高脂飼糧對(duì)小鼠攝食節(jié)律與肝臟核心時(shí)鐘蛋白表達(dá)的影響

羅 佳 閆 征 李勝濤 盧卓恒 章浩月 徐麗萍 王 欣

(寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，寧波315211)

代謝綜合征(metabolic syndrome,MS)，世界衛(wèi)生組織將其定義為以腹型肥胖、胰島素抵抗、高血壓和高脂血癥為特征的一種病理狀態(tài)，患病率逐年增加，成為世界范圍內(nèi)不斷升級(jí)的公共衛(wèi)生問題[1]。肥胖是MS的主要組成成分和初始化因素，多種理論及研究對(duì)全球肥胖流行進(jìn)行了解釋和探索，最終將其原因歸結(jié)于高脂肪和高能量密集飲食的供應(yīng)和消耗[2]。晝夜節(jié)律是基因表達(dá)、代謝和行為的循環(huán)，由內(nèi)部時(shí)鐘因子產(chǎn)生，控制著能量消耗與多種代謝功能[3-4]。晝夜節(jié)律改變與MS形成密不可分。

晝夜節(jié)律振蕩通常是由轉(zhuǎn)錄調(diào)控反饋環(huán)產(chǎn)生，該環(huán)包括Clock、Bmal1、Per、Cry等時(shí)鐘基因[5]。飲食、自然光線和其他環(huán)境因素的日常節(jié)律變化決定了大多哺乳動(dòng)物生物鐘的節(jié)奏。Li等[6]研究發(fā)現(xiàn)，8周高脂飼糧(high-fat diet,HFD)飼養(yǎng)后，小鼠肝臟Clock、Bmal1、Per2、Cry2等核心時(shí)鐘基因表達(dá)明顯減弱，晝夜差削弱。Kohsaka等[7]報(bào)道，小鼠食用HFD 6周后，中樞下丘腦Clock、Bmal1、Per表達(dá)與節(jié)律振蕩無明顯變化，脂肪組織Clock表達(dá)明顯下調(diào)，而其在肝臟組織只有較小變化。Yanagihara等[8]發(fā)現(xiàn)，小鼠飼養(yǎng)8周HFD誘導(dǎo)MS發(fā)生，但對(duì)脂肪與肝臟組織中時(shí)鐘基因的節(jié)律表達(dá)僅僅只有微小的影響。

HFD對(duì)核心時(shí)鐘蛋白表達(dá)的影響仍有爭(zhēng)議，且現(xiàn)有研究多聚焦于核心時(shí)鐘基因表達(dá)的差異。HFD常用于誘導(dǎo)MS、肥胖、脂肪肝等代謝性疾病，然而不同研究使用的飼糧脂肪含量有一定差異，誘導(dǎo)MS最佳脂肪含量不明。因此，本研究以飼喂不同脂肪含量飼糧的小鼠為試驗(yàn)對(duì)象，探究誘導(dǎo)MS的最佳飼糧脂肪含量，明確攝食節(jié)律和肝臟生物鐘是否在HFD誘導(dǎo)MS等代謝性疾病過程中發(fā)揮重要作用，通過分析蛋白與基因表達(dá)去探究其中的分子機(jī)制，以期為探討MS的發(fā)病機(jī)制提供有價(jià)值的探索方向。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)動(dòng)物為來源于美國(guó)國(guó)立癌癥研究院129/Sv遺傳背景小鼠，飼養(yǎng)于寧波大學(xué)無特定病原體(SPF)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)環(huán)境溫度24 ℃，相對(duì)濕度50%～70%，12 h明12 h暗晝夜循環(huán)，自由攝食與飲水，在正式試驗(yàn)前小鼠接受1周適應(yīng)性飼養(yǎng)。所有處理均通過倫理學(xué)審批(動(dòng)物倫理審批編號(hào)“202010257”)，并按照寧波大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)批準(zhǔn)的方案進(jìn)行。

