李亞倬，黃亞麗，于紅紅，王靜云，盧士玲

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

酪胺是以酪氨酸為前體物質(zhì)經(jīng)脫羧后形成的一種血管活性生物胺（圖1），廣泛存在于奶酪、豆制品和發(fā)酵肉制品等食品中[1]。當(dāng)體內(nèi)酪胺含量過(guò)高或分解代謝受阻時(shí)，過(guò)量的酪胺進(jìn)入血液，刺激交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮，過(guò)度釋放去甲腎上腺素，使大腦和心臟處于高壓狀態(tài)從而引發(fā)一系列的生理反應(yīng)，包括頭痛、偏頭痛、發(fā)熱、心悸、流涎、流淚等[2]。嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致醫(yī)療并發(fā)癥：心跳過(guò)快，外周血管收縮，心臟輸血量增加，血壓上升引發(fā)高血壓。這可能對(duì)患有冠狀動(dòng)脈疾病或VB12缺乏的患者造成生命威脅[3]。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局規(guī)定，魚(yú)類中酪胺含量不得超過(guò)100 mg/kg[4]?？傊?，減少食物中酪胺的產(chǎn)生以避免酪胺的過(guò)量攝入至關(guān)重要。

圖1 酪氨酸脫羧生成酪胺示意圖Fig. 1 Decarboxylation of tyrosine into tyramine

研究學(xué)者已對(duì)不同微生物編碼酪氨酸脫羧（tyrosine decarboxylase，TDC）途徑的基因簇進(jìn)行了充分研究。例如，腸球菌屬[5-6]、短乳桿菌[7-8]、彎曲乳桿菌[9]、清酒乳桿菌[10]中均被證實(shí)酪氨酸脫羧酶基因主要由4 種基因組成，分別為編碼酪氨酸脫羧酶的tyr DC[11]、編碼酪氨酸/酪胺透性酶的tyr P、編碼酪氨酰-tRNA合成酶的tyr S以及編碼Na＋/H＋轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的nha C[12-15]。

雪菊（Coreopsis tinctoria）主要分布在新疆昆侖山，是一種可與雪蓮相媲美的高山野生植物，具有抑菌、抗氧化、保護(hù)臟器、降糖、降脂、抗炎和抗癌等多種生理作用，有較高的藥用價(jià)值[16-17]。雪菊精油的主要成分為D-檸檬烯（含量約50%～70%）和黃酮類化合物（總黃酮含量約15%～25%）[18-20]。雪菊精油具有較強(qiáng)的抗菌、抗氧化作用[21]，是一種天然抗菌劑，對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、白色葡萄球菌、新生隱球菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)有很強(qiáng)的抑制作用[22-23]。但對(duì)于雪菊精油是否對(duì)微生物產(chǎn)酪胺有抑制作用，以及是否影響TDC途徑中相關(guān)基因表達(dá)還有待研究。本實(shí)驗(yàn)以高產(chǎn)酪胺的希氏腸球菌（Enterococcus hirae）為研究對(duì)象，探討在純菌體系和熏馬腸中雪菊精油對(duì)希氏腸球菌抑菌能力、TDC途徑中TDC基因簇相關(guān)基因表達(dá)水平和產(chǎn)酪胺量的影響，為雪菊精油在食品領(lǐng)域的應(yīng)用開(kāi)辟新的思路，同時(shí)為熏馬腸中酪胺含量的控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌：希氏腸球菌N47，GenBank登錄號(hào)為MT729969，從新疆熏馬腸中分離保存，該工作在石河子大學(xué)食品學(xué)院完成。

馬肉、天然動(dòng)物腸衣 新疆伊犁市伊卡孜有限公司；食鹽 福建泉州晶海輕化有限公司；味精、香料粉華星龍盛（廈門(mén)）食品有限公司；亞硝酸鈉配料 四川金山制藥有限公司；煙熏液 濟(jì)南市歷城區(qū)金牛山食品香料廠。

