王 微，華 敏，張 蕓，李 濤，張黔東，袁 陽，程振濤，4，文 明，4*

(1.貴州大學動物科學學院，貴陽 550025；2.貴州省畜禽遺傳資源管理站，貴陽550025；3.貴州省動物預防控制中心，貴陽550025；4.貴州省動物生物制品工程技術(shù)研究中心，貴陽 550025)

鴨瘟病毒(duck plague virus，DPV)又稱為鴨病毒性腸炎病毒(duck enteritis virus，DEV)，屬皰疹病毒科成員。DEV傳播速度快且病死率較高，常引起鴨、鵝等禽類發(fā)生急性、敗血性、高度接觸性傳染病，造成了養(yǎng)殖戶嚴重的經(jīng)濟損失。病禽往往表現(xiàn)為精神不振，綠色稀糞，頭部腫脹，兩腳麻痹不能站立；其病變特征為組織、消化道出血壞死，血管損傷，淋巴器官特異性病變和實質(zhì)性臟器退行性病變。

絲切蛋白(cofilin)是肌動蛋白解聚因子(actin depolymerizing factor，ADF)/cofilin家族的一員，在哺乳動物神經(jīng)元中主要通過切斷或穩(wěn)定肌動蛋白絲以影響肌動蛋白組裝的動力學[1]。病原微生物進入宿主細胞并在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運需要肌動蛋白細胞骨架，cofilin與細胞骨架的正常結(jié)構(gòu)、動力學和功能有關(guān)，因此對病原微生物進入宿主細胞有著重要的影響[2-3]。cofilin蛋白有2種：cofilin1和cofilin2[4]。cofilin1在細胞遷移、增殖和噬菌體形成中起作用；cofilin1以及cofilin2在病毒復制過程中表達方式不同[5-7]。cofilin2主要是在真核細胞中表達，它結(jié)合并解聚肌動蛋白絲來對細胞的生理功能進行調(diào)節(jié)，其在細胞中的活性受磷酸化、去磷酸化和pH的調(diào)節(jié)[8]。cofilin2在肌肉發(fā)育和功能作用尚不清楚，但可能參與了肌纖維發(fā)生過程中肌動蛋白組裝的調(diào)節(jié)和成熟肌肉中的肌動蛋白動力學[9]。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是由正義RNA和反義RNA組成高度保守的小型雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)導入細胞中誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，dsRNA分為miRNA(micro RNA)，siRNA(small interfering RNA，siRNA)和shRNA(short hairpin RNA，shRNA)[10-11]。shRNA是一種具有發(fā)夾環(huán)的人工RNA分子，可克隆成表達載體，在宿主細胞中RNA聚合酶作用下導致較長時間的基因沉默[12-14]。此外，由于它們發(fā)夾結(jié)構(gòu)有穩(wěn)定基因表達的潛力，它們有利于體內(nèi)研究，是一種實用工具[15-16]。盡管近年來對DEV的研究進展為病毒發(fā)病的基本機制提供了新的認識，但有關(guān)RNAi 干擾cofilin2基因?qū)EV增殖的影響研究鮮有報道。研究cofilin2基因?qū)EV在宿主細胞內(nèi)增殖過程的影響，對DEV的研究致病機理以及疾病防控具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、載體及細胞 DEV-GZ株及DEF由本實驗室提供；pGPH1/GFP/Neo表達載體及shRNA質(zhì)粒購自吉瑪生物有限公司；感受態(tài)細胞大腸桿菌DH5α菌株購自天根生化科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 Lipofectamine? 3000購自Invitrogen公司；胰蛋白酶及DMEM購自Nalgen公司；FBS購自賽默飛世爾科技公司；Prime ScriptTMRT Master Mix、SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ購自TaKaRa公司；UNIQ-10無內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司，其他試驗所需試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 shRNA干擾載體序列設(shè)計 通過Ambion在線軟件設(shè)計篩選鴨源cofilin2全基因序列(MF434775)中4條特異性shRNA序列，并加入5′-TTCAAGAGA-3′序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。4條shRNA序列中靶序列起始位置分別為460～480、313～333、256～276、95～115，根據(jù)靶序列起始位置不同將shRNA干擾載體分別命名為cofilin2-451、cofilin2-304、cofilin2-247、cofilin2-86；設(shè)計1條陰性對照并命名為shRNA-NC，靶序列及shRNA序列詳見表1。

