李潤(rùn)林 趙道遠(yuǎn) 李盼盼 雷銘康 吳佳慶 吳建民 汪 晶* 朱偉云

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，國(guó)家動(dòng)物消化道營(yíng)養(yǎng)國(guó)際聯(lián)合研究中心，南京210095；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，南京210095)

植物提取物是從天然植物和植物產(chǎn)品中提取出來(lái)的活性物質(zhì)，其綠色無(wú)污染且具有多種益生作用，如緩解炎癥反應(yīng)、改善腸道菌群組成等[1]。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)單一植物提取物需要大量添加才能發(fā)揮有效的益生作用，并且其對(duì)于潛在致病菌的抑制作用相對(duì)單一，而復(fù)合植物提取物可以通過(guò)協(xié)同或疊加效應(yīng)更好地發(fā)揮抑菌和益生作用，對(duì)于提高動(dòng)物健康狀況具有更好的效果。

百里香精油具有廣譜抑菌、消炎和提高機(jī)體抗氧化等作用，其作為一種有效的抗生素替代產(chǎn)品已在眾多研究中得到證實(shí)。研究發(fā)現(xiàn)百里香酚對(duì)多種致病菌的增殖具有抑制作用[2-3]，它能夠通過(guò)抑制α-溶血素、腸毒素等相關(guān)酶的合成，降低腫瘤壞死因子的活性，進(jìn)而對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用[3]，亦能通過(guò)改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和通透性達(dá)到抑制沙門(mén)氏菌增殖的作用[4]。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明百里香酚能夠有效減輕卵清蛋白等細(xì)胞因子誘導(dǎo)引發(fā)的炎癥反應(yīng)[5]，并且能夠增強(qiáng)斷奶仔豬腸道的消化和吸收功能，同時(shí)增強(qiáng)腸道微生物群對(duì)致病菌的抵抗能力，提高抗菌活性，進(jìn)而有效地改善仔豬腸道菌群組成[6]。并且，還有研究發(fā)現(xiàn)飼糧添加10 mg/kg的百里香酚能有效避免豬鏈球菌2型感染引起的炎癥反應(yīng)[7]。亦有研究發(fā)現(xiàn)灌胃10 mL/kg BW的濃度為500 mg/kg的百里香精油制劑能有效緩解硫代乙酰胺誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷[8]。迷迭香酸也具有較強(qiáng)的抗菌活性，能夠有效抑制大腸桿菌、鏈球菌等多種潛在致病菌的生長(zhǎng)，其代謝產(chǎn)物1,8-桉葉素能夠通過(guò)破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜，繼而起到抑制沙門(mén)氏菌增殖的作用[9]。動(dòng)物試驗(yàn)表明小鼠每天灌胃20或40 mg/kg的迷迭香酸能夠通過(guò)調(diào)節(jié)氧化/抗氧化平衡對(duì)哮喘小鼠氧化性肺損傷起到明顯的保護(hù)作用[10]。但在畜禽生產(chǎn)中關(guān)于迷迭香酸的應(yīng)用研究相對(duì)較少，現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)迷迭香酸在提高機(jī)體抗氧化活性、降低機(jī)體炎癥反應(yīng)[11]和改善肉品質(zhì)[12]等方面具有較好效果。

目前對(duì)于復(fù)合植物提取物的研究也有了較多進(jìn)展。香芹酚和百里香酚組合在體外條件下能夠顯著提高對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌等條件性致病菌的抑制效果[13]。并且，百里香酚和苯甲酸復(fù)合物能夠促進(jìn)仔豬腸道發(fā)育，提高仔豬生長(zhǎng)性能[14]。綜上所述，百里香酚具有較好地抑制條件致病菌增殖的作用。而迷迭香酸作為一種酚酸性植物提取物，不僅能配合百里香酚的抑菌作用，其自身也具有抑菌、消炎和抗氧化等作用，兩者配合使用可能具有更好地促進(jìn)動(dòng)物腸道健康的效果?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，我們認(rèn)為百里香酚與迷迭香酸組合可能在提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能，改善幼齡動(dòng)物腸道屏障功能，調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)及緩解炎癥反應(yīng)等方面具有較好的效果。因此，本試驗(yàn)通過(guò)建立脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的大鼠腸道炎癥模型，研究百里香酚與迷迭香酸組合對(duì)大鼠空腸屏障功能、菌群結(jié)構(gòu)及炎癥反應(yīng)的影響，為其在預(yù)防和減少腸道炎癥反應(yīng)，改善動(dòng)物腸道健康等方面的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