天山雪菊精油（100%純單方） 霍城縣五彩河谷農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司；吐溫80（化學(xué)純）、環(huán)糊精（純度≥99%） 天津福晨化學(xué)試劑廠；丹磺酰氯、酪胺標(biāo)準(zhǔn)品、L-酪氨酸、磷酸吡哆醛、乙腈（色譜純） 美國(guó)Sigma公司；BHI培養(yǎng)基 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；Trizol試劑（MagZolTMReagent）美國(guó)Invitrogen公司；5×All-In-One RT Master Mix (with AccuRT Genomic DNA Removal Kit) cDNA合成試劑盒、EvaGreen 2×qPCR MasterMix low ROX 加拿大Applied Biological Materials公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ND2000C微量核酸測(cè)定儀 香港基因有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；UB-7型pH計(jì) 德國(guó)賽多利斯公司；5417R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；高速冷凍離心機(jī)美國(guó)貝克曼公司；多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Tek儀器有限公司；M×3000P型實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）儀 美國(guó)安捷倫科技公司；ACQUITY Arc System高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國(guó)Waters公司；T25 DS 25型勻漿機(jī) 德國(guó)IKA公司；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；9020-0094 KBF 240型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 德國(guó)Binder公司。

1.3 方法

1.3.1 雪菊精油抑菌能力的測(cè)定

取在－18 ℃斜面保藏的希氏腸球菌N47接種在BHI液體培養(yǎng)液（pH 5.5）中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，振蕩菌液，使用滅菌金屬接種環(huán)蘸取菌液劃線于固體BHI平板培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后，挑取平板上單一菌落再次接種至BHI液體培養(yǎng)基中，完成3 次活化。使用0.85 g/100 mL無(wú)菌生理鹽水稀釋菌懸液至濃度為104～105CFU/mL，即菌懸液在600 nm處光密度約為0.3。參照于紅紅等[24]的方法采用雙倍稀釋法測(cè)定雪菊精油對(duì)供試菌最低殺菌濃度（minimal bactericidal concentration，MBC）和最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。

1.3.2 希氏腸球菌純培養(yǎng)

準(zhǔn)備5 個(gè)150 mL錐形瓶，分別加入含體積分?jǐn)?shù)0.005%磷酸吡哆醛的BHI液體培養(yǎng)基100 mL。分為4 組：第1組僅添加體積分?jǐn)?shù)0.5%酪氨酸（L）；第2組添加0.5%酪氨酸和1/2 MIC雪菊精油（1/2M）；第3組添加0.5%酪氨酸和MIC雪菊精油（M）；第4組為空白組，不添加酪氨酸和雪菊精油（K）。用不添加供試菌的陰性組作對(duì)照。雪菊精油用體積分?jǐn)?shù)10%的吐溫-80溶解：先將精油與吐溫-80充分混勻，再邊攪拌邊加入蒸餾水。供試菌均按體積分?jǐn)?shù)4%接種，于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。

1.3.3 雪菊精油對(duì)供試菌生長(zhǎng)過(guò)程中pH值和OD600nm的影響

每隔4 h，用pH計(jì)測(cè)定1.3.2節(jié)所述4 組菌懸液pH值，用多功能酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定OD600nm，繪制希氏腸球菌在BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h的生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 real-time PCR測(cè)定菌懸液TDC基因簇相關(guān)基因表達(dá)量

1.3.4.1 RNA的提取

為獲得高質(zhì)量的cDNA模板提取樣本RNA，以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取1.3.2節(jié)生長(zhǎng)至穩(wěn)定期（24 h）的菌液2.0 mL，于4 ℃、1 000×g離心5 min，棄上清液；重復(fù)上述步驟3 次。采用Trizol法提取細(xì)菌總RNA，注意操作過(guò)程在冰上完成。根據(jù)MagZolTMReagent說(shuō)明將所提RNA渦旋后，用無(wú)酶水校準(zhǔn)微量核酸測(cè)定儀，吸取1 μL RNA樣品于加樣板，測(cè)定A260nm/A280nm、A260nm/A230nm和RNA濃度，檢測(cè)RNA純度。當(dāng)A260nm/A280nm為1.9～2.1、A260nm/A230nm為1.8～2.5時(shí)，表明所提RNA純度較高。取1 μL RNA上樣于1%瓊脂糖凝膠，5 V/cm電泳30 min。當(dāng)凝膠電泳在28S、18S和5S處有清晰條帶時(shí)，認(rèn)為所提RNA具有良好的完整性。待RNA純度以及完整性達(dá)到要求后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.3.4.2 cDNA的合成

