陶未來，劉 佳，劉瓊丹，郝永峰,胡 宇，朱兆榮，劉 娟,2,3*

(1.西南大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，重慶 402460；2.重慶市高校獸醫(yī)科學(xué)工程研究中心中獸藥創(chuàng)新研發(fā)實驗室，重慶 402460；3.西南大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院免疫研究中心，重慶 402460)

仔豬腹瀉是仔豬斷奶后最為常見的胃腸道疾病之一，每年給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失[1]。在濕熱等多種復(fù)雜環(huán)境下，斷奶仔豬腸道致病菌大量增生，有益菌的生長受到抑制，腸道黏膜免疫遭到破壞，易致斷奶仔豬發(fā)生腹瀉[2]。中獸醫(yī)學(xué)認(rèn)為，濕熱等外邪侵入機(jī)體，郁結(jié)于脾，致脾胃受納運化失常，濕熱郁蒸，氣滯血阻，臟腑傳化失常而發(fā)生泄瀉[3]?？股爻蔀橹委煾篂a類疾病最為成功的方法之一，但持續(xù)地使用抗生素會改變腸道微生物的新陳代謝，增加腸道對病原體的敏感性[4]，抑制免疫細(xì)胞的活性[5]，從而降低藥物的治療效果。在此背景下，尋找替代藥物來維護(hù)仔豬在斷奶期的健康尤為重要。

腸道菌群由數(shù)萬億微生物組成，被認(rèn)作新的虛擬代謝器官[6]，密切影響著疾病的發(fā)展和口服藥物的治療功效，其在腸道共生有助于營養(yǎng)物質(zhì)的利用以及對致病菌的抵抗作用，在腹瀉類疾病的治療中發(fā)揮著重要作用，但菌群的某些組成部分也可能產(chǎn)生不利影響，如大腸桿菌、沙門菌等病原菌在腸道產(chǎn)生內(nèi)毒素等物質(zhì)，破環(huán)腸道屏障及穩(wěn)態(tài)，從而引起腹瀉等病癥[7-8]?？诜兴幙梢耘c腸道菌群相互作用，直接或間接影響腸道菌群的組成和代謝，微生物菌群如擬桿菌也可對中藥多糖等成分進(jìn)行分解代謝，產(chǎn)生更適合機(jī)體吸收并具有藥理活性的成分，已有很多學(xué)者認(rèn)為腸道菌群或是中藥治療的機(jī)制[9-10]。腸道微生物菌群的組成會影響腸道對病原體的免疫反應(yīng)及易感性[11]，常駐腸道菌群亦可以與腸道細(xì)胞協(xié)同作用，影響腸道免疫平衡[12]，有研究顯示，微生物菌群發(fā)生改變時，會誘導(dǎo)Th1型和Th2型細(xì)胞因子之間免疫平衡紊亂，從而導(dǎo)致異常的炎癥反應(yīng)[13]，小腸上皮細(xì)胞通過分泌免疫活性物質(zhì)改善腸腔內(nèi)微生物組成[14]。腸道菌群與腸道黏膜免疫相互協(xié)調(diào)，共同在腸道疾病發(fā)展中起著重要作用[15]，已有研究表明，中草藥多糖可以通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)來治療腹瀉類疾病[16]。

傳統(tǒng)中草藥多糖具有重要生物活性，在醫(yī)學(xué)應(yīng)用中發(fā)揮重要作用，已成為中藥材的熱門研究領(lǐng)域[17]。前期研究表明,術(shù)苦芩總多糖具有修復(fù)小腸黏膜損傷的作用，對仔豬濕熱泄瀉具有較好的治療效果[18]。本試驗通過研究術(shù)苦芩總多糖體外抑菌作用，結(jié)合腸道菌群16S rDNA測序分析及免疫相關(guān)細(xì)胞因子水平變化，以期為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

