高效合成L-高絲氨酸大腸桿菌基因工程菌株的構建

張 宇，夏 利，林蓓蓓，張穩(wěn)杰，徐皓然，張成林

（天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

L-高絲氨酸屬于L-天冬氨酸族非蛋白質氨基酸，是合成必需氨基酸L-蘇氨酸、L-甲硫氨酸和L-異亮氨酸的前體物[1]。作為重要的平臺化合物，L-高絲氨酸還被用于O-乙酰高絲氨酸、L-氮雜環(huán)丁烷、高絲氨酸內酯、異丁醇和γ-丁內酯等高附加值化合物的合成[2-7]。此外，有研究表明L-高絲氨酸還具有提高植物抗逆性、促進家禽生長的功能[5,8]。由此可見，L-高絲氨酸有望廣泛應用于食品、醫(yī)療及農業(yè)等領域。

目前L-高絲氨酸主要通過化學法合成，但由于合成效率低等原因限制了其生產規(guī)模和應用范圍[3]。近年來，隨著代謝工程和合成生物學的迅猛發(fā)展，發(fā)酵法合成L-高絲氨酸受到廣泛關注。如圖1所示，L-高絲氨酸的生物合成以草酰乙酸為前體物，經(jīng)天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶和天冬氨酸半醛脫氫酶催化合成，其中天冬氨酸激酶和高絲氨酸脫氫酶為限速酶[4]。L-高絲氨酸通常在胞內不積累，而直接代謝為L-蘇氨酸。此外，L-賴氨酸與L-高絲氨酸競爭前體物天冬氨酸半醛。故常見L-高絲氨酸生產菌株代謝工程選育策略主要包括增強前體物草酰乙酸合成、阻斷L-高絲氨酸競爭和降解途徑等。Plachy等[9]最先報道利用L-蘇氨酸營養(yǎng)缺陷型谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）發(fā)酵72 h生成14.2 g/LL-高絲氨酸，但同時積累7.5 g/LL-賴氨酸。Li Ning等[4]利用阻斷C. glutamicum L-高絲氨酸競爭及降解途徑并增加其合成通量等策略，使得L-高絲氨酸產量達到8.8 g/L。但總體而言，利用C. glutamicum合成L-高絲氨酸效率較低。

大腸桿菌（Escherichia coli）因遺傳背景清晰、生長速度快等特性也被應用于發(fā)酵法合成L-高絲氨酸研究[10-17]。Li Hua等[16]報道通過代謝工程改造E. coli合成L-高絲氨酸39.5 g/L（45 h），為目前報道的最高產量。Liu Peng等[17]通過對E. coli代謝網(wǎng)絡重構使得L-高絲氨酸產量達37.6 g/L（108 h）。盡管利用E. coli合成L-高絲氨酸取得了顯著進展，但構建適用于工業(yè)化生產的細胞工廠仍具有挑戰(zhàn)性。主要表現(xiàn)在，為使L-高絲氨酸積累，現(xiàn)有菌株的L-高絲氨酸降解途徑相關基因均被敲除，造成L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-甲硫氨酸等多種營養(yǎng)物質缺陷。故需在發(fā)酵培養(yǎng)過程中添加適量的上述營養(yǎng)物質。這不僅增加了生產成本，還使得發(fā)酵過程復雜化。

圖1 L-高絲氨酸合成途徑及本研究主要策略Fig. 1 Pathway and strategy for the synthesis of L-homoserine used in this study

本研究針對上述問題，以E. coliW3110為底盤細胞構建非營養(yǎng)缺陷型的L-高絲氨酸高效合成基因工程菌。首先弱化L-高絲氨酸降解途徑削弱其降解；然后通過增強合成代謝流、提高前體物和輔酶供應實現(xiàn)L-高絲氨酸積累；在此基礎上促進L-高絲氨酸外排，進一步提高其產量（圖1）。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

本研究使用的菌株和質粒見表1。其中E. coliDH5α用于質粒構建，E. coliW3110 ΔlacI作為出發(fā)菌株用于構建L-高絲氨酸生產菌株。E. coliCRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)所用質粒pRedCas9和pGRB由天津大學陳濤教授惠贈。

表1 菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基

LB（Luria-Bertan）培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0～7.5。

斜面活化培養(yǎng)基：葡萄糖5 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，牛肉膏10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0～7.5。