為避免基因組DNA（gDNA）污染影響后續(xù)反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，在合成cDNA前對(duì)RNA進(jìn)行g(shù)DNA去除。按照cDNA合成試劑盒，2 μg RNA模板加入2 μL AccuRT Reaction Mix（4×），無(wú)酶水加至終體積為8 μL，室溫下孵育5 min，然后加入2 μL AccuRT Reaction Stopper（5×），反應(yīng)試劑充分混勻，以去除gDNA。然后加入4 μL 5×All-In-One RT MasterMix、6 μL無(wú)酶水，25 ℃孵育10 min，42 ℃孵育15 min，85 ℃孵育10 min終止反應(yīng)，于冰上冷卻，合成cDNA。合成的cDNA產(chǎn)物在－20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，作為下游的real-time PCR反應(yīng)模板。所有反應(yīng)在無(wú)酶環(huán)境中進(jìn)行，并且始終將RNA置于冰上，防止RNA模板降解。

1.3.4.3 real-time PCR定量基因表達(dá)

按照EvaGreen 2×qPCR MasterMix試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作，real-time PCR反應(yīng)體系（20 μL）：模板cDNA 2 μL、EvaGreen 2×qPCR MasterMix 10.0 μL、上下游引物各0.6 μL、無(wú)酶水6.8 μL。引物見(jiàn)表1。real-time PCR試劑加入無(wú)酶八連管中，離心使反應(yīng)液充分混勻后，立即進(jìn)行real-time PCR。每組3 個(gè)平行。TDC基因簇基因相對(duì)表達(dá)量按2－ΔΔCt計(jì)算[25]。其中，ΔCt=Ct目的基因－Ct內(nèi)參基因；ΔΔCt=ΔCt處理組－ΔCt空白組。Tyr DC、tyr P、tyr S以及nha C均以recA和tuf為內(nèi)參基因，取均值。

表1real-time PCR所用引物Table 1 Primers used for real-time PCR

1.3.5 菌懸液中酪胺含量的測(cè)定

用0.4 mol/L高氯酸溶解10 mg酪胺標(biāo)準(zhǔn)品，并于5 mL棕色容量瓶中定容，分別稀釋成終質(zhì)量濃度為5、10、15、25、50、100、200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取1.3.2節(jié)供試菌液，培養(yǎng)48 h期間每隔4 h取樣，12 000×g離心10 min，吸取1 mL上清液，加入相同體積0.4 mol/L高氯酸溶液，混勻，作為菌液樣品處理液。

酪胺結(jié)構(gòu)中缺少紫外檢測(cè)器可檢測(cè)到的發(fā)光基團(tuán)，因此將酪胺提取液和衍生化試劑（丹磺酰氯）進(jìn)行衍生化反應(yīng)。取酪胺標(biāo)準(zhǔn)溶液與菌液樣品處理液各1 mL，置于7 mL棕色樣品瓶中，加入200 μL 2 mol/L NaOH溶液使溶液呈堿性，再加入300 μL飽和NaHCO3溶液進(jìn)行緩沖，然后再加入2 mL 10 mg/mL 丹磺酰氯溶液（丙酮配制），振蕩搖勻15 s，于40 ℃暗反應(yīng)45 min后加入100 μL氨水，靜置30 min，終止反應(yīng)。用乙腈添加至終體積為5 mL，用0.22 μm濾膜過(guò)濾，待HPLC檢測(cè)。