飼養(yǎng)試驗(yàn)于2019年12月至2020年1月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心完成。百里香酚和迷迭香酸均購(gòu)自上海某生物有限公司，純度≥98%。LPS試劑購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選40只初始體重為(54.86±2.26) g的21日齡SD大鼠，公母各占1/2。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將大鼠隨機(jī)分為4組，分別為對(duì)照組(Con組)、百里香酚組(Thy組)、迷迭香酸組(Ros-A組)、百里香酚×迷迭香酸組(Thy×Ros-A組)，每組10只(公母各占1/2)，單籠飼養(yǎng)。所有大鼠均飼喂同一基礎(chǔ)飼糧，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平如表1所示。百里香酚組、迷迭香酸組和百里香酚×迷迭香酸組每天分別灌胃20 mg/kg BW的百里香酚、20 mg/kg BW的迷迭香酸、10 mg/kg BW百里香酚+10 mg/kg BW迷迭香酸組合制劑，Con組每天灌胃等量的生理鹽水。所有大鼠連續(xù)灌胃14 d。在第13天，對(duì)照組、百里香酚組、迷迭香酸組和百里香酚×迷迭香酸組腹腔注射500 μg/kg BW的LPS溶液建立急性腸道炎癥模型，攻毒劑量參考Yao等[15]的試驗(yàn)。腹腔注射LPS 12 h后進(jìn)行屠宰取樣。試驗(yàn)期間大鼠自由采食和飲水，按照常規(guī)免疫、消毒程序進(jìn)行飼養(yǎng)管理。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目 Items含量 Content食鹽 NaCl0.30礦物質(zhì)預(yù)混料 Mineral premix1)0.50維生素預(yù)混料 Vitamin premix2)0.50合計(jì) Total100.00營(yíng)養(yǎng)水平 Nutrient levels3)粗蛋白質(zhì) Crude protein20.96粗脂肪 Crude fat4.05粗纖維 Crude fibre4.29

1.3 樣品采集

試驗(yàn)第14天(LPS注射后12 h)，將大鼠麻醉后采用斷頭法處死，采集空腸中段組織3～4 cm置于4%多聚甲醛溶液中固定。取空腸黏膜及食糜樣品，液氮速凍后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 生長(zhǎng)性能測(cè)定

每只大鼠為1個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)的第1天和第14天分別對(duì)大鼠進(jìn)行稱(chēng)重，并計(jì)算平均日增重。

1.4.2 空腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

將采集的空腸組織置于4%多聚甲醛溶液中固定。參照常規(guī)方法制作切片，經(jīng)過(guò)脫水、包埋、切片和蘇木精-伊紅(HE)染色后使用虛擬顯微鏡觀察腸道切片的形態(tài)結(jié)構(gòu)。采用Image-Pro Plus圖像處理系統(tǒng)測(cè)定每張切片中5個(gè)典型視野，測(cè)定絨毛高度和隱窩深度，并計(jì)算絨毛高度/隱窩深度(即絨隱比)。

1.4.3 空腸黏膜中抗氧化指標(biāo)和細(xì)胞因子含量測(cè)定

抗氧化指標(biāo)：總超氧化物歧化酶(T-SOD)與谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性、丙二醛(MDA)含量、總抗氧化能力(T-AOC)均采用比色法進(jìn)行檢測(cè)，采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒按照試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。炎癥因子含量：白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量與髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性均采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法測(cè)定，采用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定，試劑盒購(gòu)自酶聯(lián)生物有限公司，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。