為避免激素對(duì)研究結(jié)果的干擾，本研究采用健康雄性小鼠，并將其隨機(jī)分為4組，即Con組、10%HFD組、45%HFD組和60%HFD組，每組5只。Con組小鼠飼喂脂肪含量為4%的普通飼糧，10%HFD組、45%HFD組和60%HFD組小鼠分別飼喂脂肪含量為10%、45%、60%的HFD，飼養(yǎng)3個(gè)月。每周測(cè)量并記錄所有小鼠體重，試驗(yàn)結(jié)束前進(jìn)行口服糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test,OGTT)，所有小鼠禁食12 h后測(cè)量空腹血糖濃度，然后按3 g/kg BW劑量給予單次口服葡萄糖，分別在30、60、120 min的時(shí)間點(diǎn)取尾靜脈血15 μL，糖耐量試驗(yàn)結(jié)束3 d后，待小鼠恢復(fù)至正常的體征后脫頸處死。

為了進(jìn)一步探索HFD與攝食節(jié)律之間的聯(lián)系，將8周齡小鼠分為Con組與45%HFD組，每組5只。Con組小鼠飼喂普通飼糧，HFD組小鼠第1周飼喂普通飼糧，第2周和第3飼喂脂肪含量為45%的HFD，每周記錄3 d夜晝攝食量，3周后脫頸處死。

1.2 試驗(yàn)材料

脂肪含量為4%的普通飼糧與脂肪含量為10%、45%、60%的HFD均由南通特洛菲飼料科技有限公司提供，其營(yíng)養(yǎng)水平見表1。總膽固醇(TC)試劑盒(210111211)、甘油三酯(TG)試劑盒(201211202)，寧波美康生物科技股份有限公司；蘇木素(G1140)、伊紅染液(G1100)、RIPA(R0010)，上海索寶生物科技有限公司；BCA蛋白測(cè)定試劑盒(P0011)、5×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣緩沖液(P0015L)，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；CLOCK抗體(49586)，美國(guó)SAB公司；BMAL1抗體(ab93806)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體(ab181602)，美國(guó)Abcam公司；RNA-Solv Reagent(R6830-02)，美國(guó)Omega Bio-Tek公司；反轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒(CW2569M)、定量PCR(qPCR)試劑盒(CW0957H)，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

試驗(yàn)儀器：血糖測(cè)試儀(Johnson，美國(guó))、MagNA Lyser組織勻漿機(jī)與lightcycle 480 Ⅱ定量PCR儀(Roche，瑞士)、Muitiskan Go酶標(biāo)儀(賽默飛，上海)、化學(xué)發(fā)光儀(勤翔，上海)、光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本)、純水機(jī)(利康，上海)。

表1 普通飼糧與高脂飼糧營(yíng)養(yǎng)水平(飼喂基礎(chǔ))

1.3 標(biāo)本采集及保存

將采集的小鼠血液置于1.5 mL含肝素離心管中，3 600 r/min離心20 min，取上清保存于-20 ℃?zhèn)溆?。取小鼠肝臟，用生理鹽水沖洗，吸干水分后稱重。切取新鮮分離的1/2肝大葉，立即固定在10%福爾馬林緩沖液(體積為肝組織的4～5倍)中，其余肝組織切成小塊后在干冰中快速冷凍，然后保存在-80 ℃冰箱，以待分析。

1.4 生化分析和肝臟組織病理學(xué)分析

根據(jù)生化試劑盒的說明，采用終點(diǎn)法測(cè)定血清與肝臟中脂質(zhì)代謝指標(biāo)TC和TG的含量。切取2～3 mm固定在10%福爾馬林緩沖液中肝組織，在70%、80%、90%和100%的酒精濃度中進(jìn)行梯度脫水1 h，再使用二甲苯透明2次，每次15 min，浸蠟3次，每次1 h，石蠟包埋，制成4 μm切片，43 ℃攤片，37 ℃烤片過夜，待玻片恢復(fù)至室溫后常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色。染色后，用中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡觀察肝臟中病理形態(tài)學(xué)改變。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印記分析