HPLC條件：色譜柱：Agilent C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A為超純水，B為乙腈；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；柱溫30 ℃[29]。梯度洗脫程序?yàn)椋?～5 min，35% A、65% B；5～24 min，0% A、100% B；24～25 min，35% A、65% B；25～30 min，B 65%。酪胺標(biāo)準(zhǔn)溶液不同質(zhì)量濃度（x）與對(duì)應(yīng)峰面積（y）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為y=2 945x＋2 398.9（R2=0.999 8）。根據(jù)回歸方程計(jì)算菌液中的酪胺含量。

1.3.6 熏馬腸的制備

按照Lu Shiling等[30]所述工藝制備4 組熏馬腸：A組（不添加雪菊精油、不接種產(chǎn)胺菌）、B組（接種希氏腸球菌、不添加雪菊精油）、C組（接種希氏腸球菌、添加1/2 MIC雪菊精油）、D組（接種希氏腸球菌、添加MIC雪菊精油）。希氏腸球菌N47接種量均約為103CFU/mL。

原料馬肉用絞肉機(jī)切成小塊，按照瘦肉、肥肉質(zhì)量比80∶20混合，向肉糜中添加輔料（2.5%食鹽、0.1%味精、0.1%香料粉、2%白糖、0.005%亞硝酸鈉配料和1%煙熏液，均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)）腌制。按照分組添加（或不添加）不同質(zhì)量濃度雪菊精油，以及接種（或不接種）希氏腸球菌。然后采用灌裝機(jī)將不同處理組的混合肉糜灌入天然腸衣制成香腸。香腸在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中成熟程序進(jìn)行發(fā)酵。

1.3.7 熏馬腸pH值、細(xì)菌計(jì)數(shù)和酪胺含量的測(cè)定

在熏馬腸發(fā)酵第0、2、7、14、21、28天分別采樣進(jìn)行測(cè)定。

稱取5 g剪碎熏馬腸肉糜，在90 mL蒸餾水中拍打6 min，在室溫下用數(shù)字pH計(jì)測(cè)定pH值。

參考Sun Qinxiu[31]和Laranjo[32]等描述的平板計(jì)數(shù)法，測(cè)定熏馬腸發(fā)酵過(guò)程中總需氧菌（total aerobic bacteria，TAB）、乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）和腸細(xì)菌總數(shù)。

按照Lu Shiling等[30]的方法進(jìn)行樣品前處理，將5 g熏馬腸樣品在20 mL 0.4 mol/L高氯酸溶液中均質(zhì)，提取液4 ℃、5 000×g離心10 min，重復(fù)上述步驟。收集25 mL上清液，并用0.4 mol/L高氯酸溶液添加至50 mL得到樣品溶液。按照1.3.5節(jié)進(jìn)行衍生化反應(yīng)及酪胺含量HPLC定量測(cè)定。每組樣品做3 個(gè)平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 雪菊精油對(duì)希氏腸球菌N47的抑菌能力

雪菊精油對(duì)希氏腸球菌N47具有抑制作用，MIC和MBC分別為0.39 mg/mL和0.78 mg/mL。張艷梅等[23]探討了昆侖雪菊揮發(fā)油對(duì)新生隱球菌抗菌能力，發(fā)現(xiàn)昆侖雪菊揮發(fā)油能夠破壞新生隱球菌細(xì)胞膜達(dá)到抑菌效果，其對(duì)新生隱球菌的MIC為0.781 μL/mL。這一結(jié)果與本研究一致，均證明了雪菊精油的抑菌能力，但是本研究中雪菊精油對(duì)希氏腸球菌的MIC較低，這可能是由于菌體結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致希氏腸球菌對(duì)雪菊精油更為敏感。此外，迪里努爾·阿布都熱合曼等[33]用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液將雪菊樹(shù)脂精油稀釋至不同體積分?jǐn)?shù)（1.563%～75%），用濾紙片法對(duì)雪菊樹(shù)脂精油的抑菌能力進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌、枯草桿菌、青霉和黑曲霉的MIC分別為體積分?jǐn)?shù)25%、50%、75%、50%和75%。

