度。溫度高會(huì)加速發(fā)生褐化，高溫下能夠增加酶的活性，使酚類(lèi)物質(zhì)出現(xiàn)氧化，導(dǎo)致外植體褐化。由試驗(yàn)可知，高溫培養(yǎng)能使褐化率接近53%。低溫條件下，褐化率接近30%。

第二，光照。光照強(qiáng)度影響褐化的情況以及褐化發(fā)生的概率。外植體褐化在黑暗情況下比較嚴(yán)重，在光照的情況下，外植體褐化輕。黑暗情況下，培養(yǎng)產(chǎn)生的褐化晚，程度輕。若是光強(qiáng)小于標(biāo)準(zhǔn)要求，會(huì)加速外植體產(chǎn)生的褐變，則植株會(huì)出現(xiàn)褐化情況，這是由于光照少，減少外植體的生理活力，加速了褐化程度。因此光強(qiáng)培養(yǎng)能減少外植體褐化率，各光照下產(chǎn)生的褐化程度也存在著差異。

第三，培養(yǎng)時(shí)間。培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短影響褐化的情況。由實(shí)踐可知，轉(zhuǎn)瓶時(shí)間早和晚影響褐化率。15 d轉(zhuǎn)瓶1次，會(huì)保證莖正常生長(zhǎng)并且色澤正常。同時(shí)培養(yǎng)基中不會(huì)有渾濁物出現(xiàn)。若是25 d轉(zhuǎn)瓶1次，則植株體顏色暗淡，甚至培養(yǎng)基會(huì)有渾濁物出現(xiàn)。30 d轉(zhuǎn)瓶1次，會(huì)使植株的顏色暗沉，生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)基渾濁，甚至?xí)尫判鯛钗铮饾u朝四周擴(kuò)散。由試驗(yàn)可知，甘蔗愈傷組織會(huì)誘導(dǎo)分化苗，在培養(yǎng)過(guò)程中加速褐化率[3]。

2.4 基因型

植物中酚類(lèi)化合物包含的數(shù)量以及酶類(lèi)的活性存在差異，各植物出現(xiàn)褐化的程度以及次數(shù)也不同。木本植物酚類(lèi)化合物含量高于草本植物。在開(kāi)展組織培養(yǎng)的過(guò)程中會(huì)發(fā)現(xiàn)，木本植物發(fā)生褐化率高，相同植物不同品種和類(lèi)型出現(xiàn)的褐化也存在差異。比如探究柳桉莖段容易產(chǎn)生褐化，雜交莖段會(huì)產(chǎn)生較輕的褐化情況，并且植物組織培養(yǎng)中的材料或外植體出現(xiàn)褐化，也是導(dǎo)致培養(yǎng)過(guò)程失敗的因素之一。材料的生理狀態(tài)影響接種后褐化的情況，在探究核桃組織培養(yǎng)中可知，若是外植體的木質(zhì)化程度高，會(huì)加速產(chǎn)生褐化。在培養(yǎng)材料時(shí)，褐化程度和多酚氧化酶的活性有著直接聯(lián)系[4]。

2.5 培養(yǎng)基形態(tài)

液體培養(yǎng)基能減小發(fā)生外植體褐化率，但是對(duì)于液體培養(yǎng)基有著嚴(yán)格要求，培養(yǎng)流程煩瑣，并且對(duì)培養(yǎng)基硬度也有一定要求。培養(yǎng)基硬度大，會(huì)降低褐化率，培養(yǎng)基硬度小，會(huì)加速褐化的程度。培養(yǎng)基硬度決定擴(kuò)散酚類(lèi)物質(zhì)的效率，外植體受傷害程度分為藥劑傷害、機(jī)械傷害和培養(yǎng)基傷害，這些因素均影響褐化的情況，同時(shí)滅菌時(shí)間也影響外植體褐化率。酸性環(huán)境使褐變過(guò)程受到影響，硬度低的蒸餾水會(huì)使褐化嚴(yán)重，甚至?xí)兴劳銮闆r出現(xiàn)，此些情況均使配制培養(yǎng)基水發(fā)生了改變，使培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽的濃度出現(xiàn)改變，讓植物外植體褐化受到影響[5]。

