甲酸對(duì)釀酒酵母的細(xì)胞毒性

曾令杰，黃錦翔，豐丕雪，安佳星，佀再勇，龍秀鋒，伍時(shí)華，易 弋

（廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 柳州 545006）

燃料乙醇因其具有清潔、可持續(xù)、可再生等特性，被認(rèn)為是目前取代化石燃料的最有潛力的可再生能源之一[1]。木質(zhì)纖維素是地球上貯量最為豐富、分布廣泛且價(jià)格低廉的可再生資源，通過(guò)其生產(chǎn)燃料乙醇不僅能滿足當(dāng)前的能源需求，而且能有效減少環(huán)境污染[2]。木質(zhì)纖維素由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素3 種物質(zhì)組成，這3 種組分之間由共價(jià)鍵和氫鍵相互作用而緊密結(jié)合。利用木質(zhì)纖維素原料進(jìn)行乙醇發(fā)酵需要對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理，破壞纖維素復(fù)雜結(jié)構(gòu)，但在預(yù)處理過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞有毒害作用的抑制物?；谶@些細(xì)胞抑制物的來(lái)源，通常將這些抑制物分為3 大類：糖降解產(chǎn)生的糠醛和5-羥甲基糠醛等呋喃類化合物，木質(zhì)素分解產(chǎn)生的兒茶酚、丁香醛等酚類化合物，以及甲酸和乙酸等弱酸類化合物[3-4]。這些抑制物會(huì)對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝和乙醇生產(chǎn)產(chǎn)生負(fù)面影響[5]。甲酸是木質(zhì)纖維素原料水解液中一種常見(jiàn)的弱酸類抑制物，由呋喃類化合物進(jìn)一步降解形成。在水解液中常見(jiàn)的幾種弱酸，如甲酸、乙酸、乙酰丙酸，其中雖然甲酸的濃度比較低，但其對(duì)細(xì)胞抑制能力最強(qiáng)[6-7]。Li Yuncheng等[8]研究表明在相同濃度（30 mmol/L）弱酸脅迫下，甲酸對(duì)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于乙酸和乙酰丙酸。甲酸分子質(zhì)量低且pKa值較小，因此被認(rèn)為是木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中毒性最強(qiáng)的弱酸[9-10]。Larsson等[11]研究表明甲酸的毒性強(qiáng)于乙酸和乙酰丙酸是因?yàn)榧姿峋哂懈偷膒Ka值和解離程度小引起。

為探究甲酸對(duì)釀酒酵母的毒性機(jī)理，通過(guò)測(cè)定甲酸處理前后釀酒酵母的生長(zhǎng)情況、葡萄糖消耗、乙醇的含量、細(xì)胞膜通透性、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和己糖激酶（hexokinase，HK）活力，并結(jié)合掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）和傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrum，F(xiàn)TIR）進(jìn)行分析。本研究旨在了解甲酸對(duì)酵母細(xì)胞的生理毒性機(jī)制，為進(jìn)一步研究提高釀酒酵母對(duì)木質(zhì)纖維素水解液抑制物耐受性的方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

釀酒酵母GGSF16由廣西科技大學(xué)微生物研究所提供。

甲酸、三氯乙酸（均為分析純） 西隴科學(xué)股份有限公司；戊二醛（分析純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；HK活性檢測(cè)試劑盒 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Alpha1-2LDplus真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)CHRIST公司；飛納phenom臺(tái)式SEM 復(fù)納科學(xué)儀器（上海）有限公司；Frontier FTIR儀 興和儀器（上海）有限公司；UV-8000S紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；SZT-15T手動(dòng)粉末壓片機(jī) 天津市眾拓科技發(fā)展有限公司；JY91-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；ZWYR-2402疊式恒溫調(diào)速搖床上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；H2100R低溫高速離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L；酵母膏蛋白胨葡萄糖（yeast extract peptone extrose，YEPD）培養(yǎng)基：葡萄糖100 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖160 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，121 ℃滅菌20 min，pH值自然。