表1 cofilin2基因shRNA序列

1.2.2 shRNA干擾載體構(gòu)建 oligo混合物制備(正義鏈、反義鏈各5 μL，10×oligo annealing buffer 2 μL，ddH2O補足20 μL)；將制備好的oligo混合物95 ℃加熱5 min，冷卻放置一段時間使其形成DNA雙鏈并稀釋至10 nmol·L-1待用。分別按照5×ligation buffer 4 μL、ds oligo 4 μL、pGPH1/GFP/Neo 2 μL、T4 DNA ligase(1 U·μL-1)1 U的順序逐步加入，ddH2O補足20 μL；室溫條件下放置30 min(使質(zhì)粒能夠充分轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞中)。將制備好的shRNA載體涂布于含有奇霉素的LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h以篩選出轉(zhuǎn)化成功的DH5α感受態(tài)細胞，挑取平板上的單個菌落于LB肉湯中，180 r·min-137 ℃恒溫搖床中增菌12 h后，離心收集菌體。提取質(zhì)粒中的DNA送生工生物工程(上海)公司測序，分析shRNA干擾載體是否構(gòu)建成功。

1.2.3 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 DEF制備：受精鴨蛋孵化至10日齡，取胚體的軀干剪碎加入胰蛋白酶吹打離心，棄掉上清，轉(zhuǎn)入3 mL DMEM培養(yǎng)基中吹打，用過濾器過濾并收集細胞液，轉(zhuǎn)入含雙抗+10% FBS的生長培養(yǎng)基中，放入5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)至細胞長滿瓶底。shRNA及Lipofectamin? 3000(1∶1)各125 μL混勻，室溫放置5 min后，緩慢將Lipofectamine? 3000-shRNA復合物加入到已經(jīng)轉(zhuǎn)入生長良好的DEF六孔板中，將六孔板放置于5%CO2培養(yǎng)箱37 ℃孵育。

1.2.4 shRNA干擾載體的篩選 將cofilin2-451、cofilin2-304、cofilin2-247、cofilin2-86及shRNA-NC 5個干擾載體，按“1.2.3”方法轉(zhuǎn)染到DEF中。經(jīng)轉(zhuǎn)染24 h后放置于熒光顯微鏡上觀察重組質(zhì)粒中GFP基因是否出現(xiàn)綠色熒光蛋白表達。確定細胞生長良好及GFP正常表達后，經(jīng)熒光定量PCR檢測4對shRNA干擾效果并進行shRNA的篩選，F(xiàn)Q-PCR反應體系: SYBR premix Ex Taq Ⅱ(Til RNaseH Plus)(2×)5.0 μL，PCR 上、下游引物各0.5 μL, DNA模板1.0 μL, 加ddH2O至10 μL。反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s、55 ℃退火30 s，共循環(huán)40次；在退火時采集5 s熒光，采集熔解曲線，溫度范圍為60～95 ℃，溫度臺階為0.5 ℃。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒shRNA的構(gòu)建

靶向設(shè)計shRNA序列插入到載體中，通過Sanger測序比對結(jié)果顯示，由于shRNA序列中靶序列起始位置不同，分別將shRNA干擾載體命名為cofilin2-451、cofilin2-304、cofilin2-247、cofilin2-86，測序結(jié)果見表2，shRNA干擾質(zhì)粒構(gòu)建成功。

表2 shRNA質(zhì)粒測序

2.2 shRNA序列篩選

應用EXCEL軟件對shRNA序列篩選。

2.2.1 shRNA干擾質(zhì)粒篩選熒光表達結(jié)果 轉(zhuǎn)染24 h于普通顯微鏡觀察shRNA干擾質(zhì)粒，其在DEF中生長良好；經(jīng)24 h培養(yǎng)后重組質(zhì)粒載體中GFP基因顯示綠色熒光蛋白熒光(圖1)，DMEM中未見綠色熒光蛋白熒光，說明DMEM不表達，重組質(zhì)粒中GFP基因表達轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒成功。

A.轉(zhuǎn)染shRNA質(zhì)粒DEF生長情況圖；B.轉(zhuǎn)染24 h后shRNA質(zhì)粒熒光圖

2.2.2 shRNA篩選FQ-PCRcofilin2核酸含量檢測結(jié)果 通過FQ-PCR檢測篩選mRNA水平shRNA的干擾效果，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒cofilin2-451、cofilin2-304、cofilin2-247、cofilin2-86后DEF中cofilin2轉(zhuǎn)錄量，均顯著低于對照組(P<0.05)，沉默效率分別為4.96%±0.78%、41.12%±2.94%、17.55%±2.07%、54.02%±1.73%；而陰性對照為4.52%±0.99%，試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)cofilin2-86干擾組中干擾效果最好，選擇其作為后續(xù)試驗使用，shRNA篩選FQ-PCR檢測結(jié)果見圖2。

*.P<0.05

2.3 cofilin2-86干擾下DEV增殖動態(tài)