3 控制組織培養(yǎng)褐化措施

3.1 選擇合適的材料

外植體的分生能力強(qiáng)，通常在合適的細(xì)胞分化培養(yǎng)條件下，外植體能達(dá)到旺盛狀態(tài)，進(jìn)而減輕褐化的情況。由此可知，選擇植株材料最好是幼齡材料，選擇植株的部位也要適當(dāng)，保證材料中含有少量的酚類(lèi)物質(zhì)，避免出現(xiàn)褐化狀態(tài)。在培養(yǎng)胚離體時(shí)，將胚珠取出，并且將植株部位剝?nèi)ミM(jìn)行接種，能有效避免褐化情況產(chǎn)生[6]。

3.2 預(yù)處理外植體和母株

第一，實(shí)施黑暗預(yù)處理。母株可使用遮光處理法降低褐化情況，從而培養(yǎng)母株萌發(fā)。比如在培養(yǎng)時(shí)，可發(fā)現(xiàn)外植體相同，完成培養(yǎng)結(jié)束后，重度遮光下的褐化率為60%，而自然光照褐化率為88%，輕度遮光處理下的褐化率為80%。在培養(yǎng)桉樹(shù)時(shí)，可收集碎條使用黑色塑料袋遮蓋枝條，避免光線(xiàn)照射，從而降低外植體誘導(dǎo)的褐化率。比較誘導(dǎo)試驗(yàn)可知，褐化率降低了20%。第二，實(shí)施低溫預(yù)處理工作。低溫預(yù)處理工作能避免褐化產(chǎn)生。蘋(píng)果與核桃外植體若是在5 ℃下開(kāi)展低溫預(yù)處理，則能減輕褐化發(fā)生的情況。而紅豆杉在45 ℃下實(shí)施預(yù)處理，能有效克服褐化的情況。

第三，預(yù)培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)能減少酚類(lèi)物質(zhì)的毒害，同時(shí)能收集莖芽，并且在液體培養(yǎng)基上先培養(yǎng)3 d，然后再使用半固體培養(yǎng)基開(kāi)展培養(yǎng)工作，核桃外植體在含有蔗糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d[7]。

3.3 選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基

第一，需要將培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)離子類(lèi)型和濃度進(jìn)行調(diào)整。在改良誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，未經(jīng)過(guò)改良的培養(yǎng)基效果更好，同時(shí)也會(huì)降低褐化死亡率。使用改良后的培養(yǎng)基，能減輕褐化的情況。

第二，調(diào)整培養(yǎng)基中含有的激素比例和含量。細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素濃度高，會(huì)刺激桉樹(shù)外植體的氧化情況，在高濃度外源激素下，會(huì)提升誘導(dǎo)的褐化率。低濃度下外源激素也會(huì)減少誘導(dǎo)的褐化率。在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑，比如常見(jiàn)的抗壞血酸、硫代硫酸鈉、血清白蛋白等，在培養(yǎng)時(shí)需要在培養(yǎng)基中添加抗壞血酸，確保能有效遏制組織惡化。在培養(yǎng)樺樹(shù)組織時(shí)，添加防腐劑能夠有效抑制褐化的情況。

第三，培養(yǎng)基中放入吸附劑。吸附酚類(lèi)的氧化物，活性炭屬于具有較強(qiáng)吸附性的吸附劑，因此需要應(yīng)用小濃度的活性炭?；钚蕴磕軌蚋玫貙⒎宇?lèi)氧化物進(jìn)行吸附。但活性炭吸附無(wú)選擇性，在吸附酚類(lèi)氧化物時(shí)，也會(huì)將其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸附。比如在培養(yǎng)蝴蝶蘭時(shí)，可發(fā)現(xiàn)活性炭能控制生長(zhǎng)，但卻無(wú)法開(kāi)展分化工作。組織培養(yǎng)材料會(huì)有水解型多酚存在，在培養(yǎng)此類(lèi)外植體時(shí)，會(huì)因多酚類(lèi)物質(zhì)分泌培養(yǎng)基中，加深培養(yǎng)基顏色，同時(shí)將其氧化成醌類(lèi)物質(zhì)。多酚類(lèi)物質(zhì)和醌類(lèi)物質(zhì)抑制酶活性，使外植體無(wú)法吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在培養(yǎng)多酚類(lèi)物質(zhì)時(shí)，要預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間，確保在培養(yǎng)基中分泌酚類(lèi)物質(zhì)[8]。

