安 妮，張 鈺，方小偉，梁雄燕，劉 晶，楊玉瑩，方 春

(長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，荊州 434025)

單核細(xì)胞增生性李斯特菌(又稱為產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌)簡(jiǎn)稱單增李斯特菌(LM)，是革蘭陽性胞內(nèi)寄生菌，在自然界分布廣泛，可導(dǎo)致人獸共患病[1-2]。動(dòng)物感染李斯特菌主要是由于食入被李斯特菌污染的飼料，繼而通過排泄物、分泌物排出細(xì)菌，污染肉制品、奶制品或水產(chǎn)品，并通過這類食物感染人，從而引起人的李斯特菌病。李斯特菌病患者通常為老年人、嬰幼兒及孕婦等抵抗力低下者，主要引發(fā)敗血癥、腦膜炎、胃腸炎、流產(chǎn)等疾病[3-4]。

LM能抵抗外界多種惡劣環(huán)境，如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高鹽、低溫和強(qiáng)氧化環(huán)境，這一特性對(duì)食品安全構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅[5-7]。在細(xì)菌感染宿主的過程中同樣會(huì)面臨各種環(huán)境，如胃酸、吞噬體中的弱酸環(huán)境及非特異性炎性因子的識(shí)別[8-9]。雙組分調(diào)控系統(tǒng)(TCSs)是幫助細(xì)菌適應(yīng)自然界和食品加工過程中遇到的許多應(yīng)激因素的主要系統(tǒng)之一，該系統(tǒng)由感應(yīng)外界信號(hào)的組氨酸激酶(HK)和調(diào)控胞內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)的應(yīng)答調(diào)控因子(RR)組成，研究證明，PhoP/PhoR、LisR/LisK、CheY/CheA等多種TCSs介導(dǎo)單增李斯特菌抗應(yīng)激、毒力和對(duì)抗生素的抵抗力[10]。LM中的雙元調(diào)控系統(tǒng)HssSR的主要功能是調(diào)控血紅素應(yīng)激，通過激活hrtAB表達(dá)來排出多余的血紅素，從而提高細(xì)菌的存活率[11]。單增李斯特菌LO28的基因組編碼一個(gè)推定的HssR一致物L(fēng)mo2583，與金黃色葡萄球菌HssR具有48%的同源性[12]。但在金黃色葡萄球菌中，HssS/HssR除了抗血紅素應(yīng)激外，Hss或Hrt系統(tǒng)的失活會(huì)導(dǎo)致金黃色葡萄球菌毒力增強(qiáng)，而Hss和Hrt系統(tǒng)也存在于單增李斯特菌中[13]。但HssS/HssR的其他功能尚不清楚，因此本研究以單增李斯特菌10403S為親本株，利用同源重組技術(shù)構(gòu)建hssS/hssR基因缺失株，并通過應(yīng)激生長(zhǎng)試驗(yàn)、細(xì)胞試驗(yàn)和雞胚毒力試驗(yàn)來評(píng)估其對(duì)單增李斯特菌抗應(yīng)激能力和毒力的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體、細(xì)胞及雞胚 單增李斯特菌參考菌株10403S(血清型為1/2a型)；大腸桿菌DH5α；穿梭質(zhì)粒pKSV7由本實(shí)驗(yàn)室保存。小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株由長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院郭利偉老師惠贈(zèng)。雞胚購(gòu)自長(zhǎng)江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑 LB培養(yǎng)基購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司；腦心浸液培養(yǎng)基BHI購(gòu)自北京陸橋生物技術(shù)有限公司；2×TaqPlus Master Mix Ⅱ和瓊脂糖購(gòu)于南京諾唯贊生物科技有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶BamH I購(gòu)自NEB公司；核酸染料Goldview購(gòu)自上海自賽百盛公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒及DNA Marker購(gòu)自武漢擎科生物技術(shù)有限公司；無縫克隆試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)參考單增李斯特菌株10403S(登錄號(hào)為CP002002)的基因序列信息，使用Vector NTI軟件設(shè)計(jì)hssS/hssR上、下游同源臂擴(kuò)增引物(表1)，引物由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成。