1.3.2 酵母細(xì)胞菌懸液的制備

從斜面試管中挑取1～2 環(huán)釀酒酵母GGSF16接種到種子培養(yǎng)基中，在30 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)14 h，采用血球計(jì)數(shù)對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并稀釋使其菌懸液濃度約為1×108CFU/mL。

1.3.3 甲酸對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

將酵母菌懸液按照10%接種量接入到Y(jié)EPD培養(yǎng)基中，分別吸取一定量40 g/L的甲酸母液于培養(yǎng)基中，將甲酸配制成質(zhì)量濃度分別為1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 g/L，以未添加甲酸的菌液作為對(duì)照組，添加甲酸的菌液為處理組，30 ℃、150 r/min搖床中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔2 h取樣，在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、光密度為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線，并采用次甲基藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞死亡率[12]。每個(gè)樣品進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.3.4 甲酸對(duì)酵母乙醇發(fā)酵的影響

根據(jù)1.3.3節(jié)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，選擇甲酸質(zhì)量濃度1.8 g/L做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照10%接種量將酵母細(xì)胞菌懸液接入到新鮮種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h后取30 mL菌液離心棄上清液，并用無(wú)菌水稀釋至合適體積并振蕩混勻，再以10%接種量將3 mL濃縮種子液加入至300 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始酵母細(xì)胞數(shù)為3.7×107CFU/mL。將甲酸添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中使其終質(zhì)量濃度為1.8 g/L作為處理組，以未添加甲酸的菌液作為對(duì)照組，在30 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)24 h，每隔2 h取樣，并用高效液相色譜儀和氣相色譜儀分別測(cè)定葡萄糖和乙醇含量。液相色譜條件：Alltima Amino色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；乙腈-超純水（80∶20，V/V）的混合液作為流動(dòng)相，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL。氣相色譜條件：色譜柱為TM-930（25 m×0.53 mm，1 μm）；初始溫度40 ℃，以5 ℃/min速率升至80 ℃，保持2 min，再以10 ℃速率升至150 ℃，進(jìn)樣量0.5 μL。每個(gè)樣品進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.3.5 甲酸對(duì)酵母細(xì)胞膜通透性的影響

按照10%接種量將酵母細(xì)胞菌懸液接入到250 mL YEPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h，添加甲酸到Y(jié)EPD培養(yǎng)基中使其終質(zhì)量濃度為1.8 g/L作為處理組，以未添加甲酸的為對(duì)照組，在30 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)6 h，每隔2 h取樣。取5 mL發(fā)酵液，在80 ℃水浴鍋中滅酶5 min，然后取經(jīng)水浴后的發(fā)酵液于3 000 r/min離心20 min，將上清液分別標(biāo)記置于4 ℃冰箱保存。在260、280 nm波長(zhǎng)處測(cè)定測(cè)定核酸、蛋白質(zhì)的光密度，并記錄好實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[13-14]。每個(gè)樣品進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.3.6 甲酸對(duì)酵母細(xì)胞MDA含量的影響

按1.3.5節(jié)培養(yǎng)方法，MDA含量的測(cè)定參考Howlett等[15]方法。離心收集酵母細(xì)胞，經(jīng)無(wú)菌水洗滌3 次后棄上清液，加入1 mL無(wú)菌ddH2O，重懸酵母細(xì)胞，另加入2 mL 0.6%硫代巴比妥酸溶液，充分混勻并封口后于95～100 ℃水浴煮沸20 min，冷卻后10 000 r/min離心5 min，取上清液分別測(cè)定450、532、600 nm波長(zhǎng)處吸光度（A）。測(cè)定細(xì)胞干質(zhì)量，根據(jù)式（1）、（2）計(jì)算MDA濃度與含量。每個(gè)樣品進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。