搖瓶種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母粉12 g/L，KH2PO41.2 g/L，MgSO4·H2O 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 5 mg/L，MnSO4·7H2O 8 mg/L，VB12 mg/L，pH 7.0～7.5。發(fā)酵罐種子培養(yǎng)基同搖瓶種子培養(yǎng)基。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母粉4 g/L， KH2PO42 g/L，MgSO4·H2O 1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 10 mg/L，MnSO4·7H2O 10 mg/L，pH 7.0～7.5。

發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，蛋白胨8 g/L，酵母粉5 g/L，KH2PO43.5 g/L，MgSO4·H2O 1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 10 mg/L，MnSO4·7H2O 10 mg/L，玉米漿30 mL/L，pH 7.0～7.5。

1.1.3 引物

引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，序列見表2。

表2 DNA片段擴增引物Table 2 Primers used for the amplification of DNA fragments

續(xù)表2

1.1.4 試劑

(NH4)2SO4、MgSO4·H2O、KH2PO4國藥集團試劑有限公司；L-高絲氨酸 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物 英國Oxoid公司；基因組提取試劑盒、質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒美國Omega BioTek公司；限制性內切酶、Primer STAR HS DNA聚合酶 寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司；一步法克隆試劑盒 南京諾唯贊生物科技有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 儀器與設備

U3000高效液相色譜儀 美國賽默飛世爾科技公司；PTC-1148型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；ZORBAX Eclipse AAA氨基酸柱 美國Agilent公司；SBA-40D生物傳感器分析儀 山東省科學院生物研究所。

1.3 方法

1.3.1 質粒及重組菌株的構建

利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)進行基因整合和啟動子替換[18]。以將PthrABC替換為PBBa_J23108為例。利用sgRNA設計工具CRISPR RGEN Tools（http://www.rgenome.net/cas-designer/）設計20 bp間隔序列（pGRB-thrABC-1和pGRB-thrABC-2），退火后利用一步法克隆試劑盒與線性pGRB連接，轉化E. coliDH5α并篩選后獲得質粒pGRBPthrB。以E. coliW3110基因組DNA為模板，分別利用引物thrL-U-F/PBBa_J23108-U-R和PBBa_J23108-D-F/thrL-D-R擴增并通過重疊PCR獲得含PthrABC上下游同源臂和PBBa_J23108的供體DNA。將PthrB（100 ng）和供體DNA（200 ng）電轉化至含pREDCas9的E. coliW3110ΔlacI感受態(tài)細胞中。復蘇2 h后，涂布于含100 μg/mL的氨芐青霉素和奇霉素的LB固體培養(yǎng)基上，于32 ℃培養(yǎng)過夜。挑選單菌落，利用引物thrL-U-F/thrL-D-R進行菌落PCR鑒定，將鑒定正確的轉化子于含10 mmol/L阿拉伯糖的LB液體培養(yǎng)基中32 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，以丟失pGRB-PthrB。利用菌落PCR對重組菌株進行鑒定，并將PCR產物委托蘇州金唯智生物科技有限公司測序驗證。菌株于LB液體培養(yǎng)基42 ℃振蕩培養(yǎng)過夜以丟失pREDCas9質粒。每次構建獲得的菌株于LB液體培養(yǎng)基活化并連續(xù)傳代10 次，稀釋后涂布于LB固體培養(yǎng)基，挑取3～5 個單菌落進行搖瓶發(fā)酵實驗，選取L-高絲氨酸產量高且生物量無顯著降低的菌株進行后續(xù)改造。

以E. coliW3110基因組DNA為模板，利用引物rhtA-1和rhtA-2擴增rhtA基因，PCR產物回收后連接至經(jīng)NcoI酶切的pTrc99a質粒，經(jīng)轉化、篩選、菌落PCR鑒定后獲得重組質粒pTrc99a-rhtA。將pTrc99a-rhtA電轉化至H-9，經(jīng)篩選、菌落PCR鑒定后獲得菌株H-10。

1.3.2 發(fā)酵實驗

1.3.2.1 搖瓶發(fā)酵

將適量經(jīng)斜面培養(yǎng)基活化后的菌體細胞接種至含30 mL種子培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，35 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)10 h。以1%接種量接種至45 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，35 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。發(fā)酵過程中根據(jù)情況補充80%葡萄糖，用氨水調節(jié)pH值約為7.0。利用H-10發(fā)酵時，接種后加入終濃度為0.05 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）。