1.4.4 空腸黏膜中相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量測(cè)定

空腸黏膜總RNA采用Trizol法提取，用RNA的260和280 nm處吸光度比值(OD260/280值)鑒定RNA質(zhì)量。反轉(zhuǎn)錄使用TOYOBO公司的ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix試劑盒，帶有g(shù)DNA清除功能。使用ABM公司的EvaGreen 2×qPCR Master Mix進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)。以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因，目的基因和內(nèi)參基因的引物序列見(jiàn)表2。PCR條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；然后95 ℃變性15 s，60 ℃延伸60 s，持續(xù)40個(gè)循環(huán)。采用循環(huán)閾值(Ct值)進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增的相對(duì)定量。采用比較Ct值法比較目的基因相對(duì)于β-actin的表達(dá)量。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物

續(xù)表2基因Genes引物序列Primer sequence (5'—3')產(chǎn)物大小Product size/bp序列號(hào)Accession No.白細(xì)胞介素1受體關(guān)聯(lián)激酶1 IRAK1F:CTCCTCCATCAAGCCAAGCCR:CACACCCAAAACCACCCTCT149NM_001127555.1腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6 TRAF6F:CGCCAAAATGGAAACGCAGAR:TGCTTCCATCTCGGCAACTT88NM_001107754.2閉鎖連接蛋白-1 ZO-1F:GAGGATGGTCACACCGTGGTR:GGAGGATGCTGTTGTCTCGG169XM_0210988961.1閉合蛋白-1 Claudin-1F:GCCCTACTTTGCTGCTCCTGR:TTTCTGGTTGTTCCCACACG141NM_021098896.1咬合蛋白 OccludinF:ATGCTTTCTCAGCCAGCGTAR:AAGGTTCCATAGCCTC176NM_001163647.2β-肌動(dòng)蛋白 β-actinF:ATGCTTCTAGACGGACTGCGR:GTTTCAGGAGGCTGGCATGA109XM_003357928.4

1.4.5 空腸食糜中短鏈脂肪酸濃度測(cè)定

使用氣相色譜法測(cè)定空腸食糜中短鏈脂肪酸的濃度。預(yù)處理：每個(gè)重復(fù)稱(chēng)取0.30 g的空腸食糜于2.0 mL離心管中，再加入1.2 mL的雙蒸水混勻后，12 000 r/min離心10 min，取上清液0.80 mL，加入0.16 mL 25%偏磷酸巴豆酸混合溶液，-20 ℃保存過(guò)夜。測(cè)定前解凍，4 ℃、12 000 r/min離心10 min。吸取上清液通過(guò)0.22 μm微孔濾膜后待測(cè)。

參照Wang等[17]的方法，使用自動(dòng)進(jìn)樣儀取0.3 μL待測(cè)上清液，瞬時(shí)注入氣相色譜儀(島津GC-14B)中，氣相色譜條件為：毛細(xì)管色譜柱(柱長(zhǎng)為30 m，內(nèi)徑為0.32 mm，膜厚為0.25 μm，Sigma-Aldrich，美國(guó))，柱溫135 ℃，進(jìn)樣口溫度200 ℃，采用氫火焰離子檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度200 ℃，載氣為氮?dú)?，壓力?0 kPa，氫氣壓力為50 kPa，氧氣壓力為50 kPa。

1.4.6 空腸食糜中菌群的高通量測(cè)序

采用十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)的方法提取空腸食糜DNA[17]，提取和純化總DNA后，使用分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度和純度，并將DNA濃度統(tǒng)一稀釋到500 ng/mL。以稀釋后的DNA為模板，使用帶Barcode的特異引物(319F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′；806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)[18]對(duì)提取出的空腸食糜微生物DNA的16S rRNA的V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；同時(shí)使用QuantiFlourTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量，之后按測(cè)序量要求，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行均一化處理；最后，使用Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序及文庫(kù)構(gòu)建。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2021初步處理后，運(yùn)用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素方差分析和Duncan氏法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，P<0.05表示顯著差異，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 百里香酚與迷迭香酸組合對(duì)LPS攻毒大鼠生長(zhǎng)性能的影響