式中：V為反應(yīng)體系溶液體積/mL；W為樣品質(zhì)量/g。

1.3.7 甲酸對(duì)酵母細(xì)胞形態(tài)的影響

按照1.3.5節(jié)培養(yǎng)方法，在30 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)4 h，取發(fā)酵液8 000 r/min、4 ℃離心10 min收集菌體，用磷酸鹽緩沖液洗滌3 次，每次靜置10 min，將菌體固定于體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛溶液中，4 ℃過(guò)夜固定，8 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集菌體，以20%、50%、70%、80%、100%的乙醇按照順序依次洗滌，每個(gè)濃度處理10 min，8 000 r/min、4 ℃離心10 min收集菌體，最后使用真空冷凍干溶液燥機(jī)干燥，噴金后在SEM下觀察、拍照。

1.3.8 FTIR分析

按照1.3.5節(jié)培養(yǎng)方法，離心收集菌體，用磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞3 次，冷凍干燥，本實(shí)驗(yàn)采用溴化鉀壓片法[16]。將凍干的酵母菌體與溴化鉀按1∶20的質(zhì)量比混合，然后用瑪瑙研缽研成均勻粉末狀。掃描條件設(shè)置為光譜范圍400～4 000 cm－1、分辨率4 cm－1，采用溴化鉀作為空白對(duì)照，每個(gè)樣品在相同條件下重復(fù)3 次。

1.3.9 甲酸對(duì)酵母細(xì)胞HK活力的影響

按照1.3.5節(jié)培養(yǎng)方法，在30 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)1 h，離心收集菌體，超聲波破碎（功率20%，超聲3 s，間隔10 s，重復(fù)30 次），8 000 r/min、4 ℃離心10 min收集上清液，置冰上待測(cè)。采用Solarbio公司HK試劑盒檢測(cè)HK活力，每個(gè)樣品進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。酶活性單位的定義（U/104cell）：每1萬(wàn) 個(gè)細(xì)胞每分鐘生成1 nmol NADPH定義為1 個(gè)酶活力單位。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.1軟件（單因素方差分析）和Origin 9.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行圖表的制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲酸對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

由圖1A可知，不同質(zhì)量濃度甲酸對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制不同，且隨著質(zhì)量濃度的增加抑制作用加強(qiáng)。對(duì)照組在培養(yǎng)2 h開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)期，6 h進(jìn)入對(duì)數(shù)中期，8 h進(jìn)入穩(wěn)定期；添加1.4 g/L甲酸處理組在培養(yǎng)10 h進(jìn)入穩(wěn)定期，與對(duì)照組相比滯后了2 h；添加1.6 g/L甲酸處理組發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，與對(duì)照組相比，延滯期和對(duì)數(shù)期都延長(zhǎng)了2 h，穩(wěn)定期滯后了4 h；添加1.8 g/L甲酸處理組在培養(yǎng)6 h進(jìn)入對(duì)數(shù)期，14 h進(jìn)入穩(wěn)定期，與對(duì)照組相比，穩(wěn)定期滯后6 h。而在整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，1.8 g/L甲酸處理組的死亡率都比對(duì)照組高（圖1B），尤其是在0～2 h的延滯期細(xì)胞死亡率更明顯；添加2.0 g/L甲酸處理組，釀酒酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)完全被抑制。綜上所述，甲酸對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖具有一定的毒害作用。為保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究，選擇質(zhì)量濃度為1.8 g/L的甲酸作為處理組。

圖1 甲酸對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig. 1 Effect of formic acid on the growth of yeast cells

