劉瑞華，徐禮生

(1.新宇藥業(yè)股份有限公司，安徽 宿州 234000；2.宿州學院生物與食品工程學院，安徽 宿州 234000)

不同金屬離子對天冬氨酸酶基因工程菌活性影響的研究

劉瑞華1，徐禮生*2

(1.新宇藥業(yè)股份有限公司，安徽 宿州 234000；2.宿州學院生物與食品工程學院，安徽 宿州 234000)

研究Na+、K+、Ca2+、Ba2+和Mg2+五種金屬離子對天冬氨酸酶基因工程菌活性的影響。結(jié)果表明：Mg2+、Na+對天冬氨酸酶的活性起促進作用，Ba2+、Ca2+對天冬氨酸酶活性起抑制作用，K+對酶的活性未有明顯變化，其中物質(zhì)的量濃度為1.5×102-mol/L的Mg2+催化作用最好，Ba2+的抑制作用最明顯，且Ba2+和Ca2+離子濃度在5×10-3mol/L～35×10-3mol/L的范圍內(nèi)，酶活性逐漸降低。

金屬離子；L-天冬氨酸；基因工程菌；轉(zhuǎn)化率

L-天冬氨酸又稱α-氨基丁二酸，是一種常見的酸性氨基酸，在食品、醫(yī)藥、美容、材料及化工等方面有著非常廣泛的用途[1-2]，在食品工業(yè)方面L-天冬氨酸常用于營養(yǎng)增補劑和甜味劑的合成，添加于各種清涼飲料，是糖代用品阿斯巴甜主要生產(chǎn)原料[4]。L-天冬氨酸酶在日本開始趨于工業(yè)化的生產(chǎn)[5]，我國在20世紀80年代后期開始進行L-天冬氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)。利用L-天冬氨酸酶催化反丁烯二酸與氨水發(fā)生加成反應得到的，有游離整體細胞法和固定化酶法兩種方式，在此實驗中用游離整體細胞法進行實驗，具有工藝簡單，酶活力高且設備投資少等優(yōu)點，該法是現(xiàn)代生產(chǎn)L-天冬氨酸的工藝。

本實驗通過天冬氨酸酶基因工程菌制備天冬氨酸，探究不同金屬離子對天冬氨酸酶活性的影響，從而為L-天冬氨酸工業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎。

1 實驗部分

1.1 主要試劑和儀器

L-天冬氨酸標準液(1 % pH值7.5～8)、反丁烯二酸、氨水、酵母浸粉、魚粉蛋白胨、乳糖、冰醋酸、正丁醇、茚三酮，NaCl、KCl、BaCl2、CaCl2、MgCl2。WT-ZNO型潔凈工作臺，高壓蒸汽滅菌鍋；離心機等。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種處理

本實驗所用的菌種為重組大腸桿菌，現(xiàn)于宿州學院微生物實驗室保存。將上述菌種按3.3%的接種量即100 μL菌液和7 μL氨芐接種于滅菌過的2支LB培養(yǎng)基中，在37 ℃、170 r/min的條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)10 h，為第一代菌液。重復上述操作活化三代，將上述發(fā)酵好的菌液放入500 mL的離心管中，在轉(zhuǎn)速為8000 r/min的離心機中離心10 min,棄去上清液，將剩下的菌體放置橡皮管中于-20 ℃的冰箱中冷凍保藏備用。

1.2.2 L-天冬氨酸酶酶活測定

稱取反丁烯二酸5 g,加入適量蒸餾水攪拌均勻，緩慢的加入氨水至反丁烯二酸溶解，再調(diào)節(jié)pH到7.5～8后定容至100 mL于容量瓶中待用，即得到5 %的富馬酸銨溶液，將上述離心后得到的菌液少量的接種到橡皮管內(nèi)，在37 ℃、170 r/min的搖床條件下分別培養(yǎng)3 h、5 h、7 h、9 h和11 h，然后通過高效液相色譜法測定酶的活性。

1.2.3 不同金屬離子對L-天冬氨酸酶活性的影響

金屬離子包括Na+、K+、Ca2+、Ba2+、Mg2+五種，配置成不同濃度，通過測定L-天冬氨酸的產(chǎn)率來比較金屬離子對酶活性的影響。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 酶活的測定

圖1 層析法測定酶活

由圖1可以直觀的看出點樣的點出現(xiàn)并和標準樣天冬氨酸一致，即活化的菌種有活性，且搖床三小時就有活性，所以后面的實驗全部都是在恒溫搖床活化3個小時下進行的。