由圖1可知，灌胃7 d后，百里香酚×迷迭香酸組大鼠的體重高于對(duì)照組和單一植物提取物組(百里香酚組、迷迭香酸組)，并且百里香酚×迷迭香酸組大鼠的平均日增重顯著高于對(duì)照組和迷迭香酸組(P<0.05)。上述結(jié)果說(shuō)明灌胃百里香酚和迷迭香酸均能提高大鼠的生長(zhǎng)性能，且以百里香酚與迷迭香酸組合的效果最好。

Con：對(duì)照組；Thy：百里香酚組；Ros-A：迷迭香酸組；Thy×Ros-A：百里香酚×迷迭香酸組。數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.2 百里香酚與迷迭香酸組合對(duì)LPS攻毒大鼠空腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)和屏障功能的影響

由圖2和表3可知，與對(duì)照組相比，灌胃百里香酚與迷迭香酸組合能夠顯著提高大鼠空腸的絨毛高度(P<0.05)，顯著降低隱窩深度(P<0.05)，并且百里香酚×迷迭香酸組大鼠空腸的絨隱比也顯著高于對(duì)照組和單一植物提取物組(P<0.05)。

A：對(duì)照組；B：百里香酚組；C：迷迭香酸組；D：百里香酚×迷迭香酸組。

表3 百里香酚和迷迭香酸組合對(duì)LPS攻毒大鼠空腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由圖3可知，與對(duì)照組相比，百里香酚×迷迭香酸組大鼠空腸黏膜中ZO-1、Occludin和Claudin-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)，并且其相對(duì)表達(dá)量也高于(P>0.05)或顯著(P<0.05)高于單一植物提取物組。上述結(jié)果說(shuō)明灌胃百里香酚與迷迭香酸組合能夠在一定程度上緩解LPS攻毒對(duì)大鼠空腸屏障功能產(chǎn)生的負(fù)面影響。

圖3 百里香酚與迷迭香酸組合對(duì)LPS攻毒大鼠空腸黏膜中緊密連接蛋白基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

2.3 百里香酚與迷迭香酸組合對(duì)LPS攻毒大鼠空腸食糜中菌群結(jié)構(gòu)和代謝產(chǎn)物的影響

2.3.1 百里香酚與迷迭香酸組合對(duì)LPS攻毒大鼠空腸食糜中微生物多樣性的影響

表4所示為大鼠空腸食糜微生物α多樣性結(jié)果。百里香酚×迷迭香酸組的Shannon指數(shù)顯著低于對(duì)照組、百里香酚組和迷迭香酸組(P<0.05)，而Simpson指數(shù)顯著高于對(duì)照組、百里香酚組和迷迭香酸組(P<0.05)。百里香酚×迷迭香酸組、百里香酚組和迷迭香酸組的Chao1指數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表4 百里香酚與迷迭香酸組合對(duì)空腸食糜中微生物α多樣性的影響

圖4是基于操作分類(lèi)單元(OTU)水平的主成分分析(PCA)。PCA顯示，LPS攻毒后，對(duì)照組、百里香酚組、迷迭香酸組、百里香酚×迷迭香酸組空腸食糜中菌群顯著分開(kāi)，并且ANOSIM分析結(jié)果表明其組間具有顯著差異(R=0.270 2，P=0.004 0)。