2.2 甲酸對(duì)酵母乙醇發(fā)酵過(guò)程的影響

酵母細(xì)胞能夠通過(guò)葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，而甲酸的添加會(huì)抑制酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而影響乙醇的生成。由圖2可知，對(duì)照組在6 h后開(kāi)始快速消耗葡萄糖，16 h葡萄糖消耗完全。而1.8 g/L甲酸處理在發(fā)酵前期抑制了酵母細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用，在10 h才開(kāi)始消耗糖，與對(duì)照組相比葡萄糖消耗延長(zhǎng)了4 h，在20 h葡萄糖才基本消耗完，延長(zhǎng)了細(xì)胞發(fā)酵的周期，且甲酸處理組乙醇生成量顯著低于對(duì)照組。說(shuō)明1.8 g/L甲酸處理組在發(fā)酵前期抑制酵母細(xì)胞對(duì)糖的利用，乙醇發(fā)酵速率緩慢，在發(fā)酵中后期，酵母可能會(huì)對(duì)甲酸產(chǎn)生耐性，保持較高的存活率，進(jìn)一步促進(jìn)了對(duì)糖的利用，但甲酸的添加明顯延長(zhǎng)了酵母細(xì)胞發(fā)酵的周期，降低了乙醇產(chǎn)量。

圖2 甲酸對(duì)酵母細(xì)胞乙醇發(fā)酵過(guò)程的影響Fig. 2 Effect of formic acid on alcohol fermentation characteristics of yeast cells

2.3 甲酸對(duì)釀酒酵母細(xì)胞膜通透性的影響

細(xì)胞膜是隔離胞內(nèi)外物質(zhì)的天然屏障，細(xì)胞膜通透性的增強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)重要物質(zhì)泄露，從而使細(xì)胞失去活性[17]。因此，可以通過(guò)檢測(cè)菌液在260 nm和280 nm波長(zhǎng)處的光密度分析其對(duì)細(xì)胞膜的破壞程度[18]。由圖3可知，甲酸處理后的酵母細(xì)胞的蛋白質(zhì)和核酸釋放量明顯增加，OD260nm的增加比OD280nm更為明顯，且隨著甲酸處理時(shí)間的延長(zhǎng)，胞外核酸和蛋白質(zhì)的含量隨之增加，且與對(duì)照組相比，核酸和蛋白質(zhì)分別增加到1.4 倍和1.67 倍，這與藍(lán)蔚青等[19]研究ε-聚賴氨酸使腐生葡萄球菌菌液中胞外核酸含量的增加趨勢(shì)結(jié)論相似。由此推測(cè)甲酸與酵母細(xì)胞接觸后，破壞了酵母細(xì)胞膜，使得細(xì)胞膜通透性增加，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)外泄，從而使釀酒酵母的活性較低，甚至死亡。

圖3 甲酸對(duì)酵母細(xì)胞膜通透性的影響Fig. 3 Effect of formic acid on cell membrane permeability of yeast cells

2.4 甲酸對(duì)酵母細(xì)胞MDA含量的影響

MDA是生物體內(nèi)脂質(zhì)與自由基發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其含量可以一定程度上反映酵母細(xì)胞受脅迫損傷的程度，也能反映細(xì)胞膜所受傷害程度[20]。由圖4可以看出，酵母細(xì)胞經(jīng)甲酸脅迫后MDA含量隨著甲酸處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加。甲酸處理的第2小時(shí)，酵母細(xì)胞內(nèi)MDA含量增加緩慢，隨后4 h，MDA含量顯著升高，與對(duì)照組相比，分別增加到3.7 倍和5.3 倍。表明短時(shí)間內(nèi)甲酸不會(huì)對(duì)酵母細(xì)胞造成嚴(yán)重的氧化損傷，這可能是酵母對(duì)逆境的適應(yīng)性反應(yīng)。而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化程度加劇，MDA含量升高，對(duì)酵母細(xì)胞造成氧化損傷，進(jìn)一步加速了細(xì)胞的死亡。這與李函彤等[21]研究不同種類的硫?qū)湍父汇t以及體內(nèi)氧化應(yīng)激影響的結(jié)論相似。

圖4 甲酸對(duì)酵母細(xì)胞MDA含量的影響Fig. 4 Effect of formic acid on MDA content of yeast cells