2.2 雪菊精油對(duì)希氏腸球菌N47生長(zhǎng)的影響

圖2 雪菊精油對(duì)希氏腸球菌N47生長(zhǎng)過(guò)程中OD600 nm的影響Fig. 2 Effect of C. tinctoria essential oil on OD600 nm during the growth of E. hirae N47

菌懸液OD600nm越大，表明細(xì)菌數(shù)量越多。如圖2所示，添加雪菊精油的細(xì)菌OD600nm始終低于不添加雪菊精油組，說(shuō)明雪菊精油能夠抑制希氏腸球菌N47的生長(zhǎng)，且雪菊精油添加量越大，其抑制作用越強(qiáng)。但是雪菊精油并沒(méi)有改變其生長(zhǎng)趨勢(shì)，只是其生長(zhǎng)周期相對(duì)延長(zhǎng)。1/2 M和M組中，希氏腸球菌N47分別在培養(yǎng)28 h和32 h進(jìn)入穩(wěn)定期，生長(zhǎng)量相對(duì)同一時(shí)間酪氨酸組（L組）分別下降了67.09%和75.43%。有研究發(fā)現(xiàn)，雪菊中的抑菌成分以黃酮類化合物為主，特別是多羥基結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物[34-35]。康宏玲等[22]通過(guò)微波輔助法提取昆侖雪菊中的總黃酮，測(cè)定雪菊總黃酮對(duì)細(xì)菌、霉菌及酵母菌的抑菌性能，發(fā)現(xiàn)雪菊總黃酮對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、曲霉、酵母菌以及青霉的MIC分別為0.625、0.3125、0.3125、2.5、2.5、5.0 mg/mL。張艷梅等[23]對(duì)昆侖雪菊精油進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析，鑒定其主要抗菌組分是D-檸檬烯和α-蒎烯。這些抑菌成分會(huì)嚴(yán)重破壞新生隱球菌細(xì)胞膜，使核酸以及相關(guān)合成物質(zhì)泄漏，削弱細(xì)胞活力，最終導(dǎo)致新生隱球菌死亡。此外，還有研究指出天然植物精油還可以通過(guò)影響微生物代謝相關(guān)基因的表達(dá)，致使菌體衰亡[36]。

2.3 雪菊精油對(duì)希氏腸球菌N47生長(zhǎng)過(guò)程中pH值的影響

如圖3所示，所有組pH值均在前16 h內(nèi)呈上升趨勢(shì)。這是由于產(chǎn)胺菌在對(duì)數(shù)期快速繁殖，酪氨酸在酪氨酸脫羧酶作用下形成酪胺，而呈堿性酪胺的大量產(chǎn)生使培養(yǎng)液pH值快速上升。這一結(jié)果和薛林林等[29]對(duì)糞腸球菌和屎腸球菌的研究結(jié)果不一致，可能是由于希氏腸球菌N47產(chǎn)酪胺能力更強(qiáng)，其產(chǎn)酪胺的速率遠(yuǎn)大于產(chǎn)有機(jī)酸的速率。Fernandez等[37]的研究結(jié)果也表明在氨基酸存在的情況下，產(chǎn)生物胺的細(xì)菌能夠引起培養(yǎng)基pH值增加。1/2M、M組的最終pH值與L組相比均顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明雪菊精油可以有效降低培養(yǎng)基pH值，從而抑制希氏腸球菌N47的生長(zhǎng)。Wang Yongli等[38]發(fā)現(xiàn)綠茶精油和葡萄籽精油可以顯著降低干腌臘肉的pH值。

圖3 雪菊精油對(duì)希氏腸球菌N47生長(zhǎng)過(guò)程中pH值的影響Fig. 3 Effect of C. tinctoria essential oil on pH during the growth of E. hirae N47

2.4 雪菊精油對(duì)希氏腸球菌N47 TDC基因表達(dá)的影響

圖4 雪菊精油對(duì)希氏腸球菌N47 TDC相關(guān)基因表達(dá)量影響Fig. 4 Effect of C. tinctoria essential oil on the relative gene expression of tyrosine decarboxylase in E. hirae N47