六孔板中轉(zhuǎn)染cofilin2-86的DEF生長至適宜密度時，于48、72、96、120 h 4個時間段收集細胞，cofilin2-86在轉(zhuǎn)染后4個時間段的干擾效率分別為50.42%±2.02%、56.24%±1.94%、55.34%±0.98%、42.59%±4.32%(圖3)。通過FQ-PCR檢測DEV-GZ株處理DEF后不同時間段收集的細胞液中DEV核酸表達量，cofilin2 shRNA+DEV試驗組顯著低于DMEM+DEV組(P<0.05)(圖4)。DMEM+DEV組中DEV核酸量隨著時間增加而增加，DMEM中的DEV未見表達，cofilin2 shRNA+DEV組中DEV隨時間增加而增加，但明顯低于與DMEM+DEV中的DEV核酸量，說明沉默cofilin2導致DEV核酸復制被抑制，cofilin2可能促進DEV的復制，這與Li等[17]研究的cofilin2具有免疫性和促進細胞增殖作用相一致。

圖3 cofilin2-86轉(zhuǎn)染不同時間的表達情況

與DMEM+DEV組相比，*.P<0.05

3 討 論

在任何生物調(diào)節(jié)過程中，轉(zhuǎn)錄調(diào)控都是至關(guān)重要的部分，RNAi技術(shù)能夠廣泛應用于傳染性、腫瘤性疾病治療，是因為能克隆到shRNA表達載體中以穩(wěn)定靶基因和干擾目的基因表達。RNAi的作用機制是通過在細胞內(nèi)導入dsRNA，dsRNA能夠特異性地與細胞內(nèi)互補的mRNA結(jié)合使其降解，以阻止mRNA編碼蛋白質(zhì)，從而使細胞中目的基因的表達量減少[18-20]。大多數(shù)無法轉(zhuǎn)染的細胞、腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，可利用RNAi中短發(fā)卡結(jié)構(gòu)的shRNA克隆到載體再進行轉(zhuǎn)染[21]。復制腺病毒作為shRNA的傳遞載體可增強抗腫瘤效果[22]。RNAi技術(shù)面臨的主要問題就是脫靶效應，通過設(shè)計無法進行化學修飾表達的shRNA可有效降低脫靶效應發(fā)生[23-24]。shRNA主要存在的問題是轉(zhuǎn)染效率，由于不完全的轉(zhuǎn)染產(chǎn)生不完整的mRNA，可能影響了蛋白的功能[25]。研究運用RNAi技術(shù)針對cofilin2設(shè)計的4段shRNA片段進行細胞轉(zhuǎn)染，以期篩選穩(wěn)定沉默cofilin2基因的靶序列。結(jié)合轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒結(jié)果，在今后的DEV研究中，采用干擾效率高且穩(wěn)定性好的cofilin2-86質(zhì)粒作為載體更合理。

cofilin2的缺乏可能導致肌動蛋白表達降低，也可以改變細胞功能，在細胞內(nèi)積累導致腫瘤發(fā)生[26]。已被證明與肌動蛋白和肌球蛋白相互作用，這可能與cofilin2在調(diào)節(jié)細胞周期調(diào)節(jié)和凋亡中有絲分裂紡錘體形成過程有關(guān)[27]。Yu等[28]研究利用cofilin2-shRAN干擾載體轉(zhuǎn)染到移植腫瘤的裸鼠模型中可有效表達，cofilin2基因沉默抑制了腫瘤生長，表明cofilin2可作為鼻咽癌的潛在治療靶點。Gao等[29]研究在腫瘤腺病毒中shRNA與黏附斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)結(jié)合形成FAK-shRNA復合物，轉(zhuǎn)染細胞后顯著抑制了FAK的表達，并有效抑制了肝癌細胞的生長且對正常細胞無影響。證明RNAi在疾病治療中對癌癥和病毒感染效果顯著，研究cofilin2對探究病毒復制具有重要的意義。本研究將cofilin2-86作為載體轉(zhuǎn)染到DEF中，DEV病毒核酸量隨著時間的推移持續(xù)增長，cofilin2基因?qū)EV的增殖有促進作用，同時，也存在其他基因影響DEV增殖還有待研究。Zhao等[30]研究利用鴨乙型肝炎病毒感染原發(fā)性鴨肝細胞蛋白組分析中，在感染細胞過程中存在75個不同蛋白表達靶點，其中,β-actin和膜聯(lián)蛋白A2的差異表達，這些蛋白表達差異在病毒感染中存在潛在作用，同樣在DEV復制增殖過程中存在的其他蛋白表達靶點具有重要的研究意義。

4 結(jié) 論

通過將沉默cofilin2轉(zhuǎn)染到DEF中，cofilin2-86在轉(zhuǎn)染后4個時間段中最佳干擾效率為56.24%±1.94%，利用干擾效率最佳的cofilin2-86轉(zhuǎn)染到DEF中，在不同時間DEV處理DEF下，DEV核酸量較轉(zhuǎn)染對照組中的DEV核酸量總體下降，推測cofilin2基因?qū)EV的增殖存在促進作用，該結(jié)果為今后cofilin2對DEV動態(tài)轉(zhuǎn)錄研究奠定了基礎(chǔ)。