圖4 百里香酚與迷迭香酸組合對(duì)LPS攻毒大鼠

2.3.2 百里香酚與迷迭香酸組合對(duì)LPS攻毒大鼠空腸食糜中菌群組成的影響

圖5所示為空腸食糜菌群門(mén)水平豐度>0.1%的菌門(mén)，其中優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為厚壁菌門(mén)(Fimicutes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、藍(lán)藻門(mén)(Cyanobacteria)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)(圖5-A)。在門(mén)水平上對(duì)各菌門(mén)相對(duì)豐度進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析(圖5-B)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組、百里香酚組和迷迭香酸組相比，百里香酚×迷迭香酸組Fimicutes的相對(duì)豐度顯著增加(P<0.05)，Proteobacteria的相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)；百里香酚×迷迭香酸組Actinobacteria和Verrucomicrobia的相對(duì)豐度顯著低于迷迭香酸組(P<0.05)，與對(duì)照組和百里香酚組相比有所降低，但差異不顯著(P>0.05)；此外，百里香酚×迷迭香酸組Cyanobacteria的相對(duì)豐度顯著低于百里香酚組(P<0.05)，略低于對(duì)照組和迷迭香酸組(P>0.05)。

Fimicutes：厚壁菌門(mén)；Proteobacteria：變形菌門(mén)；Cyanobacteria：藍(lán)藻門(mén)；Actinobacteria：放線菌門(mén)；Verrucomicrobia：疣微菌門(mén)；Bacteroidetes：擬桿菌門(mén)；Others：其他。圖6同 the same as Fig.6。

圖6所示為空腸食糜菌群屬水平豐度>0.1%的菌屬，共有12個(gè)，其中乳桿菌屬(Lactobacillus)、羅姆布茨菌屬(Romboutsia)、norank_f_Muribaculacea、Turicibacter、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)為優(yōu)勢(shì)菌屬(圖6-A)。在屬水平上對(duì)各菌屬相對(duì)豐度進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析(圖6-B)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，3個(gè)植物提取物組鏈球菌屬(Streptococcus)、嗜氣性桿菌屬(Rodentibacter)和羅斯氏菌屬(Rothia)的相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)；百里香酚×迷迭香酸組Lactobacillus的相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，百里香酚組和迷迭香酸組Lactobacillus的相對(duì)豐度也高于對(duì)照組，但差異未達(dá)顯著水平(P>0.05)。此外，與單一植物提取物組相比，百里香酚×迷迭香酸組norank_f_Muribaculacea的相對(duì)豐度顯著低于迷迭香酸組(P<0.05)，norank_f_norank_o_Chloroplast的相對(duì)豐度顯著低于百里香酚組(P<0.05)。

Clostridium_sensu_stricto_1：狹義梭菌屬1；Lactobacillus：乳桿菌屬；Romboutsia：羅姆布茨菌屬；Streptococcus：鏈球菌屬；Rodentibacter：嗜氣性桿菌屬；Rothia：羅斯氏菌屬；Bifidobacterium：雙歧桿菌屬；Akkermansia：阿克曼氏菌屬。

2.3.3 百里香酚與迷迭香酸組合對(duì)LPS攻毒大鼠空腸食糜中短鏈脂肪酸濃度的影響

由表5可知，3個(gè)植物提取物組空腸食糜中乙酸和總短鏈脂肪酸濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；此外，百里香酚×迷迭香酸組和百里香酚組大鼠空腸食糜中丙酸和丁酸濃度也顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表5 百里香酚與迷迭香酸組合對(duì)大鼠空腸食糜中短鏈脂肪酸濃度的影響

2.4 百里香酚與迷迭香酸組合對(duì)LPS攻毒大鼠空腸黏膜炎癥反應(yīng)和抗氧化水平的影響

2.4.1 百里香酚與迷迭香酸組合對(duì)LPS攻毒大鼠空腸黏膜炎癥反應(yīng)的影響

由圖7可知，與對(duì)照組相比，百里香酚、迷迭香酸及其組合均能不同程度地降低大鼠空腸黏膜中MPO的活性，其中百里香酚與迷迭香酸組合能顯著降低空腸黏膜中MPO活性(P<0.05)。與對(duì)照組相比，百里香酚×迷迭香酸組空腸黏膜中IL-6的含量顯著降低(P<0.05)，抑炎因子IL-10的含量顯著提高(P<0.05)，TNF-α的含量有降低的趨勢(shì)(P=0.079)。