術(shù)苦芩總多糖(polysaccharides from Zhukuqin，簡稱ZKQPs，由西南大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院中藥創(chuàng)新研究室制備。白頭翁散(Pulsatilla powder，PP)購自重慶市天龍牧業(yè)科技有限公司，批號：20170425。恩諾沙星購自重慶市布爾藥業(yè)有限公司，批號：DK031802065。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(含量99.9%)購自中國食品藥品檢定研究院；甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖(純度均≥98%)均購自上海寶曼生物；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)購自上海麥克林生化科技有限公司；麥康凱培養(yǎng)基購自北京奧博生物技術(shù)有限公司，批號：02-00A。MRS培養(yǎng)基購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)公司，批號：HB0384-1。MH培養(yǎng)基和SS培養(yǎng)基均購自北京奧博生物技術(shù)有限公司。LB 液體培養(yǎng)基購自生工生物工程(上海)股份有限公司，批號：A5070020250。糞便總 DNA 提取試劑盒：Stool DNA Kit，批號：D4015；UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒購自上海生物工程有限公司，貨號：B511321。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司，貨號：A5000。Premix Ex-TaqTMⅡ熒光定量試劑盒購自寶生物工程有限公司，貨號：RR820A。

大腸桿菌 CVCC210、沙門菌 CVCC2084、豬源產(chǎn)氣莢膜梭菌 CVCC43菌株均來自于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

斷奶仔豬，60只25～30日齡的健康三元(榮昌)仔豬，雌雄各半，體重10.0 kg±0.3 kg。

1.2 試驗儀器

高效液相色譜儀(日本島津)，SPD20A紫外檢測器(日本島津)，Shim-pack VP-ODS C18色譜柱(日本島津)，TU-1950雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)，JS-power 300瓊脂糖水平電泳儀(上海培清科技)，JS-860B自動凝膠圖像分析儀(上海培清科技)，SMA5000超微量核酸蛋白分析儀(Merinton)，Qubit 2.0熒光計(Invitrogen)，LightCycler 96熒光定量PCR儀器(Roche公司)等實驗室儀器設(shè)備。

1.3 試驗方法

1.3.1 高效液相測定術(shù)芩總多糖單糖組成 參考文獻(xiàn)[19]，稱取術(shù)苦芩總多糖并利用三氟乙酸溶液進(jìn)行水解，水解產(chǎn)物加入PMP溶液進(jìn)行衍生化反應(yīng)，0.22 μm濾膜過濾，利用高效液相色譜檢測術(shù)苦芩總多糖組成的單糖。

高效液相色譜條件：島津C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，柱溫30 ℃，流動相為乙腈∶PBS=(17∶83)，流速 1 mL·min-1，紫外檢測器，檢測波長245 nm，進(jìn)樣體積10 μL，采集時間60 min。

1.3.2 津杯法檢測 ZKQPs 溶液的體外抗菌能力 取1 mL濃度為1×105CFU·mL-1的菌懸液加入到LB瓊脂培養(yǎng)基，均勻涂布，夾取牛津杯置于平板上，分別加入3種濃度(200、100、50 mg·mL-1)的ZKQPs溶液各200 μL，陰性對照為無菌水，陽性對照為恩諾沙星溶液(2.58 mg·mL-1)，重復(fù)3次。37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測抑菌圈直徑并判定抑菌活性[20]。

1.3.3 MIC值的測定 用微量肉湯稀釋法測定大腸桿菌、沙門菌、豬源產(chǎn)氣莢膜梭菌對200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563 mg·mL-1濃度梯度ZKQPs溶液的MIC。

1.3.4 生長曲線的繪制 試驗分為藥物組、陰性對照組、空白對照組。藥物組用MH培養(yǎng)基將ZKQPs溶液稀釋至1/2 MIC和1/4 MIC的藥液，陰性對照組只加菌液不加藥，空白對照組為無菌液的MH培養(yǎng)基。將菌液按照2%接種量加入各離心管中，37 ℃ 150 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)，每2 h間隔讀取600 nm處的吸光度值，繪制細(xì)菌生長曲線。