稱取20 mg肝臟組織，加入含有1%PMSF的高效RIPA進(jìn)行裂解，組織勻漿機(jī)充分勻漿，樣品在4 ℃以13 000 r/min的速度離心20 min，收集上清液，采用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品蛋白濃度，然后進(jìn)行蛋白定量和歸一，加入等量5×SDS-PAGE上樣緩沖液后，金屬浴8 min。制備10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，加蛋白樣品，電泳2h至蛋白分離后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上1 h，然后用5%奶粉封閉PVDF膜3.5 h，使用TBST洗滌5 min，洗滌3次，對(duì)TBST洗滌好的PVDF膜在4 ℃一抗孵育過夜，隔日取出后，使用TBST洗滌10 min，洗滌3次，對(duì)TBST洗滌好的PVDF膜在室溫二抗孵育2 h，再次TBST洗滌10 min，連續(xù)3次，將經(jīng)過ECL化學(xué)發(fā)光液處理的膜在化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行曝光，用Image J 1.8.0進(jìn)行蛋白條帶灰度分析。

1.6 qPCR檢測(cè)時(shí)鐘基因mRNA表達(dá)量

稱取20 mg肝臟組織，加入200 μL RNA-Solv Reagent后進(jìn)行勻漿，加入適量氯仿充分混勻后，樣品在4 ℃以12 000 r/min的速度離心20 min，提取上清后加入等量異丙醇沉淀RNA，再加入焦碳酸二乙酯(DEPC)水配制的75%乙醇洗滌2次，最后加入DEPC水溶解RNA。采用Muitiskan Go酶標(biāo)儀測(cè)定RNA濃度，用260與280 nm處吸光度的比值判斷其純度。取1 μg RNA，2 μL dNTP Mix，2 μL 5XRT Buffer，1 μL Primer Mix，1 μL DTT，無酶水補(bǔ)足至10 μL，50 ℃孵育45 min，85 ℃孵育5 min，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。取1 μL cDNA，2.2 μL 2×UltraSYBR Mixture，0.1 μL上游引物，0.1 μL下游引物，1.6 μL DEPC水，混合成5 μL的體系，上機(jī)反應(yīng)程序按照羅氏試劑盒說明書進(jìn)行變性、退火和延伸設(shè)置，引物序列見表2。以18S rRNA作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法定量目的基因mRNA的表達(dá)量，以對(duì)照組標(biāo)化數(shù)據(jù)為1，去得到各HFD組目的基因的表達(dá)差異。

表2 本研究所采用的引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2組間比較使用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Dunnett法。P<0.05認(rèn)為差異顯著具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 HFD脂肪含量與小鼠MS的關(guān)系

由圖1可知，小鼠飼喂普通飼糧和含10%、45%、60%脂肪的HFD 3個(gè)月后，10%HFD組、45%HFD組和60%HFD組體重均大于Con組，且45%HFD組體重增長(zhǎng)超過其他3組，10%HFD組、45%HFD組和60%HFD組小鼠的體重分別為(32.00±1.74) g、(39.82±3.75) g、(35.96±4.04) g，與試驗(yàn)前體重相比，45%HFD組、60%HFD組體重分別顯著增長(zhǎng)了92.09%(P<0.05)、74.31%(P<0.05)，但對(duì)10%HFD組體重增長(zhǎng)不顯著(P>0.05)，說明HFD會(huì)誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)體重增加甚至肥胖。

圖A中數(shù)據(jù)點(diǎn)標(biāo)注“*”表示與試驗(yàn)前相比差異顯著(P<0.05)。圖B中數(shù)據(jù)點(diǎn)標(biāo)注“*”表示與Con組差異顯著(P<0.05)。

OGTT結(jié)果顯示，Con組和10%HFD組在4個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)(0、30、60、120 min)血糖濃度變化趨勢(shì)是一致的，說明10%HFD組小鼠糖耐量結(jié)果呈陰性；45%HFD組和60%HFD組小鼠在30、60 min時(shí)血糖濃度均顯著高于Con組(P<0.05)，在30 min時(shí)2組升高幅度分別是Con組的1.25、1.31倍(P<0.05)，在60 min時(shí)2組升高幅度分別是Con組的1.43、1.41倍；120 min時(shí)，各組血糖濃度均下降，45%HFD組小鼠下降到Con組水平，而60%HFD組小鼠仍高于Con組，說明HFD會(huì)誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)糖耐量異常。