如圖4所示，相比空白組（K），添加酪氨酸（L）的希氏腸球菌N47中tyr DC、tyr P基因表達(dá)量均顯著上調(diào)（P＜0.05），分別是K組的403.10 倍和795.11 倍。tyr DC和tyr P這兩種基因的上調(diào)，是由于向反應(yīng)體系中添加酪氨酸，為酪氨酸脫羧酶和酪氨酸/酪胺滲透酶提供了足夠的前體物質(zhì)。在酸性環(huán)境中，希氏腸球菌N47通過(guò)氨基酸脫羧反應(yīng)產(chǎn)生堿性物質(zhì)抵抗胞外的酸性環(huán)境。大量研究證明，氨基酸脫羧酶基因的表達(dá)需要酸性環(huán)境和高濃度的氨基酸底物[37]。在酪氨酸存在的情況下，添加MIC雪菊精油（M）的tyr DC和tyr P基因的表達(dá)量相比酪氨酸組（L）分別顯著降低了99.45%和95.18%（P＜0.05）。有研究表明在酪胺形成機(jī)制中主要參與的基因是tyr DC和tyr P，這進(jìn)一步表明雪菊精油可以通過(guò)影響酪氨酸脫羧酶和轉(zhuǎn)運(yùn)酪胺/酪氨酸蛋白的活性，減少相關(guān)基因表達(dá)量以及酪胺的積累[11]。這一結(jié)果和薛林林等[29]的研究結(jié)果一致，其發(fā)現(xiàn)阿魏酸可以顯著抑制屎腸球菌和糞腸球菌中tyr DC、tyr P基因的表達(dá)，從而減少酪胺的產(chǎn)生[29]。

酪氨酸組（L）tyr S基因的表達(dá)顯著低于不添加酪氨酸的K組（P＜0.05）。Linares等[39]得出類似結(jié)果，其研究顯示杜蘭氏腸球菌在酸性條件下，未添加酪氨酸時(shí)tyr S表達(dá)量最高，比酪氨酸誘導(dǎo)的mRNA表達(dá)水平高10 倍以上。酪氨酰-tRNA合成酶基因在酪氨酸不充足的條件下被激活，以防止這種氨基酸的大規(guī)模脫羧，確保其可用于蛋白質(zhì)合成[39]。與酪氨酸組（L）相比，添加雪菊精油的希氏腸球菌N47中tyr S基因上調(diào)。這可能是由于精油組中希氏腸球菌N47的生長(zhǎng)代謝受到抑制，生物活性減弱，使之利用培養(yǎng)基中酪氨酸能力降低，引發(fā)細(xì)胞的TDC基因簇遺傳調(diào)控的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制[29]，觸發(fā)tyr S基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)酪氨酸合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)維持自身的正常的生命活動(dòng)。

相比L組，雪菊精油顯著降低nha C基因的表達(dá)（P＜0.05），M組nha C基因表達(dá)量?jī)H為酪氨酸組（L）的65.29%。關(guān)于產(chǎn)胺菌nha C基因在酪胺合成中的確切功能尚不明確，但可以確定雪菊精油能夠抑制Na＋/H＋轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)。

2.5 雪菊精油對(duì)希氏腸球菌N47產(chǎn)酪胺含量的影響

圖5 雪菊精油對(duì)希氏腸球菌培養(yǎng)48 h酪胺積累的影響Fig. 5 Effect of C. tinctoria essential oil on the accumulation of tyramine in E. hirae during 48 h cultivation

如圖5所示，在僅添加酪氨酸情況下（L），希氏腸球菌N47產(chǎn)酪胺含量的變化趨勢(shì)與其生長(zhǎng)趨勢(shì)一致。該菌在前12 h酪胺含量急劇增加，隨后酪胺積累速度減慢，在24 h后含量逐漸趨于穩(wěn)定，最終酪胺生成量最高達(dá)到189.84 μg/mL。顯然，在酪氨酸含量充足的情況下，酪胺積累量和菌數(shù)呈正相關(guān)，添加酪氨酸可顯著提高供試菌產(chǎn)酪胺量。由于培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限，空白組（K）的酪胺終產(chǎn)量相對(duì)偏低。這說(shuō)明希氏腸球菌N47產(chǎn)酪胺量依賴于外界環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)總量。蛋白質(zhì)豐富的食品更易出現(xiàn)生物胺超標(biāo)這一食品安全問(wèn)題。