由圖8可知，與對(duì)照組相比，百里香酚、迷迭香酸及其組合均能不同程度降低大鼠空腸黏膜中TLR-4、MyD88、TRAF-6、IRAK1的mRNA相對(duì)表達(dá)量，其中百里香酚×迷迭香酸組與對(duì)照組的差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)；并且，與單一植物提取物組相比，百里香酚×迷迭香酸組大鼠空腸黏膜中TLR-4、MyD88、TRAF-6、IRAK1的mRNA相對(duì)表達(dá)量也有所降低，但差異未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。

圖8 百里香酚與迷迭香酸組合對(duì)LPS攻毒大鼠空腸黏膜中TLR-4/MyD88信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

2.4.2 百里香酚與迷迭香酸組合對(duì)LPS攻毒大鼠空腸黏膜中抗氧化指標(biāo)的影響

由表6可知，與對(duì)照組、百里香酚組和迷迭香酸組相比，百里香酚×迷迭香酸組大鼠空腸黏膜中T-SOD活性顯著提高(P<0.05)，T-AOC有提高的趨勢(shì)(P=0.059)；此外，百百里香酚×迷迭香酸組大鼠空腸黏膜中GSH-Px活性和MDA含量分別高于和低于對(duì)照組、百里香酚組和迷迭香酸組，但差異未達(dá)顯著水平(P>0.05)。

3 討 論

作為抗生素替代品，百里香酚在多項(xiàng)研究中均表明對(duì)于提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能具有較好的效果。Diao等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在仔豬飼糧中添加100 mg/kg百里香酚和苯甲酸復(fù)合物能夠提高斷奶仔豬的生產(chǎn)性能，提高仔豬的平均日增重，并能夠促進(jìn)仔豬腸道發(fā)育。Yan等[12]研究顯示，在杜×長(zhǎng)×大肥育豬飼糧中添加0.01%百里香精油能夠提高育肥豬的生產(chǎn)性能和肉品質(zhì)，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率。Mathlouthi等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在1日齡雛雞飼糧中添加100 mg/kg迷迭香酸能夠提高其生長(zhǎng)性能，降低腸道大腸桿菌數(shù)量，顯著降低腹瀉率，并具有替代抗生素的效果。雖然目前還沒(méi)有百里香酚和迷迭香酸對(duì)于大鼠影響的相關(guān)研究，但其對(duì)于雞和仔豬的研究也能反映其作為抗生素替代品的效果。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)百里香酚、迷迭香酸以及二者組合均能提高大鼠的生長(zhǎng)性能。并且，從第7天起百里香酚×迷迭香酸組大鼠的體重開(kāi)始高于對(duì)照組和百里香酚組、迷迭香酸組，并且百里香酚×迷迭香酸組大鼠的平均日增重顯著高于對(duì)照組和迷迭香酸組。這表明灌胃百里香酚和迷迭香酸組合對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能的改善效果優(yōu)于百里香酚或迷迭香酸的單一添加。