由圖2可知，給予不同脂肪含量飼糧后，血清TG含量各組間均無顯著差異(P>0.05)。與Con組相比，45%HFD組和60%HFD組血清TC含量分別顯著升高了93.32%(P<0.05)、72.69%(P<0.05)。與血清TC含量相似，45%HFD組和60%HFD組肝臟TC與TG含量均較Con組顯著升高(P<0.05)。

以上試驗(yàn)結(jié)果說明HFD會(huì)誘導(dǎo)MS發(fā)生，但不會(huì)隨著飼糧中脂肪含量增加而呈正相關(guān)增加，45%HFD組小鼠MS紊亂嚴(yán)重于60%HFD組，可能與60%HFD組飼糧過于油膩，導(dǎo)致小鼠實(shí)際消耗量減少有關(guān)，也可能與多因素影響下的肝臟脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)破壞有關(guān)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注“*”表示與Con組差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.2 小鼠肝臟組織形態(tài)

由圖3可知，在光學(xué)顯微鏡下，Con組的肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列成肝索，在中央靜脈周圍呈放射狀分布，細(xì)胞質(zhì)均勻，無脂肪變性。10%HFD組的肝組織結(jié)構(gòu)無明顯異常，與Con組無明顯差異。45%HFD組的肝組織結(jié)構(gòu)完好，可見肝小葉，但是細(xì)胞核被擠壓到一側(cè)，出現(xiàn)明顯空泡，發(fā)生脂肪變性。60%HFD組仍可見部分空泡，數(shù)量上較45%HFD組明顯減少。病理切片圖顯示45%和60%HFD誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)肝臟脂肪變性，而前者作用更強(qiáng)。

圖3 肝臟切片HE染色圖像

2.3 HFD改變了小鼠攝食節(jié)律

CLOCK與BMAL1是調(diào)控節(jié)律的2個(gè)核心時(shí)鐘蛋白，如圖4所示，蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果顯示，與Con組相比，10%HFD組、45%HFD組和60%HFD組小鼠肝臟中CLOCK蛋白表達(dá)量明顯減弱，而BMAL1蛋白表達(dá)量無明顯差異。qPCR結(jié)果顯示各組小鼠肝臟中Clock、Bmal1 mRNA表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)。上述結(jié)果說明HFD引起小鼠肝臟節(jié)律改變是通過蛋白水平，而非基因水平。

圖4 各組小鼠肝臟中核心時(shí)鐘蛋白和基因表達(dá)變化

由于45%HFD組MS與脂肪肝最嚴(yán)重，故再次設(shè)計(jì)試驗(yàn)比較Con組與45%HFD組晝夜節(jié)律變化。如圖5所示，波峰、波谷分別是小鼠夜晚、白天的攝食節(jié)律，波峰、波谷的差異體現(xiàn)了小鼠晝夜節(jié)律的差異。當(dāng)2組小鼠給予普通飼糧時(shí)，基線水平的節(jié)律振幅沒有明顯的差異。45%HFD組給予45%HFD 1周后，白天與夜晚節(jié)律振幅波動(dòng)減弱，夜間節(jié)律振幅減弱較明顯；給予45%HFD 2周后，這種晝夜節(jié)律振幅減弱更加明顯。給予45%HFD 1和2周后，夜/晝攝食量均顯著降低(P<0.05)。從攝食行為上可見，在45%HFD的干預(yù)下，小鼠日間攝食量顯著增加，而夜間攝食量顯著減少，HFD抑制了小鼠晝夜攝食節(jié)律。

圖5 HFD對(duì)小鼠攝食節(jié)律的影響

如圖6所示，給予45%HFD后，肝臟中CLOCK的蛋白表達(dá)量明顯減弱，而BMAL1的蛋白表達(dá)量沒有明顯變化?；叶确治鲲@示45%HFD組肝臟中CLOCK的蛋白表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，BMAL1的蛋白表達(dá)量在2組之間無顯著差異(P>0.05)。qPCR結(jié)果顯示HFD對(duì)肝臟中Clock、Bmal1 mRNA表達(dá)量無顯著影響(P>0.05)。

圖6 HFD對(duì)小鼠肝臟核心時(shí)鐘蛋白與基因表達(dá)的影響

3 討 論

3.1 45%HFD誘導(dǎo)MS的作用最強(qiáng)