3.4 轉(zhuǎn)移外植體

加速轉(zhuǎn)瓶效率，及時(shí)更換培養(yǎng)基，從而減少在培養(yǎng)材料受到酚類(lèi)物質(zhì)的毒害。添加蘭花、核桃均能夠減少褐化。在培養(yǎng)番茄原生質(zhì)體時(shí)，通過(guò)添加培養(yǎng)液能有效遏制褐化的情況。培養(yǎng)紅豆杉時(shí)需要新鮮培養(yǎng)液，從而刺激外植體，使醌類(lèi)物質(zhì)更好地釋放，使其能和培養(yǎng)基中的氧氣配合。

培養(yǎng)植物組織出現(xiàn)的影響因素多種多樣，如培養(yǎng)物自身、環(huán)境或者是多種因素共同作用。因此需要先了解相關(guān)機(jī)制，從而正確認(rèn)識(shí)組織培養(yǎng)產(chǎn)生的褐化現(xiàn)象以及克服的方法。從實(shí)踐上控制褐化出現(xiàn)，更好地解決組織培養(yǎng)出現(xiàn)褐化的難題，確保組織培養(yǎng)技術(shù)逐漸完善。酶促褐有多種物種基因差異，因此在探究褐化物種種群時(shí)，要及時(shí)開(kāi)展篩選工作，有效把控惡化情況。由試驗(yàn)可知，褐化是植物適應(yīng)性的一種反應(yīng)，因此探究褐化抗病連鎖細(xì)胞群體的工作有重要意義。植物組織培養(yǎng)中，褐化材料和生根的問(wèn)題共同存在，在培養(yǎng)組織中也要加強(qiáng)褐化與生根間的聯(lián)系[9-11]。

3.5 使用消毒劑和時(shí)間

開(kāi)展外植體消毒工作，需要建立培養(yǎng)無(wú)菌體系，若是未充分消毒，則會(huì)使培養(yǎng)基受到污染，導(dǎo)致外植體死亡。因此選擇不合適的消毒劑或消毒時(shí)間長(zhǎng)，均會(huì)毒害外植體，甚至?xí)辜?xì)胞受損，加速褐化程度。并且選擇消毒的時(shí)間和消毒劑也影響母株的類(lèi)型、取材的位置和環(huán)境，各種類(lèi)的外植體與消毒劑耐受性間存在差異，植物材料成熟對(duì)消毒劑耐受性接受能力強(qiáng)，增加帶菌量，延長(zhǎng)消毒的時(shí)間。在培養(yǎng)幼嫩莖段組織時(shí)，使用氯化汞對(duì)外植體開(kāi)展消毒工作，處理10 min發(fā)現(xiàn)褐化情況變輕，也能正常發(fā)芽，消毒試劑使用率高。消毒時(shí)間縮短，會(huì)發(fā)現(xiàn)褐化率變高，因此褐化率與消毒時(shí)間呈反比關(guān)系。在開(kāi)展蘋(píng)果莖段組織培養(yǎng)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)外植體褐化率隨著消毒的時(shí)間改變而改變，雖然測(cè)試的結(jié)果存在差異，可能是組織對(duì)象的結(jié)構(gòu)與生理特性存在不同[12-13]。

4 結(jié)束語(yǔ)

植物組織培養(yǎng)存在生理狀態(tài)、取材和培養(yǎng)條件的不同，為避免外植體出現(xiàn)褐化，要采取有效方式。防止褐化的方法和效果存在差異，因此要結(jié)合培養(yǎng)的實(shí)際情況選擇對(duì)應(yīng)方法。要實(shí)施多種搭配措施，合理使用外植體預(yù)處理，確保獲得理想化的防褐效果。

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