表1 本研究所用的引物

1.2.2 基因缺失株的構(gòu)建 按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法構(gòu)建基因缺失株[14]，以單增李斯特菌10403S基因組為模板，通過融合PCR方法擴(kuò)增hssS/hssR同源臂，同源臂回收后與BamH I線性化的pKSV7進(jìn)行重組連接構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pFL333。將pFL333電轉(zhuǎn)至10403S感受態(tài)細(xì)胞中，在含10 μg·mL-1氯霉素的BHI中，41 ℃培養(yǎng)條件下連續(xù)傳代實(shí)現(xiàn)同源重組；已重組的克隆在無抗BHI中于30 ℃培養(yǎng)箱中連續(xù)傳代消除重組質(zhì)粒，以獲得缺失株ΔhssS/hssR。

1.2.3 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)方法測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)曲線[15-16]。將親本株10403S和缺失株ΔhssS/hssR分別挑取單菌落，37 ℃震蕩培養(yǎng)過夜，調(diào)OD600 nm至0.6，將菌液分別在含20 mmol·L-1H2O2、pH 7、pH 4.5和5% NaCl的BHI培養(yǎng)基中稀釋100倍后，加入96孔酶標(biāo)板中，每株菌設(shè)置4個(gè)平行，置于37 ℃靜置培養(yǎng)，每2 h測(cè)定其OD600 nm，直至測(cè)到生長(zhǎng)平臺(tái)期并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 應(yīng)激生長(zhǎng)試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[17-18]方法進(jìn)行細(xì)菌體外應(yīng)激生長(zhǎng)試驗(yàn)。將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的親本株10403S和缺失株ΔhssS/hssR加入終濃度為20 mmol·L-1H2O2的BHI培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)1 h，將H2O2作用前后的菌液進(jìn)行倍比稀釋，點(diǎn)板后置于37 ℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，根據(jù)菌落計(jì)數(shù)計(jì)算出生長(zhǎng)率。本試驗(yàn)進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)。

1.2.5 細(xì)菌抗吞噬與胞內(nèi)增殖試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[15,19]方法進(jìn)行細(xì)菌抗吞噬和胞內(nèi)增殖試驗(yàn)。將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的親本株10403S和缺失株ΔhssS/hssR各取1 mL菌液離心收集，并用1 mL PBS重懸菌體，作為原液；以感染比(MOI)為細(xì)菌量∶細(xì)胞量=10∶1的比例感染單層的RAW264.7細(xì)胞，孵育30 min后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗3遍，并加入含有慶大霉素(200 μg·mL-1)的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育1 h后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗3遍，每孔加入1 mL滅菌去離子水，室溫靜置10 min，隨后充分吹吸，將其倍比稀釋后平板計(jì)數(shù)，以計(jì)算吞噬率；另一塊細(xì)胞板加入低濃度慶大霉素(20 μg·mL-1)的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，以同樣的方法裂解細(xì)胞后，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，以計(jì)算細(xì)菌在胞內(nèi)的增殖率。本試驗(yàn)進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)。

1.2.6 雞胚毒力試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[20-21]方法進(jìn)行雞胚毒力試驗(yàn)。將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的親本株10403S和缺失株ΔhssS/hssR菌液離心收集，并用 PBS重懸菌體，作為原液進(jìn)行倍比稀釋，選取10-4、10-5、10-63個(gè)梯度，每個(gè)稀釋梯度經(jīng)尿囊腔接種0.1 mL至14日齡雞胚6個(gè)，同時(shí)接種同樣劑量的PBS作為陰性對(duì)照組，38 ℃ 65%濕度孵育24 h后開始照蛋，觀察7 d(168 h)，棄去48 h內(nèi)的死亡胚，觀察并統(tǒng)計(jì)48～168 h各稀釋梯度雞胚的死亡情況，使用改良寇氏法計(jì)算雞胚半數(shù)致死量并繪制存活率曲線圖。7 d后，將親本株與缺失株中的10-5稀釋度攻毒組內(nèi)的雞胚無菌取出肝，用研缽研磨后加入1 mL PBS混勻，連續(xù)梯度稀釋后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)以計(jì)算雞胚肝載菌量。本試驗(yàn)進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，并通過GraphPad Prism 5對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，P<0.05和P<0.01分別表示差異顯著和差異極顯著，在圖中分別用“*”和“**”標(biāo)注。

2 結(jié) 果

2.1 LM hssS/hssR基因缺失株的構(gòu)建

以LM 10403S株基因組為模板，分別擴(kuò)增上、下游同源臂片段，大小分別為558和587 bp，以第一輪混合回收后的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增融合的同源臂片段(1 145 bp)；將融合的同源臂與穿梭載體pKSV7重組連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，成功構(gòu)建pFL333重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至單增李斯特菌10403S感受態(tài)細(xì)胞中，將電轉(zhuǎn)成功的菌株，在41 ℃、氯霉素(10 μg·mL-1)條件下進(jìn)行同源重組，獲得重組菌株，將其置于30 ℃、無抗條件下傳代培養(yǎng)20代后獲得無氯霉素抗性的重組菌株，即為hssS/hssR基因缺失株(圖1)。