表6 百里香酚和迷迭香酸組合對(duì)LPS攻毒大鼠空腸黏膜中抗氧化指標(biāo)的影響

生長(zhǎng)性能的改善常伴隨著生理結(jié)構(gòu)的變化，而腸道健康與動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育有緊密聯(lián)系。腸道絨毛高度和隱窩深度是評(píng)價(jià)動(dòng)物腸道黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)。腸道絨毛高度增加，能夠增加腸絨毛單位面積的細(xì)胞數(shù)，進(jìn)而提高腸道吸收能力；隱窩深度增加會(huì)使組織的周轉(zhuǎn)加快，增加維持的能量需求，降低吸收效率[20]。絨隱比反映小腸的功能狀態(tài)，其值降低表明腸道整體消化吸收能力的下降。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)大鼠灌胃百里香酚、迷迭香酸及其組合不僅能增加LPS攻毒大鼠空腸黏膜的絨毛高度，降低隱窩深度，提高絨隱比，而且與對(duì)照組相比，百里香酚×迷迭香酸組達(dá)到顯著水平。這表明百里香酚、迷迭香酸及其組合均能減少LPS攻毒引起的大鼠腸道損傷，促進(jìn)腸道的消化吸收功能，并且百里香酚與迷迭香酸組合的效果更為顯著。周洪彬等[21]研究表明，在肉仔雞飼糧中添加百里香酚和香芹酚等均可提高腸道黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)。Cheng等[22]研究也發(fā)現(xiàn)，在斷奶仔豬飼糧中添加牛至油可提高空腸絨毛高度，改善腸道屏障的完整性。在本研究中，百里香酚×迷迭香酸組大鼠空腸黏膜中ZO-1、Occludin和Claudin-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，并且百里香酚×迷迭香酸組上述屏障蛋白基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量還高于或顯著高于單一植物提取物組。這表明植物提取物能預(yù)防和減少LPS攻毒引起的大鼠腸道屏障功能損傷，并且百里香酚和迷迭香酸組合的效果更為明顯。

腸道微生態(tài)平衡對(duì)于維持動(dòng)物腸道健康和促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用。近年來(lái)的研究證實(shí)腸道微生物及其代謝產(chǎn)物能夠促進(jìn)腸道發(fā)育，提高腸道屏障功能，降低腸道炎癥反應(yīng)[23-24]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，百里香酚×迷迭香酸組的Shannon指數(shù)顯著降低，Simpson指數(shù)和Chao1指數(shù)顯著提高。這表明百里香酚×迷迭香酸組大鼠空腸微生物多樣性顯著降低，但豐富度顯著提高。并且，β多樣性分析結(jié)果也表明4組大鼠空腸食糜中菌群顯著分開(kāi)。以上結(jié)果均證明大鼠灌胃植物提取物后，特別是灌胃百里香酚和迷迭香酸組合后，其空腸中菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化。有研究指出，F(xiàn)imicutes和Bacteroidetes廣泛存在于動(dòng)物腸道中，而Fimicutes/Bacteroidetes的比值能夠有效評(píng)價(jià)動(dòng)物腸道微生物狀態(tài)，特別是Fimicutes的變化直接影響機(jī)體能量攝取和脂肪代謝過(guò)程[25-26]。Proteobacteria是革蘭氏陰性菌的主要菌門(mén)，包括多種病原微生物，如大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏桿菌等，可能導(dǎo)致某些特性疾病如炎癥性腸病[27]。而對(duì)大鼠空腸食糜中菌群組成在門(mén)水平上進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，百里香酚×迷迭香酸組Fimicutes的相對(duì)豐度顯著增加，Proteobacteria的相對(duì)豐度顯著降低。這一變化可能與百里香酚和迷迭香酸的抑菌性有關(guān)，百里香酚、迷迭香酸對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌具有較強(qiáng)的抑制作用。以上結(jié)果提示我們，百里香酚與迷迭香酸組合能夠通過(guò)改變碳水化合物代謝相關(guān)菌群改善腸道微生態(tài)環(huán)境，例如，提高Fimicutes的相對(duì)豐度增加能量供給，促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育；降低Proteobacteria等條件致病菌的相對(duì)豐度，降低腸道疾病和炎癥反應(yīng)。對(duì)大鼠空腸食糜中菌群組成在屬水平上進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，百里香酚×迷迭香酸組Lactobacillus的相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組，也略高于百里香酚組和迷迭香酸組。前人研究發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌具有改善腸道微生態(tài)環(huán)境，增強(qiáng)腸道屏障功能和提高機(jī)體免疫力的作用[28]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)3個(gè)植物提取物組的鏈球菌屬、嗜氣性桿菌屬和斯氏菌屬的相對(duì)豐度較對(duì)照組顯著降低。綜上可知，百里香酚與迷迭香酸組合對(duì)LPS攻毒大鼠空腸菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的影響，增加了Firmicutes/Bacteroidete的比值以及有益菌Lactobacillus等的相對(duì)豐度，降低了Proteobacteria和Streptococcus、Rodentibacter等的相對(duì)豐度，從而有利于腸道健康。試驗(yàn)中我們還發(fā)現(xiàn)3個(gè)植物提取物組空腸食糜中乙酸和總短鏈脂肪酸濃度顯著高于對(duì)照組，百里香酚×迷迭香酸組大鼠空腸食糜中乙酸、丙酸、丁酸和總短鏈脂肪酸濃度均顯著高于對(duì)照組。而引起空腸食糜中短鏈脂肪酸濃度提高的原因可能是因?yàn)楣辔钢参锾崛∥锖罂漳c中一些產(chǎn)酸菌(如Lactobacillus等)在空腸中的相對(duì)豐度增加[25]。