不同質(zhì)量濃度的雪菊精油對(duì)減少供試菌的酪胺產(chǎn)生量具有顯著效果（P＜0.05），在添加1/2 MIC、MIC雪菊精油時(shí)，希氏腸球菌N47中培養(yǎng)48 h的酪胺最終生成量分別為35.62 μg/mL和17.84 μg/mL，較酪胺組（L）分別減少了81.24%和90.60%。這表明雪菊精油質(zhì)量濃度越大，其酪胺積累量越低。結(jié)合2.2節(jié)和2.4節(jié)結(jié)果，雪菊精油不僅從源頭抑制產(chǎn)胺菌的生長(zhǎng)，還通過(guò)顯著降低存活菌tyr DC、tyr P表達(dá)量，從細(xì)菌數(shù)量和基因表達(dá)上雙重阻礙了酪胺的積累。大量研究表明，天然植物提取物能夠抑制食品中生物胺的形成。Erol等[40]研究石榴籽提取物對(duì)谷物發(fā)酵食品Tarhana中生物胺形成的影響，發(fā)現(xiàn)添加0%、0.5%、1%、2%石榴籽提取物后，Tarhana中總生物胺含量分別為894.7、569.67、514.52、424.60 mg/kg。Martín等[41]研究百里香精油和牛至精油對(duì)真空包裝鯉魚(yú)魚(yú)片中生物胺形成的影響，證實(shí)了這兩種精油均能顯著抑制腐胺、尸胺、酪胺和苯乙胺在魚(yú)片中的積累。

2.6 雪菊精油對(duì)熏馬腸發(fā)酵過(guò)程中pH值的影響

圖6 雪菊精油對(duì)新疆熏馬香腸發(fā)酵過(guò)程中pH值的影響Fig. 6 Effect of C. tinctoria essential oil on pH of Xinjiang smoked horse sausage during fermentation

如圖6所示，所有香腸的pH值均在前7 d呈下降趨勢(shì)，這是由于熏馬腸中乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中代謝產(chǎn)生有機(jī)酸，使得熏馬腸的pH值降低[42]。發(fā)酵7～28 d，pH值緩慢上升，這可能是由于堿性化合物的積累，如胺、肽和氨基酸[43]。在發(fā)酵后期（21～28 d），添加1/2 MIC（C）和MIC雪菊精油（D）的熏馬腸pH值均顯著低于對(duì)照組（B）（P＜0.05）。大量研究發(fā)現(xiàn)，添加植物提取物，如蔥[44]、栗子、綠茶、葡萄、海藻[45]和石榴籽[40]的提取物可有效降低發(fā)酵食品pH值。pH值的降低對(duì)于提高發(fā)酵肉制品所需顏色的轉(zhuǎn)化率、抑制有害細(xì)菌的生長(zhǎng)以及減少發(fā)酵肉制品中不良風(fēng)味的形成至關(guān)重要[38]。

2.7 熏馬腸發(fā)酵過(guò)程中微生物菌落總數(shù)變化

表2 雪菊精油對(duì)新疆熏馬腸發(fā)酵過(guò)程中TAB、LAB和腸細(xì)菌數(shù)量的影響Table 2 Effect of C. tinctoria essential oil on total aerobic bacterial count, lactic acid bacterial count, and Enterobacteriaceae count in Xinjiang smoked horse sausages during fermentation lg（CFU/g）

如表2所示，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，A、B、C和D組總TAB總數(shù)均呈先上升后下降的趨勢(shì)，A、C和D組均在發(fā)酵第7天達(dá)到最大值，第28天分別降至6.77、7.59、6.17、5.82（lg（CFU/g））?？梢?jiàn)，雪菊精油對(duì)熏馬腸中細(xì)菌的生長(zhǎng)有顯著抑制作用（P＜0.05）[38]。Sun Qinxiu等[46]發(fā)現(xiàn)添加香料提取物（肉桂、茴香和丁香）的哈爾濱干香腸中需氧細(xì)菌總數(shù)較低（P＜0.05）。