M1.DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1.上游同源臂; 2.下游同源臂; 3.上下游同源臂; 4～7.重組質(zhì)粒pFL333; 8.陰性對(duì)照；M2.DL5000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 9.親本株10403S; 10.缺失株ΔhssS/hssR

2.2 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

為了探索HssS/HssR雙元調(diào)控系統(tǒng)是否介導(dǎo)單增李斯特菌的抗應(yīng)激作用，本研究使用了不同條件(pH 4.5、20 mmol·L-1H2O2和5% NaCl)的BHI培養(yǎng)基來評(píng)估單增李斯特菌對(duì)酸、氧化和滲透壓環(huán)境的抗應(yīng)激能力。親本株10403S和缺失株ΔhssS/hssR在pH 4.5、20 mmol·L-1H2O2和5% NaCl條件下的生長(zhǎng)曲線顯示(圖2)，在正常生長(zhǎng)狀態(tài)下(pH 7)，缺失株與親本株生長(zhǎng)能力無差異；在酸和滲透壓應(yīng)激條件下，生長(zhǎng)平臺(tái)期以前親本株和缺失株生長(zhǎng)能力無差異，到達(dá)平臺(tái)期后缺失株的存活量低于親本株；而在氧化應(yīng)激條件下，在任何生長(zhǎng)時(shí)期缺失株的生長(zhǎng)能力均低于親本株。以上結(jié)果表明HssS/HssR可能介導(dǎo)單增李斯特菌的抗酸、抗?jié)B透壓和抗氧化應(yīng)激，其中對(duì)抗氧化應(yīng)激的作用最明顯。

A.pH 7; B.20 mmol·L-1 H2O2; C.5% NaCl; D.pH 4.5

2.3 應(yīng)激試驗(yàn)

通過生長(zhǎng)曲線得知氧化應(yīng)激對(duì)缺失株生長(zhǎng)的抑制作用最大，接著通過氧化應(yīng)激試驗(yàn)來進(jìn)一步評(píng)估HssS/HssR對(duì)氧化應(yīng)激的貢獻(xiàn)。結(jié)果顯示(圖3)，在氧化環(huán)境中應(yīng)激處理1 h后，缺失株的生長(zhǎng)率顯著低于親本株(P<0.01)。說明雙元調(diào)控系統(tǒng)HssS/HssR介導(dǎo)單增李斯特的抗氧化應(yīng)激作用。

**.P<0.01

2.4 細(xì)菌抗吞噬與胞內(nèi)增殖試驗(yàn)

本研究用小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7研究缺失株抵抗巨噬細(xì)胞吞噬的能力及其在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活增殖能力。結(jié)果顯示(圖4)，與親本株10403S相比，缺失株的吞噬率顯著降低(P<0.01)，說明缺失株的抗吞噬能力更強(qiáng)；且缺失株在胞內(nèi)的增殖率顯著升高(P<0.05)，說明缺失株在胞內(nèi)的增殖能力更強(qiáng)，進(jìn)一步說明了HssS/HssR介導(dǎo)單增李斯特菌的胞內(nèi)感染過程。

*.P<0.05; **.P<0.01

2.5 雞胚毒力試驗(yàn)

為了探索HssS/HssR對(duì)單增李斯特菌毒力的作用，本研究分別用親本株和缺失株對(duì)雞胚進(jìn)行攻毒，測(cè)定其存活率、半數(shù)致死量和肝載菌量。根據(jù)規(guī)定時(shí)間內(nèi)的累計(jì)死亡率，按改良寇式計(jì)算法得出親本株LD50為102.2，缺失株LD50為101.4，與親本株10403S相比，缺失株的毒力更強(qiáng)；繪制10-5稀釋梯度攻毒組的存活率曲線圖(圖5，第90小時(shí)后雞胚不再死亡)，缺失株在攻毒后的第60小時(shí)雞胚存活率為67%，而親本株存活率為83%，且在第60小時(shí)后缺失株組存活率一直低于親本株，說明與親本株10403S相比，缺失株ΔhssS/hssR的毒力更強(qiáng)；臟器載菌量結(jié)果(圖6)顯示缺失株ΔhssS/hssR在雞胚肝定殖能力較親本株強(qiáng)(P<0.01)。以上結(jié)果表明，hssS/hssR基因缺失后顯著增強(qiáng)單增李斯特菌的毒力。