1.3.5 仔豬濕熱泄瀉模型建立及分組處理 60頭健康仔豬隨機(jī)分為空白對照組(Control)、模型組(Model, 造模后不作處理)、陽性藥物組[白頭翁散，50 mg·(kg·次)-1]、ZKQPs 25 mg·kg-1、ZKQPs 50 mg·kg-1、ZKQPs 75 mg·kg-1，每組10只?？瞻讓φ战M仔豬飼養(yǎng)于適宜環(huán)境中(溫度25～27 ℃，濕度65%～75%)，飼喂正常飼料，自由飲水；其余各組飼養(yǎng)于35～38 ℃，相對濕度90%～95%的圈舍中，并飼喂高脂高糖飼料(豬油18%+蔗糖1%+酒糟5%，隔天加入1%番瀉葉提取液)，連續(xù)10 d，當(dāng)仔豬出現(xiàn)精神沉郁(喜臥, 不愿走動)、采食下降、口渴喜飲、排便次數(shù)增加、排稀糞或水樣便、肛門紅腫、肛周污穢、尿黃短赤、身體消瘦、被毛粗亂等癥狀時可判定模型建立成功[18]。造模成功后，各治療組灌服給藥2次·d-1，模型組與空白對照組，灌以等量生理鹽水，連續(xù)給藥5 d，正常飼喂，自由飲水。采用豬場常規(guī)免疫程序，每天清掃圈舍，定期消毒。在治療結(jié)束后，采取電擊放血法屠宰，取小腸各段液氮速凍，-80 ℃冰箱保存，分離結(jié)扎盲腸腸段，消毒結(jié)扎后置于無菌容器中，取仔豬盲腸內(nèi)容物裝入無菌無酶的EP管中，液氮保存。

1.3.6 盲腸的活菌計數(shù) 參考文獻(xiàn)[21]，取仔豬盲腸內(nèi)容物進(jìn)行分級稀釋，分別滴種于麥康凱培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)，進(jìn)行計數(shù)，重復(fù)3次，并根據(jù)菌落形態(tài)、革蘭染色鏡檢及生化試驗對其進(jìn)行鑒定。

每克內(nèi)容物所含細(xì)菌數(shù)=菌落數(shù)均值×稀釋倍數(shù)×每次稀釋取樣體積/(接種用樣品體積×樣品質(zhì)量)，菌落計數(shù)表示為每克內(nèi)容物中細(xì)菌數(shù)的對數(shù)lg(CFU·g-1)。

1.3.7 16S rDNA擴(kuò)增V4-V5區(qū)和高通量測序 根據(jù)制造商的說明使用Stool DNA Kit D4015提取仔豬盲腸內(nèi)容物總基因組DNA，使用1%瓊脂糖漿電泳檢測DNA濃度和純度。通過以下步驟驗證最終的DNA文庫：使用 Qbuit2.0 核酸檢測儀上對文庫進(jìn)行定量。定量之后，將每個樣品進(jìn)行等量混合，漩渦均勻形成均一的混合物。純化后的混合 DNA 樣本由合肥晟起生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

使用 UPARSE軟件，按照以 97%的相似性進(jìn)行操作分類單元(OTUs)聚類，同時選取 OTUs的代表性序列，篩選出 OTUs 中出現(xiàn)頻率次數(shù)最高的序列作為代表序列?；贠TU聚類的代表序列，采用RDP注釋軟件比對SILVA(http://www.arb-silva.d e/)數(shù)據(jù)庫對每一條16S rDNA的基因序列進(jìn)行分類學(xué)分析(設(shè)定閾值為 0.8～1.0)，獲得分類學(xué)信息，并分別在各個分類學(xué)水平統(tǒng)計各樣本的群落組成。結(jié)果用R軟件分析。

1.3.8 仔豬腸道細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量測定 取50 mg腸道組織樣本，在液氮中充分研磨，參照B511321-UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒說明書進(jìn)行腸道組織總RNA提取，按照promega 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 進(jìn)行后續(xù)qPCR反應(yīng)。