1.3.2.2 5 L發(fā)酵罐發(fā)酵

將適量經(jīng)斜面培養(yǎng)基活化后的菌體細胞接種至裝有2.5 L種子培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐，流加氨水調節(jié)發(fā)酵液pH 6.8～7.2，溶氧維持20%～40%，通風量2～4 m3/h，攪拌轉速200～800 r/min，35 ℃培養(yǎng)6 h。以10%接種量將種子培養(yǎng)物接至裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度35 ℃，通風量2～4 m3/h，攪拌轉速300～900 r/min，溶氧維持在20%～50%，流加80%的葡萄糖溶液，維持殘?zhí)琴|量濃度為1～3 g/L，流加氨水調節(jié)發(fā)酵液pH 6.8～7.2，發(fā)酵周期52 h。利用H-10發(fā)酵時，接種后加入終濃度為0.05 mmol/L的IPTG。

1.3.3 檢測與分析方法

用生物傳感器分析儀測定葡萄糖含量。生物量以OD600nm計。采用高效液相色譜柱前衍生法測定L-高絲氨酸濃度。樣品用2,4-二硝基氟苯衍生，以乙腈-水混合液（1∶1，V/V）和50 mmol/L乙酸銨溶液為流動相，以1 mL/min的流速梯度混合經(jīng)過C18AAA色譜柱分離，最后在360 nm波長處進行檢測[19]。

2 結果與分析

2.1 弱化蘇氨酸操縱子thrABC對L-高絲氨酸合成的影響

目前報道的常用策略是通過敲除高絲氨酸激酶編碼基因thrB阻斷L-高絲氨酸的降解，實現(xiàn)其積累。與阻斷策略不同，適度弱化降解途徑不會引起菌株營養(yǎng)缺陷，故可在不影響菌株生長的前提下實現(xiàn)代謝產物的積累[15,19]。在E. coli中，高絲氨酸激酶編碼基因thrB與蘇氨酸合成酶編碼基因thrC及天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶編碼基因thrA組成操縱子thrABC，而高絲氨酸激酶和蘇氨酸合成酶均參與L-高絲氨酸的降解[20-21]。為不破壞thrABC操縱子的天然結構并實現(xiàn)thrB和thrC的弱化，擬將該操縱子的啟動子替換為不同強度的PBBa_J23108、PBBa_J23109和PBBa_J23114。但啟動子替換會引起L-高絲氨酸關鍵合成基因thrA的弱化，故先在出發(fā)菌株E. coliW3110 ΔlacI基因組先整合1 個拷貝強啟動子Ptrc調控的thrAC1034T（解除L-蘇氨酸反饋抑制）[22]。利用鑒定引物ylbe-U-F/ylbe-thrA-J進行菌落PCR鑒定，thrAC1034T基因整合菌株基因組DNA擴增獲得堿基約為1 013 bp的條帶（圖2），表明thrAC1034T基因整合成功，將菌株命名為H-1。在H-1的在整個發(fā)酵過程中，未檢測到L-高絲氨酸積累（圖3A），其原因可能是L-高絲氨酸被代謝為L-蘇氨酸和L-甲硫氨酸等代謝物。

為弱化L-高絲氨酸降解，將H-1的PthrABC分別替換為PBBa_J23108、PBBa_J23109和PBBa_J23114。由出發(fā)菌株H-1基因組DNA應擴增出堿基數(shù)為1 599 bp的條帶，而啟動子替換菌株基因組DNA擴增獲得堿基約為1 131 bp的條帶，由圖4可知，啟動子替換成功，將菌株分別命名為H-2、H-3和H-4。為考察PthrABC替換對菌株生長和L-高絲氨酸合成的影響，對其進行搖瓶發(fā)酵實驗。在不添加L-蘇氨酸的培養(yǎng)基中H-2、H-3和H-4能夠生長，表明PthrABC替換為弱啟動子未造成其L-蘇氨酸缺陷（圖3B）；H-2無L-高絲氨酸積累，H-3和H-4可分別合成1.5 g/L和0.8 g/LL-高絲氨酸（圖3A）。PBBa_J23108、PBBa_J23114和PBBa_J23109的轉錄強度依次降低，PBBa_J23108分別是PBBa_J23114和PBBa_J23109的約5 倍和50 倍。由此推測，因PBBa_J23108轉錄強度較高不利于L-高絲氨酸的積累；PBBa_J23114和PBBa_J23109有效降低了thrBC的轉錄，L-高絲氨酸得以積累；又因PBBa_J23109轉錄強度低于PBBa_J23114，故H-3的L-高絲氨酸產量高于H-4。此外，由圖3B可知，與對照菌株H-1相比，H-3和H-4最終生物量有所降低，且H-3生物量低于H-4，與菌株L-高絲氨酸產量呈相反趨勢，其原因可能是thrBC轉錄的下調有效弱化了菌株生長代謝流。Li Hua等[16]敲除thrB并過表達thrA，菌株L-高絲氨酸產量達到1.2 g/L，較H-3低20%，且在發(fā)酵過程需添加L-蘇氨酸。綜上，適度弱化thrBC轉錄可實現(xiàn)L-高絲氨酸的積累，且不會造成營養(yǎng)缺陷，其效果優(yōu)于敲除thrB。