圖5 攻毒后雞胚的存活率曲線

**.P<0.01

3 討 論

單增李斯特菌在自然界中分布廣泛，可耐受外界多種惡劣環(huán)境，如低溫、低pH、高鹽、強(qiáng)氧化等環(huán)境[21]，單增李斯特菌已成為食品加工過程中非常常見的污染物之一，威脅到了人類的健康[22-23]。在感染過程中，TCSs發(fā)揮了不可或缺的作用，單增李斯特菌通過HK感受外界環(huán)境刺激后將信號(hào)傳遞給胞內(nèi)的RR，然后通過調(diào)節(jié)不同的基因來增強(qiáng)其自身在環(huán)境中的生存能力，尤其是在惡劣的環(huán)境中，LM會(huì)上調(diào)毒力基因來促進(jìn)其生存[16]。根據(jù)P2CS數(shù)據(jù)庫最新數(shù)據(jù)顯示，單增李斯特菌一般具有13～18對(duì)TCSs[24]。

本研究以10403S為親本株，構(gòu)建了hssS/hssR基因缺失株，應(yīng)激存活試驗(yàn)表明hssS/hssR基因缺失后抗氧化應(yīng)激能力顯著降低，同時(shí)酸應(yīng)激和滲透壓應(yīng)激條件下的存活率也降低，顯示HssS/HssR可能在LM適應(yīng)環(huán)境和應(yīng)激過程中發(fā)揮了作用。P?ntinen等[25]發(fā)現(xiàn)在參考菌株EGD-e中敲除lmo2582不影響LM在37 ℃及低溫下的生長(zhǎng)能力，其他條件未見報(bào)道；本研究發(fā)現(xiàn)hssS/hssR的缺失并沒有影響LM在37 ℃的生長(zhǎng)能力，但明顯降低了細(xì)菌在氧化應(yīng)激環(huán)境(20 mmol·L-1H2O2)中的生長(zhǎng)能力，說明HssS/HssR可能介導(dǎo)LM的抗氧化應(yīng)激作用。巨噬細(xì)胞吞噬溶酶體內(nèi)存在氧化應(yīng)激[26]，其中的氧化成分復(fù)雜，含有多種ROS和RNS，且有研究表明H2O2可顯著促進(jìn)LM毒力基因的轉(zhuǎn)錄[27]，本研究發(fā)現(xiàn)與親本株10403S相比，缺失株ΔhssS/hssR抗吞噬能力顯著增強(qiáng)，且在小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖能力也顯著增強(qiáng)，說明hssS/hssR基因缺失后可能導(dǎo)致LM對(duì)氧化環(huán)境更敏感，從而促進(jìn)毒力基因的轉(zhuǎn)錄，但具體調(diào)控機(jī)制還有待研究。Torres等[13]報(bào)道hssR失活會(huì)導(dǎo)致金黃色葡萄球菌在感染小鼠96 h后，肝載菌量上升，本研究中缺失株感染雞胚后，在肝載菌量上升，與已有研究結(jié)果趨勢(shì)一致。細(xì)胞試驗(yàn)與動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果一致，初步顯示HssS/HssR介導(dǎo)單增李斯特菌的毒力。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建雙元調(diào)控系統(tǒng)hssS/hssR缺失株，通過部分生物學(xué)特性比較結(jié)果顯示單增李斯特菌HssS/HssR雙元調(diào)控系統(tǒng)可能介導(dǎo)其抗氧化應(yīng)激與毒力，但其具體調(diào)控機(jī)制還有待深入研究。

4 結(jié) 論

成功構(gòu)建了單增李斯特菌hssS/hssR基因缺失株，hssS/hssR基因的缺失不影響單增李斯特菌的生長(zhǎng)狀況，但導(dǎo)致單增李斯特菌在氧化應(yīng)激條件下的生長(zhǎng)能力顯著降低，同時(shí)增強(qiáng)其抗巨噬細(xì)胞吞噬能力、巨噬細(xì)胞內(nèi)增殖能力以及對(duì)雞胚的致病性。雙元調(diào)控系統(tǒng)HssS/HssR可能介導(dǎo)單增李斯特菌抗氧化應(yīng)激作用和毒力。