表1 熒光定量PCR引物

按照SYBR Green qPCR試劑盒說明書配制20 μL反應(yīng)體系：2×Top Green qPCR SuperMix 10 μL，QF(10 μmol·L-1)和QR(10 μmol·L-1)各0.5 μL，模板cDNA 2 μL，RNase Free dH2O 7 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，61 ℃退火35 s，循環(huán)40次；熔解程序：97 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s。采用2-△△Ct法計算各檢測樣本中目的基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 ZKQPs單糖組成

術(shù)苦芩總多糖水解后的PMP-衍生化產(chǎn)物高效液相圖譜與標(biāo)準(zhǔn)品PMP-衍生化產(chǎn)物圖譜對比，可以判斷出術(shù)芩總多糖由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖等單糖組成，質(zhì)量比為7.38∶1.57∶11.85∶3.98∶329.42∶19.02∶40.07∶2.64，其主要單糖為鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖，物質(zhì)的量比為7.22∶182.85∶10.56∶26.69。

A.8種單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品PMP-衍生化產(chǎn)物HPLC色譜圖；B.術(shù)芩總多糖水解產(chǎn)物PMP-衍生化產(chǎn)物HPLC色譜圖。各峰對應(yīng)單糖情況：1.甘露糖，2.核糖，3.鼠李糖，4.葡萄糖醛酸，5.葡萄糖，6.半乳糖，7.木糖，8.阿拉伯糖

2.2 ZKQPs的抑菌活性

由圖2可知，大腸桿菌(Escherichiacoli)對50、100、200 mg·mL-1ZKQPs高度敏感；沙門菌(Salmonella)、豬源產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumwischii)對100、200 mg·mL-1ZKQPs高度敏感，對50 mg·mL-1ZKQPs 中度敏感。ZKQPs對大腸桿菌、沙門菌、豬源產(chǎn)氣莢膜梭菌的MIC值分別為3.125、6.250、12.500 mg·mL-1。隨著ZKQPs濃度上升3種致病菌的生長活性逐漸下降，其中大腸桿菌最為敏感，豬源產(chǎn)氣莢膜梭菌敏感度較低，ZKQPs暴露的致病菌生長期平緩，對致病菌生長的抑制作用具有濃度依耐性。

A.牛津杯法測術(shù)苦芩總多糖對試驗菌株的抑菌活性；B.術(shù)苦芩總多糖對試驗菌種的MIC; C～E.術(shù)苦芩總多糖對大腸桿菌(C)、沙門菌(D)、豬源產(chǎn)氣莢膜梭菌(E)生長曲線的影響。ns.P≥0.05; *.P<0.05; **.P<0.01, 下同

2.3 ZKQPs對濕熱泄瀉仔豬回腸、盲腸乳酸桿菌和大腸桿菌數(shù)量的影響

分別通過麥康凱培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基對大腸桿菌和乳酸桿菌進(jìn)行選擇培養(yǎng)，使用革蘭染色及生化反應(yīng)對菌種進(jìn)行鑒定，對回腸、盲腸內(nèi)容物進(jìn)行菌數(shù)計數(shù)。如圖3所示，濕熱環(huán)境下腹瀉仔豬腸道大腸桿菌數(shù)量顯著上升(P<0.01)，乳酸桿菌數(shù)量降低(P<0.05)，乳酸桿菌與大腸桿菌比值下降(P<0.01)。ZKQPs對腸道乳酸桿菌的生長具有促進(jìn)作用，同時抑制致病菌大腸桿菌的定植，其中ZKQPs 75 mg·kg-1效果最為明顯，極顯著增加了乳酸桿菌與大腸桿菌的比值(vs模型組,P<0.01)。