在熏馬腸整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，乳酸菌的變化趨勢(shì)與TAB類似。LAB在發(fā)酵初期急劇增加，成為主要微生物，不僅促進(jìn)了風(fēng)味物質(zhì)的形成，而且加速了熏香腸體系pH值的下降。LAB在發(fā)酵后期數(shù)量減少，這可能是由于熏馬腸中低水分含量、低pH值以及代謝產(chǎn)物積累等不利條件。在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，B、C、D組熏馬腸中乳酸菌含量無(wú)顯著差異（P＞0.05），這表明雪菊精油對(duì)LAB的抑制作用不強(qiáng)。這與Yu Honghong的研究結(jié)果類似[47]。

與對(duì)照組（B）相比，C組和D組熏馬腸中的腸細(xì)菌數(shù)量均顯著減少（P＜0.05），說(shuō)明雪菊精油對(duì)腸細(xì)菌有較強(qiáng)的抑制作用，這與Sun Qinxiu等[46]報(bào)道的結(jié)果一致。再次證明植物精油可以作為合成抑菌劑的替代品添加至傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中，以提高食品的安全性。

2.8 熏馬腸發(fā)酵過(guò)程中的酪胺積累量分析

圖7 雪菊精油對(duì)新疆熏馬腸發(fā)酵過(guò)程中酪胺積累的影響Fig. 7 Effect of C. tinctoria essential oil on tyramine accumulation in Xinjiang smoked horse sausage during fermentation

如圖7所示，未添加雪菊精油的熏馬腸樣品中酪胺含量在前14 d均顯著上升（P＜0.05），這與香腸中產(chǎn)酪胺菌的快速增殖有關(guān)；發(fā)酵第14～28天緩慢上升可能是由于香腸pH值和水分含量降低，不利于微生物的生長(zhǎng)。對(duì)照組（B）、1/2 MIC（C）和MIC雪菊精油組（D）的初始酪胺含量均值為2.07 mg/kg，在第28天時(shí)酪胺含量分別增加到222.57、78.52 mg/kg和45.83 mg/kg。第28天時(shí)1/2 MIC組和MIC組熏馬腸中酪胺含量分別較對(duì)照組（B）降低了64.72%和79.41%，表明雪菊精油能夠顯著抑制熏馬腸中酪胺的積累，且雪菊精油質(zhì)量濃度越大抑制能力越強(qiáng)（P＜0.05）。與此結(jié)果一致，Cai Luyun等[48]發(fā)現(xiàn)添加丁香、孜然和留蘭香精油可以有效抑制發(fā)酵鳳尾魚(yú)中生物胺的積累。

3 結(jié) 論

在純菌培養(yǎng)體系中，雪菊精油能夠顯著抑制希氏腸球菌的生長(zhǎng)并降低培養(yǎng)液pH值，且雪菊精油質(zhì)量濃度越高，作用越強(qiáng)。雪菊精油能顯著抑制TDC基因簇中tyr DC、tyr P基因的表達(dá)（P＜0.05），從而抑制TDC途徑，降低酪胺積累量。雪菊精油通過(guò)抑制希氏腸球菌的生長(zhǎng)和tyr DC、tyr P的表達(dá)，雙重阻礙酪胺的積累。當(dāng)添加MIC雪菊精油時(shí)，希氏腸球菌N47的酪胺生成量較酪氨酸組（L）減少了90.60%。在熏馬腸體系中，添加雪菊精油抑制了不良腸細(xì)菌的滋生，降低了產(chǎn)品pH值，降低了酪胺積累量。1/2 MIC和MIC雪菊精油組熏馬腸相比于對(duì)照組（B）酪胺積累量分別減少了64.72%和79.41%?？傊?，雪菊精油能有效抑制酪胺的形成，提高新疆熏馬腸的產(chǎn)品安全性。