2.2 不同濃度的金屬離子對L-天冬氨酸酶活性的影響

由圖2可以看出Na+在一定濃度范圍內(nèi)對L-天冬氨酸酶具有促進作用，在0～15×10-3mol/L濃度范圍內(nèi)，天冬氨酸酶的相對酶活逐漸增加，達到最大值110%，隨著濃度的增大相對酶活降低，后達到最低值65 %。

由圖3可以看出K+在0～5×10-3mol/L內(nèi)基本無大變化，說明在低濃度范圍鈉離子對天冬氨酸酶酶活基本無影響，后隨著濃度的增大，天冬氨酸酶的相對酶活逐漸降低至72%。

圖2 鈉離子對天冬氨酸酶影響

圖3 鉀離子對天冬氨酸酶影響

由圖4可知，隨著Ba2+濃度升高酶活性降低，在濃度為35×10-3mol/L下達到最低值45 %。Ba2+對天冬氨酸酶有一定抑制作用。

圖4 鋇離子對天冬氨酸酶影響

由圖5可以看出，隨著Ca2+離子濃度的增加，天冬氨酸酶的相對酶活逐漸降低，但變化不是很明顯，在0～20×10-3mol/L濃度范圍內(nèi)天冬氨酸酶的活性基本無明顯變化，后隨著濃度的變化，天冬氨酸酶的活性下降。

圖5 鈣離子對天冬氨酸酶影響

由圖6可以看出Mg2+0～20×10-3mol/L濃度范圍內(nèi)，天冬氨酸酶的相對酶活增加，且濃度10×10-3mol/L時達到最大值145 %，后隨著濃度的增大酶活逐漸降低。

圖6 鎂離子對天冬氨酸酶影響

3 結(jié)論

Mg2+的激活作用最明顯，濃度在10×10-3mol/L可使酶活提高45 %，其次是Na+，在5×10-3～20×10-3mol/L濃度范圍內(nèi)對天冬氨酸酶有激活作用，后隨著濃度升高，酶活性逐漸降低。在低濃度下可以看出K+對酶活無明顯的影響，Ba2+和Ca2+對酶活均有抑制作用，且隨著濃度的升高，酶的活性越來越低，且Ba2+對天冬氨酸酶活性抑制更加明顯，在35×10-3mol/L濃度下天冬氨酸酶活性降低至45 %。

[1] 郝大偉, 裘娟萍. 生物催化富馬酸加氨合成天門冬氨酸的研究進展[J].氨基酸和生物資源, 2008, 30(2): 39-43.

[2] 姚洪齊,徐 晨. N-甲酰-L-天冬氨酸酐的合成研究[J].廣州化工, 2014, 42(3): 28-30.

[3] 林應銳. 阿斯巴甜的生物合成[J].微生物學通報, 1992, 19(4): 226 - 229.

[4] Atkinson R O. Mannich bases of acylaminonates and synthesis of DL-aspartic acid[J].J Chem Soc, 1952, 3: 3317-3318.

[5] Tosa T,Sato T,Mori T,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yamamoto%20K%5bAuthor%5d&cauthor=true&cauthor_uid=385076et al. Immobilization of enzymes and microbial cells using carrageenen as matrix[J].Biotechnol Bioeng. 1979, 21(10): 1697-1709.

StudyontheEffectsofDifferentMetalionsontheActivityofAspartaseGeneEngineeredBacteria

LiuRuihua1，XuLisheng2

(1. Xinyu Pharmaceutical Co., Ltd., Suzhou 234000,China； 2. Department of Life and Food Science, Suzhou University,Suzhou 234000, China)

In order to study the effects of different metal ions on the activity of aspartase gene engineering bacteria. The effects of Na+, K+, Ca2+, Ba2+and Mg2+on the activity of aspartase gene engineering bacteria were studied by using Fumaric acid and ammonia to catalyze the production of L-aspartic acid. The activity of the enzyme was determined by HPLC. The results showed that Mg2+and Na+could promote the activity of aspartase, and Ba2+and Ca2+could inhibit the activity of aspartase. The activity of the enzyme did not change significantly. The Mg2+catalysis is the best, and the Ba2+and Ca2+ions are in the range of 5 ×10-3mol/L～35×10-3mol / L, and the concentration of Ba2+and Ca2+is 1.5 × 10-2mol / L.

metal ion; L-aspartic acid; gene engineered bacteria; conversion rate

2017-09-23

安徽省高校自然科學研究重點項目(KJ2017A440)；安徽省質(zhì)量工程項目(2015zjjh034、2015ckjh108、2016jyxm1038)

劉瑞華，高級工程師，主要從事微生物與生化藥學研究。

TQ464.7

A

1008-021X(2017)22-0009-02

(本文文獻格式：劉瑞華，徐禮生.不同金屬離子對天冬氨酸酶基因工程菌活性影響的研究[J].山東化工，2017，46(22)：9-10.)