肥胖是以體脂肪沉積為特征，主要由能量攝入與消耗不平衡造成，尤其當(dāng)攝入HFD時(shí)易發(fā)生肥胖[9]。建立MS、脂肪肝等模型通常使用HFD誘導(dǎo)，而不同的試驗(yàn)研究使用的飼糧脂肪含量有一定差異，文獻(xiàn)報(bào)道嚙齒類動(dòng)物給予含22.5%脂肪的飼糧飼養(yǎng)20周、含45%脂肪的飼糧飼養(yǎng)10周、含60%脂肪的飼糧飼養(yǎng)12周均可誘導(dǎo)MS的發(fā)生[10-12]。但未有試驗(yàn)探討不同脂肪含量飲食誘導(dǎo)的MS之間的差異，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)45%和60%HFD皆誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)MS，然而其并不與飼糧中脂肪含量的增加持續(xù)正相關(guān)，其中45%HFD組小鼠體重增加最快，且出現(xiàn)糖耐量異常，血脂、肝脂含量均升高，特別是病理切片可見明顯肝臟脂肪變性。而60%HFD組小鼠也出現(xiàn)上述癥狀與體征，但病理切片中氣球樣變和脂肪變性較少，可能是由于脂肪含量增加使得飼糧口味過于油膩，小鼠攝食量減少造成的。

3.2 HFD改變攝食節(jié)律

進(jìn)食/禁食周期循環(huán)是外周組織中時(shí)鐘的主要時(shí)間線，HFD通過削弱進(jìn)食/禁食周期，對(duì)嚙齒類動(dòng)物的晝夜節(jié)律系統(tǒng)組織產(chǎn)生有害的影響，而外周組織時(shí)鐘，如肝臟時(shí)鐘，對(duì)食物的成分非常敏感[13]。高熱量高脂飲食會(huì)引起行為和分子晝夜節(jié)律的改變，由此改變肝臟的能量利用和代謝[14-15]。正常居民從低脂飲食轉(zhuǎn)換到高脂飲食1周后Bmal1節(jié)律振蕩減緩并延遲，Cry1與Cry2節(jié)律振蕩提前，轉(zhuǎn)換高脂飲食5周后，節(jié)律改變更加顯著[16]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用HFD飼喂的小鼠仍表現(xiàn)出了整體的晝夜節(jié)律，但這種節(jié)律卻在減弱，HFD抑制攝食節(jié)律行為，使白天攝食增加而夜間攝食減少，這與前人研究結(jié)果[7]一致。

3.3 HFD下調(diào)肝臟核心時(shí)鐘蛋白表達(dá)

核心時(shí)鐘基因產(chǎn)物Clock/Bmal1異二聚體作為轉(zhuǎn)錄因子參與肝臟代謝的調(diào)控[17]。全身敲除Clock，小鼠更容易發(fā)生肝臟脂肪變性、高脂血癥等代謝性疾病[18]。Bmal1敲除后，即使在正常飲食下，小鼠也發(fā)生脂肪肝、糖耐量損害等[19]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HFD對(duì)肝臟核心時(shí)鐘基因Clock、Bmal1的表達(dá)無顯著影響，與前人研究結(jié)果[8]一致；HFD對(duì)BMAL1蛋白的表達(dá)幾乎沒有作用，可能是因?yàn)锽MAL1不是所有分子振蕩都必須的，特別是在整個(gè)基因組或蛋白質(zhì)組水平上[20]；HFD使CLOCK蛋白的表達(dá)量顯著下降，推測(cè)HFD通過改變攝食行為與時(shí)鐘因子節(jié)律而誘導(dǎo)MS發(fā)生，時(shí)鐘因子節(jié)律的改變可能是通過下調(diào)肝臟CLOCK蛋白的表達(dá)，而非基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，具體的調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步探究與驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

綜上可知，脂肪含量為45%的HFD誘導(dǎo)小鼠MS和肝臟脂肪變性的作用最強(qiáng)，并與肝臟CLOCK蛋白表達(dá)量下降密切相關(guān)。HFD抑制小鼠攝食節(jié)律，其機(jī)制可能與肝臟核心時(shí)鐘蛋白CLOCK表達(dá)的下調(diào)有關(guān)，而與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系不大。