圖2 菌株H-1鑒定圖譜Fig. 2 Identification of strain H-1

圖3 PthrABC替換對菌株生長和L-高絲氨酸合成的影響Fig. 3 Effect of thrABC promoter substitution on the growth of strains and L-homoserine production

圖4 菌株H-2（A）、H-3（B）和H-4（C）鑒定圖譜Fig. 4 Identification of strains H-2 (A), H-3 (B) and H-4 (C)

2.2 增強thrA拷貝數(shù)對L-高絲氨酸合成的影響

盡管通過弱化降解途徑實現(xiàn)了L-高絲氨酸的積累，但其產量較低。天冬氨酸激酶是L-高絲氨酸合成的關鍵酶[20-21]。在E. coli中共含有3 個天冬氨酸激酶I、II和III，其中thrA的天冬氨酸激酶I豐度最高，在合成L-高絲氨酸中起主要作用[22]。為進一步提高L-高絲氨酸的合成代謝流，向H-3再整合1 拷貝的thrAC1034T（受強啟動子Ptrc調控）。由圖5A可知，thrAC1034T基因整合成功，將其命名為H-5。搖瓶發(fā)酵實驗結果表明，H-5的L-高絲氨酸產量為2.6 g/L，較H-3提高73.3%（圖6）。為考察進一步過表達thrAC1034T對高絲氨酸合成的影響，向H-5再整合1 拷貝的thrAC1034T（受強啟動子Ptrc調控）。由圖5B可知，thrAC1034T基因整合成功，將其命名為H-6。搖瓶發(fā)酵實驗結果表明，H-6的L-高絲氨酸產量為3.4 g/L，較出發(fā)菌株提高30.7%。

圖5 菌株H-5和H-6鑒定圖譜Fig. 5 Identification of strains H-5 and H-6

圖6 菌株H-5、H-6和H-7的L-高絲氨酸產量和生物量Fig. 6 L-Homoserine production and biomass of strains H-5, H-6 and H-7

2.3 增加草酰乙酸合成對L-高絲氨酸合成的影響

圖7 菌株H-7鑒定圖譜Fig. 7 Identification of strain H-7

由圖6可知，在H-6的L-高絲氨酸產量提高程度較H-5低，推測L-高絲氨酸前體物供應不足限制了其合成。草酰乙酸是合成包括L-高絲氨酸在內的L-天冬氨酸族氨基酸的重要前體物[19,23-25]。為增加L-高絲氨酸合成代謝流，向H-6基因型整合1 拷貝由自身啟動子調控的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因ppc，鑒定結果如圖7所示，由出發(fā)菌株H-6基因組擴增出堿基數(shù)為1 873 bp的條帶，由ppc基因整合菌株基因組擴增獲得堿基約為3 000 bp的條帶，與預期一致（3 249 bp），表明菌株構建成功，將其命名為H-7。H-7的L-高絲氨酸產量達5.8 g/L，比菌株H-8提升了70.5%（圖6）。上述結果表明，草酰乙酸是L-高絲氨酸的限制因素，提高其供應有利于增強L-高絲氨酸的合成。