2.5 甲酸對(duì)酵母細(xì)胞形態(tài)的影響

圖5 甲酸處理前后SEM圖Fig. 5 SEM images of yeast cells before and after formic acid treatment

由圖5可以看出，對(duì)照組酵母表面光滑飽滿，外形呈橢圓或圓形，細(xì)胞形態(tài)整齊且健壯，有完整的細(xì)胞壁以及光滑的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，酵母細(xì)胞生命力旺盛（圖5A），而經(jīng)過(guò)甲酸處理后細(xì)胞遭到了明顯破壞，與對(duì)照組相比酵母細(xì)胞表面變得粗糙，出現(xiàn)空洞，邊緣產(chǎn)生皺褶，細(xì)胞壁塌陷，細(xì)胞與細(xì)胞之間彼此粘黏現(xiàn)象（圖5B），這可能是細(xì)胞壁和細(xì)胞膜被破損，細(xì)胞內(nèi)容物泄露使它們粘連在一起，因此，從SEM圖像中可以明顯看出甲酸對(duì)釀酒酵母細(xì)胞壁有明顯破壞作用，對(duì)細(xì)胞膜也有一定影響，從而使酵母細(xì)胞失去了細(xì)胞壁的保護(hù)，細(xì)胞正常生理代謝與物質(zhì)能量代謝受阻，導(dǎo)致菌體生理活性受到抑制，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷與死亡。

2.6 FTIR分析

研究表明，酵母細(xì)胞壁主要由β-葡聚糖、甘露糖蛋白、少量的幾丁質(zhì)和脂類組成，對(duì)維持細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞間識(shí)別具有重要作用[22]。這些物質(zhì)能夠提供大量的活性基團(tuán)，且由這些基團(tuán)產(chǎn)生的伸縮、彎曲和變形振動(dòng)均可以在FTIR中產(chǎn)生明顯的吸收峰[23]。在酵母菌的光譜圖中，表征蛋白質(zhì)最重要的譜帶是酰胺帶，其中位于1 650 cm－1處的酰胺I帶是由C=O的伸縮振動(dòng)、N—H的彎曲振動(dòng)形成，它表明了釀酒酵母中蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主[24]。1 540 cm－1處的酰胺II帶則是由N—H的彎曲振動(dòng)和C—N的伸縮振動(dòng)引起，1 452 cm－1處的特征峰是由于CH2的剪式振動(dòng)、CH3的非對(duì)稱彎曲振動(dòng)引起[25]。位于1 240 cm－1處的酰胺III帶可能是由C—N彎曲振動(dòng)、—COOH中C—O的伸縮振動(dòng)和P=O的變形振動(dòng)導(dǎo)致，代表磷酸二酯鍵的不對(duì)稱拉伸，與磷脂雙分子層有關(guān)[26]。位于1 080 cm－1和915 cm－1左右的吸收峰分別代表酵母的RNA、DNA或細(xì)胞壁中存在的碳水化合物和多糖環(huán)鍵[27]。位于810 cm－1左右處的峰位是釀酒酵母表面醛糖酸的特征峰，位于540～580 cm－1處的峰位是的剪式振動(dòng)產(chǎn)生[24]。位于3 418 cm－1左右的峰位是由于分子間、分子內(nèi)氫鍵或者KBr吸收水產(chǎn)生的—OH振動(dòng)，3 307 cm－1處吸收峰由于幾丁質(zhì)中的—OH和仲胺中的—NH的伸縮振動(dòng)引起，而位于3 100～2 800 cm－1處的吸收峰由于脂肪酸中—CH基團(tuán)的反對(duì)稱振動(dòng)引起，代表脂質(zhì)官能團(tuán)[28]。