A.乳酸桿菌數(shù)量；B.大腸桿菌數(shù)量; C.乳酸桿菌和大腸桿菌比值

2.4 ZKQPs腸道菌群Alpha多樣性的影響

圖4表明，腹瀉仔豬盲腸乳酸桿菌和大腸桿菌計數(shù)結(jié)果表明PP(50 mg·kg-1)組菌群變化不明顯，其余各組菌群結(jié)構(gòu)均發(fā)生明顯變化，因此，試驗通過16S rDNA進(jìn)一步分析菌群結(jié)構(gòu)。與空白組相比，模型組仔豬盲腸菌群OTU數(shù)目、Shannon、Chao1和ACE指數(shù)有降低的趨勢(P>0.05)。與模型組相比，75 mg·kg-1ZKQPs 治療仔豬盲腸菌群OTU數(shù)目有升高的趨勢(P>0.05)，Chao1、ACE指數(shù)明顯升高(P<0.01)，Shannon指數(shù)升高(P<0.05)；25和50 mg·kg-1ZKQPs治療仔豬盲腸菌群 OTU 數(shù)目、Chao1、Shannon、ACE指數(shù)顯著升高(P<0.01)。

2.5 ZKQPs處理后腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變

由圖5可知，各試驗組組內(nèi)樣品分布較為聚集，說明組內(nèi)差異較小，各組間散點完全分開，5組樣本之間腸道菌群結(jié)構(gòu)存在一定的差異。

對照組.樣本1～3；模型組.樣本4～6；ZKQPs 75 mg·kg-1組.樣本7～9；ZKQPs 50 mg·kg-1組.樣本10～12；ZKQPs 25 mg·kg-1組.樣本13～15

2.6 ZKQPs處理對腸道菌群關(guān)鍵表型的影響

圖6表明，腹瀉和ZKQPs治療對仔豬腸道微生物在門、綱、屬水平上均表現(xiàn)出一定影響。在門水平上擬桿菌門(Bateroidetes, 2.01%)、厚壁菌門(Firmicutes, 92.42%)和變形菌門(Proteobacteria, 3.45%)為優(yōu)勢菌門，但在腹瀉及ZKQPs治療中變化不顯著。仔豬腹瀉時，盲腸內(nèi)芽胞桿菌綱(Bacilli)相對豐度降低，擬桿菌綱(Bacteroidia)和乳酸桿菌屬(Lactobacillus)相對豐度顯著下降(P<0.01)，梭菌綱(Clostridia)相對豐度顯著上升(P<0.01)，ZKQPs治療后芽胞桿菌綱、乳酸桿菌屬相對豐度均顯著上升且高于正常值，梭菌綱相對豐度極顯著下降(vs模型組,P<0.01)，顯著改善了腹瀉仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)。

A.門；B.綱; C.屬

2.7 術(shù)苦芩總多糖對濕熱泄瀉仔豬各段小腸IL-2 mRNA表達(dá)量的影響

與空白組相比，濕熱泄瀉仔豬小腸各段IL-2 mRNA表達(dá)顯著上升(P<0.01)，治療后不同濃度術(shù)苦芩總多糖均有降低小腸IL-2 mRNA表達(dá)的作用，且在小腸各段抑制作用不同，其中25和50 mg·kg-1ZKQPs 治療后IL-2 mRNA表達(dá)極顯著降低(P<0.01，圖7)。

圖7 各組仔豬十二指腸(A)、空腸(B)和回腸(C)IL-2 mRNA表達(dá)量

2.8 術(shù)苦芩總多糖對濕熱泄瀉仔豬各段小腸IL-4 mRNA表達(dá)的影響

腹瀉仔豬小腸各段IL-4 mRNA表達(dá)降低，術(shù)苦芩總多糖治療可促進(jìn)腹瀉仔豬小腸IL-4 mRNA表達(dá)，對十二指腸IL-4 mRNA表達(dá)影響最為顯著(P<0.01)，50 mg·kg-1ZKQPs 顯著促進(jìn)了腹瀉仔豬小腸各段IL-4 mRNA表達(dá)(P<0.01，圖8)。