2.4 增加NADPH再生對L-高絲氨酸的影響

圖8 菌株H-8和H-9鑒定圖譜Fig. 8 Identification of strains H-8 and H-9

在L-高絲氨酸生物合成途徑中，高絲氨酸脫氫酶和天冬氨酸半醛脫氫酶催化的反應需要NADPH。生成1 molL-高絲氨酸需要2 mol NADPH，由此推測NADPH供應是L-高絲氨酸的另一限制因素。研究證明，過表達吡啶核苷酸轉氫酶編碼基因可有效促進NADPH的再生并增強L-賴氨酸、L-纈氨酸等代謝物合成[11,26-28]。為增強NADPH的再生，分別將自身啟動子PpntAB和Ptrc調控的pntAB整合至H-7基因組。由菌株H-7基因組DNA應擴增出堿基數(shù)為1 681 bp的條帶，由pntAB整合菌株基因組DNA擴增獲得堿基可擴增出4 443 bp（PpntAB-pntAB）和3 994 bp（Ptrc-pntAB）的條帶。由圖8可知，pntAB基因整合成功，將菌株分別命名為H-8和H-9。搖瓶發(fā)酵結果如圖9所示，H-8的L-高絲氨酸產量（7.8 g/L）略高于H-9（7.1 g/L），說明pntAB自身啟動子效果略優(yōu)于Ptrc。上述結果表明，增強NADPH再生可有效促進L-高絲氨酸的合成。以往研究均聚焦于L-高絲氨酸代謝途徑的改造，鮮見增強還原力供應的相關報道[4,8-9,16-17]。本研究證明了強化pntAB表達可顯著提高L-高絲氨酸的合成。

圖9 菌株H-8、H-9和H-10的L-高絲氨酸產量和生物量Fig. 9 L-Homoserine production and biomass of strains H-8,H-9 and H-10

2.5 促進L-高絲氨酸輸出對其產量的影響

胞內高濃度的L-高絲氨酸積累可抑制谷氨酸脫氫酶的活性，從而對菌體細胞生長具有毒害作用[29]。由圖7、9可知，H-8和H-9的生物量較H-7顯著降低，可能與L-高絲氨酸的毒害作用有關。L-蘇氨酸/L-高絲氨酸輸出載體具有外排L-高絲氨酸的功能，過表達其編碼基因rhtA可有效提高L-高絲氨酸的產量和菌體生物量[16-17,30]。為增強L-高絲氨酸輸出以提高其產量和菌株抗性，構建了rhtA過表達質粒pTrc99a-rhtA，并將其轉化至H-8，獲得菌株H-10。如圖9所示，H-10的L-高絲氨酸產量達12.5 g/L，比H-8提高了60.2%；其生物量提高12.6%，表明增強L-高絲氨酸輸出可有效提高其產量并增強菌株對L-高絲氨酸的抗性。

2.6 發(fā)酵罐發(fā)酵實驗

為進一步考察H-10的發(fā)酵性能，于5 L發(fā)酵罐進行發(fā)酵實驗。如圖10所示，菌株于8 h進入對數(shù)生長期，32 h后進入穩(wěn)定期，隨后生物量緩慢下降；于4 h可檢測到L-高絲氨酸的積累，12 h后合成速率逐漸提升，48 h達到最高，52.1 g/L，其轉化率為43%（以占葡萄糖質量計）。由表3可知，本研究所構建的H-10L-高絲氨酸合成效率高于現(xiàn)有報道且該菌株無營養(yǎng)缺陷，故無需在發(fā)酵過程中額外添加營養(yǎng)物質，具有工業(yè)化生產的優(yōu)勢。

圖10 H-10發(fā)酵過程曲線Fig. 10 Time courses of L-homoserine production and biomass of strain H-10

表3 本研究與報道文獻的參數(shù)比較Table 3 Comparison of L-homoserine production performance between strain H-10 and E. coli

3 結 論

采用系統(tǒng)代謝工程策略構建了1 株無營養(yǎng)缺陷的L-高絲氨酸高產菌株H-10，主要策略包括利用弱啟動子調控thrB和thrC轉錄弱化L-高絲氨酸的降解代謝流；過表達關鍵酶基因thrAfbr、ppc和pntAB，增強其合成代謝流、前體物草酰乙酸供應及NADPH再生；過表達L-高絲氨酸輸出蛋白增強其外排。于5 L發(fā)酵罐經(jīng)發(fā)酵48 h，H-10菌株的L-高絲氨酸產量達到52.1 g/L，高于現(xiàn)有報道且發(fā)酵過程中無需額外添加營養(yǎng)物質，故具備工業(yè)化潛力。本研究采用的代謝途徑弱化策略可為工業(yè)微生物的代謝工程構建提供借鑒。