圖6 為甲酸處理前后的酵母細(xì)胞FTIR。蛋白質(zhì)是構(gòu)成細(xì)胞膜和細(xì)胞壁主要組成成分，在甲酸處理后發(fā)現(xiàn)酰胺I帶的紅移（1 651.3/1 650.3 cm－1）和酰胺II帶的藍(lán)移（1 542.9/1 545.4 cm－1），表明可能蛋白質(zhì)肽鏈上O原子和N原子發(fā)生了變化，推測(cè)甲酸脅迫可能引起酵母細(xì)胞蛋白質(zhì)變性。另外，酰胺III帶（1 243.3/1 242.4 cm－1）、（1 081.5/1 080.7 cm－1）峰位均產(chǎn)生了紅移，可能是甲酸處理后破壞細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了改變并釋放了部分核酸和蛋白質(zhì)，這與前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。在3 307、3 002.6 cm－1和2 928.6 cm－1處峰位明顯增加，表明甲酸改變了細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)的結(jié)構(gòu)，且對(duì)酵母細(xì)胞膜的脂質(zhì)產(chǎn)生了破壞。在914.2 cm－1處的峰位增強(qiáng)，表明甲酸改變了釀酒酵母表面的多糖羥基骨架，進(jìn)而改變酵母細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)。代表醛糖酸的特征峰在812.4 cm－1也發(fā)生了較大的變化，表明酵母細(xì)胞表面的物質(zhì)可能發(fā)生了很大的化學(xué)變化[29]。因此可以看出甲酸通過(guò)改變蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)和幾丁質(zhì)的結(jié)構(gòu)對(duì)酵母細(xì)胞壁和細(xì)胞膜進(jìn)行破壞，從而導(dǎo)致了細(xì)胞的死亡。

圖6 甲酸處理前后FTIR圖Fig. 6 Infrared spectra of yeast cells before and after formic acid treatment

2.7 甲酸對(duì)酵母細(xì)胞HK活力的影響

HK廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是葡萄糖分解過(guò)程中的第一個(gè)關(guān)鍵酶，催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖，在真菌的糖代謝中發(fā)揮重要作用。由圖7可知，經(jīng)甲酸處理后，HK活力明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），由（0.07±0.003）U/104cell上升到了（0.277±0.005）U/104cell（P＜0.05），這表明甲酸處理后增加了酵母細(xì)胞內(nèi)HK活力，加快了對(duì)葡萄糖的分解代謝，進(jìn)而為酵母細(xì)胞抵抗甲酸的損傷提供了能量。

圖7 甲酸對(duì)酵母細(xì)胞HK活力的影響Fig. 7 Effect of formic acid on hexokinase activity of yeast cells

3 討 論

木質(zhì)纖維素水解后會(huì)產(chǎn)生一些細(xì)胞抑制物，這些抑制物會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝造成一定毒害作用，從而降低后續(xù)乙醇發(fā)酵的產(chǎn)率[30-31]。甲酸是木質(zhì)纖維素原料水解產(chǎn)生的毒害副產(chǎn)物之一，主要由糠醛和5-羥甲基糠醛產(chǎn)生[32]，在木質(zhì)纖維素乙醇發(fā)酵過(guò)程中對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝都具有較強(qiáng)抑制作用[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，添加1.8 g/L甲酸能夠明顯抑制酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和乙醇發(fā)酵時(shí)間，可以破壞酵母的細(xì)胞壁，改變細(xì)胞膜的通透性，使得細(xì)胞內(nèi)容物外漏，胞內(nèi)MDA含量和HK活力顯著上升（P＜0.05），從而影響了酵母細(xì)胞正常生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致其死亡。