圖8 各組仔豬十二指腸(A)、空腸(B)和回腸(C)IL-4 mRNA表達(dá)量

2.9 術(shù)苦芩總多糖對濕熱泄瀉仔豬各段小腸IL-5 mRNA表達(dá)量的影響

腹瀉仔豬IL-5 mRNA在小腸不同部位表達(dá)有較大差異，空腸和回腸較為敏感，仔豬腹瀉時IL-5 mRNA水平極顯著下降(P<0.01)，ZKQPs 50和75 mg·kg-1可以較為穩(wěn)定地提高各段小腸IL-5 mRNA表達(dá)量(P<0.01，圖9)。

圖9 各組仔豬十二指腸(A)、空腸(B)和回腸(C)IL-5 mRNA表達(dá)量

3 討 論

近年，中草藥多糖因其重要的生物活性及低廉的價格而被廣泛關(guān)注與開發(fā)。多糖的生物活性與分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[22]，多糖結(jié)構(gòu)比DNA和蛋白質(zhì)復(fù)雜，一級結(jié)構(gòu)(單糖構(gòu)成、構(gòu)型、連接序列、糖苷鍵等)是較高級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)[17]，多糖可能因葡萄糖、甘露糖等單糖組成而與機(jī)體免疫細(xì)胞上高度特異性受體結(jié)合，從而誘導(dǎo)體液或細(xì)胞免疫，發(fā)揮免疫活性[23]。術(shù)苦芩總多糖是術(shù)苦芩復(fù)方的主要活性成分，本研究通過高效液相對術(shù)苦芩總多糖一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步解析，顯示其主要單糖構(gòu)成為鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖，但對術(shù)苦芩多糖結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)與生物活性的關(guān)系仍需進(jìn)一步探究。

高溫高濕環(huán)境下，濕邪內(nèi)蘊(yùn)，熱邪侵入機(jī)體，從而出現(xiàn)仔豬濕熱泄瀉[3]。腸道菌群和機(jī)體免疫功能紊亂與仔豬腹瀉有很強(qiáng)的相關(guān)性[24]。本研究首先探究了術(shù)苦芩總多糖在體外對常見腸道有害菌的影響，同時建立了由環(huán)境及飲食造成的仔豬濕熱泄瀉模型，發(fā)現(xiàn)腹瀉仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)及炎癥相關(guān)細(xì)胞因子水平發(fā)生改變，ZKQPs給藥可以減輕濕熱環(huán)境下仔豬的腹瀉癥狀，這可能是ZKQPs通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)及增強(qiáng)腸道免疫改善了腸道健康。

中藥主要提取物多糖具有抑制致病菌生長的作用，是近來代替抗生素作為抗菌劑的優(yōu)質(zhì)新型天然產(chǎn)物[25]。大腸桿菌、沙門菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌是引起仔豬腹瀉常見的致病菌[26]，本研究評估了術(shù)苦芩總多糖對大腸桿菌、沙門菌、豬源產(chǎn)氣莢膜梭菌的體外抗菌活性。結(jié)果表明，革蘭陽性菌豬源產(chǎn)氣莢膜梭菌對ZKQPs最為敏感，ZKQPs對革蘭陰性菌沙門菌和大腸桿菌也表現(xiàn)出一定的抑菌作用。由3種常見腸道致病菌生長曲線可見，ZKQPs降低了3種致病菌生長的平臺期，縮短了其對數(shù)生長的時間，降低了致病菌的生長活性，并且這種影響具有劑量依賴性。體外抑菌試驗在一定程度上反映了ZKQPs對常見腹瀉相關(guān)致病菌具有較好的抑菌效果，但其對病原菌的抑制作用與仔豬濕熱泄瀉之間的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。腸道致病菌和益生菌的數(shù)量變化可作為維持腸道健康的重要指標(biāo)[27]，本試驗檢測了不同組別中仔豬腸道內(nèi)兩種具有代表性的細(xì)菌數(shù)量變化，以此初步反映腸道微生物結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明，模型組仔豬腸道的大腸桿菌數(shù)量明顯升高而乳酸桿菌數(shù)量及其比值明顯降低，提示腹瀉仔豬腸道菌群發(fā)生失調(diào)，從而使腸道抵抗病原菌的能力下降[28]。而ZKQPs 明顯降低了腹瀉仔豬腸道大腸桿菌數(shù)量，增加了乳酸桿菌數(shù)量，這可能是術(shù)苦芩總多糖有效防治濕熱泄瀉證的機(jī)制之一。