腸道炎癥反應(yīng)對(duì)于維持腸道屏障功能和機(jī)體健康具有重要作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，百里香酚與迷迭香酸組合能顯著降低大鼠空腸黏膜中MPO的活性和IL-6的含量，顯著提高抑炎因子IL-10的含量，TNF-α的含量有降低的趨勢(shì)。這表明百里香酚與迷迭香酸組合能夠降低大鼠空腸黏膜中促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促進(jìn)抑炎因子的分泌。我們還發(fā)現(xiàn)百里香酚與迷迭香酸組合能夠顯著降低大鼠空腸黏膜中TLR-4/MyD88信號(hào)通路中TLR-4、MYD88、TRAF6、IRAK1的mRNA相對(duì)表達(dá)量。這表明百里香酚與迷迭香酸組合能夠降低LPS攻毒引起的大鼠腸道炎癥反應(yīng)。當(dāng)然，引起腸道炎癥反應(yīng)降低的原因可能與多種因素有關(guān)。Tedelind等[24]研究發(fā)現(xiàn)，短鏈脂肪酸尤其是丁酸可以通過(guò)抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α激活核因子-κB(NF-κB)來(lái)發(fā)揮抗炎作用。并且，有研究發(fā)現(xiàn)迷迭香酸能夠顯著降低小鼠毛細(xì)血管的通透性，并降低血清中炎癥因子TNF-α、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)的產(chǎn)生[29]；百里香酚能夠通過(guò)抑制機(jī)體的NF-κB信號(hào)通路的傳導(dǎo)，降低相關(guān)細(xì)胞因子如TNF-α和IL-6等的合成[30]。這表明百里香酚與迷迭香酸組合可能通過(guò)抑制炎癥因子的分泌，調(diào)節(jié)腸道菌群組成及其代謝產(chǎn)物等方式預(yù)防和減少LPS攻毒引起的炎癥反應(yīng)。

炎癥反應(yīng)往往伴隨著氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，腸道發(fā)生炎癥反應(yīng)后會(huì)引起腸黏膜中的白細(xì)胞浸潤(rùn)增加，進(jìn)而引起應(yīng)激的產(chǎn)生[31]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)百里香酚與迷迭香酸組合能夠顯著提高空腸黏膜中T-SOD活性，T-AOC也有提高的趨勢(shì)。而關(guān)于百里香酚和迷迭香酸的研究也證明其在體外條件下具有較強(qiáng)的自由基清除能力，能夠提高機(jī)體的抗氧化水平。并且，相關(guān)研究也證實(shí)腸道氧化應(yīng)激可以通過(guò)調(diào)節(jié)核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)途徑，進(jìn)而調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的表達(dá)，來(lái)影響腸道黏膜的屏障功能[32-33]。

4 結(jié) 論

百里香酚與迷迭香酸組合能夠提高大鼠的生長(zhǎng)性能，預(yù)防和減少LPS攻毒引起的大鼠腸道黏膜形態(tài)損傷，調(diào)節(jié)空腸食糜的菌群結(jié)構(gòu)，降低腸道的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，有助于保護(hù)空腸的屏障功能。百里香酚與迷迭香酸組合的效果優(yōu)于百里香酚或迷迭香酸單一成分，二者具有較好的組合效應(yīng)。