為進(jìn)一步闡明腸道微生物與藥物治療腹瀉疾病是否有關(guān)，試驗采用了16S rDNA測序分析由濕熱環(huán)境和飼養(yǎng)不當(dāng)造成腹瀉及用不同濃度ZKQPs治療的仔豬腸道微生物豐度和多樣性。OTU分析和α多樣性表明腹瀉仔豬腸道微生物豐度和多樣性均降低，在ZKQPs治療后，OTU數(shù)目、Shannon、Chao1和ACE指數(shù)均升高，表明腸道微生物的物種豐度增加，菌群豐度顯著恢復(fù)[29]，其中，ZKQPs中劑量組變化最為明顯。PCoA分析也進(jìn)一步顯示，各組腸道菌群具有較高的穩(wěn)定性，且在微生物結(jié)構(gòu)上具有顯著差異。本試驗研究了腸道菌群在門、綱、屬水平上的分布，擬桿菌、硬毛菌和變形桿菌是優(yōu)勢菌門，與報道一致[30]。在ZKQPs治療后，仔豬腸道芽胞桿菌綱、梭狀芽胞桿菌和乳酸桿菌屬顯著增加，梭菌綱顯著下降，而芽胞桿菌、乳酸桿菌等已被證實在腹瀉疾病的治療中發(fā)揮有益作用，本試驗結(jié)果與Yue等[31]的結(jié)論一致。

腸道作為機(jī)體最大的免疫器官，對腸道正常菌群結(jié)構(gòu)的維持以及外來病原菌的防御起著至關(guān)重要的作用[32]。腸道免疫系統(tǒng)與腸道菌群相互作用，密切影響著免疫復(fù)合體的形成和炎癥反應(yīng)的發(fā)生，同時腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變可以誘導(dǎo)Th1和Th2免疫反應(yīng)之間的競爭，如在Zhou等[33]的報道中，腸道感染后引起梭狀芽胞桿菌、乳酸桿菌等菌群結(jié)構(gòu)的改變，從而促進(jìn)IL-4和IL-5(Th2免疫反應(yīng))的產(chǎn)生，同時使IL-2和IFN-γ(Th1免疫反應(yīng))降低。IL-2是維持腸道調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和免疫穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[34]，但I(xiàn)L-2的過表達(dá)會誘導(dǎo)腸道炎癥的產(chǎn)生[31]，IL-4、IL-5是維持腸道促炎與抗炎平衡的關(guān)鍵因子[35]。試驗結(jié)果表明，濕熱泄瀉仔豬小腸各段IL-2 mRNA表達(dá)異常升高，造成了仔豬的腸道免疫失調(diào)，誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生，這與Feng等[36]的研究結(jié)果相一致，ZKQPs治療后可以降低IL-2水平，同時促進(jìn)Th2型抗炎因子IL-4和IL-5的表達(dá)，有效調(diào)節(jié)了腹瀉仔豬腸道免疫反應(yīng)，緩解了腸道炎癥。

4 結(jié) 論

由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖等單糖組成的ZKQPs對腸道常見有害菌的生長具有抑制作用，能增加濕熱泄瀉仔豬腸道乳酸桿菌的數(shù)量，減少大腸桿菌定植，可能通過改善了濕熱環(huán)境下腹瀉仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)及免疫反應(yīng)，增強(qiáng)了仔豬對濕熱環(huán)境的適應(yīng)力和抵抗腹瀉的能力。