有些外界因素能夠破壞細(xì)胞膜的通透性，從而干擾細(xì)胞正常的物質(zhì)運(yùn)輸[34]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甲酸處理后的酵母細(xì)胞的蛋白質(zhì)和核酸釋放量明顯增加（P＜0.05），鞏林林等[35]研究分析了有機(jī)溶劑乙腈對(duì)酵母菌細(xì)胞膜透性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)面包酵母經(jīng)過(guò)20%經(jīng)過(guò)20%乙腈處理后對(duì)細(xì)胞膜造成一定損傷，OD260nm值和OD280nm值均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；李永紅等[36]通過(guò)對(duì)紅酵母細(xì)胞通透性的研究，發(fā)現(xiàn)添加甲苯能提高紅酵母細(xì)胞通透性。此外，周倩倩等[37]研究丁香酚對(duì)腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌的抑菌機(jī)制，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)丁香酚處理后細(xì)胞膜遭到破壞，使細(xì)胞外OD280nm值和OD260nm值的水平上升。因此，推測(cè)甲酸處理后改變了酵母細(xì)胞膜通透性，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)流失，最終使酵母細(xì)胞無(wú)法正常進(jìn)行生命活動(dòng)而死亡。吳麗華等[38]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)0.4 mmol/L和0.6 mmol/L亞砷酸鈉處理后，細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化程度加劇，MDA含量在釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)顯著提高。Ji Zhihua等[39]研究了不同濃度四氯雙酚A誘導(dǎo)酵母細(xì)胞毒性，經(jīng)5 μmol/L四氯雙酚A處理后酵母細(xì)胞中MDA水平增加，促進(jìn)了細(xì)胞膜的損傷和膜通透性的增強(qiáng)。本研究經(jīng)甲酸處理后酵母細(xì)胞內(nèi)MDA含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，說(shuō)明甲酸破壞了細(xì)胞膜，使得膜的通透性增大，脂質(zhì)過(guò)氧化程度加劇，引起酵母細(xì)胞氧化損傷，進(jìn)一步加速了細(xì)胞的死亡。侯穎等[40]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)致死濃度聚賴氨酸處理后酵母細(xì)胞表面粗糙，出現(xiàn)明顯凹陷和細(xì)微凸起，細(xì)胞膜造成嚴(yán)重?fù)p傷。薄濤等[41]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)釀酒酵母經(jīng)過(guò)500 μg/mLε-聚-L-賴氨酸處理后，與對(duì)照組相比細(xì)胞膜表面變的粗糙，出現(xiàn)明顯孔洞等現(xiàn)象。在SEM觀察下，經(jīng)甲酸處理4 h后酵母細(xì)胞表面變得粗糙、邊緣產(chǎn)生皺褶、部分細(xì)胞壁塌陷，且細(xì)胞與細(xì)胞之間彼此粘黏現(xiàn)象；因此，推測(cè)甲酸破壞了酵母細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，以致細(xì)胞失去了保護(hù)而出現(xiàn)死亡。

FTIR是一種基于化合物中官能團(tuán)和極性鍵振動(dòng)的結(jié)構(gòu)分析技術(shù)[42]，其特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、快速及靈敏度高[43]，近年來(lái)已廣泛應(yīng)用于大分子化合物結(jié)構(gòu)分析以及蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)解析，是獲取分子結(jié)構(gòu)信息的有力工具[44]。本研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母經(jīng)甲酸處理前后FTIR圖部分峰發(fā)生了變化，結(jié)果表明與之相關(guān)的官能團(tuán)包括氨基、羥基，而這些官能團(tuán)主要存在于釀酒酵母細(xì)胞壁上的蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)，說(shuō)明酵母細(xì)胞的結(jié)構(gòu)進(jìn)一步遭到破壞。HK作為糖酵解過(guò)程中第一個(gè)關(guān)鍵酶，其活性大小直接與胞內(nèi)能量代謝快慢有關(guān)，在真菌的糖代謝中發(fā)揮重要作用[45]。本研究中，甲酸處理后酵母細(xì)胞內(nèi)HK活性相比對(duì)照組提高到3.95 倍，由此說(shuō)明甲酸脅迫在一定程度上加快了葡萄糖代謝，促進(jìn)了ATP的合成，為酵母細(xì)胞抵抗甲酸損傷提供了充足的保障。

4 結(jié) 論

通過(guò)測(cè)定不同質(zhì)量濃度甲酸對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)代謝的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加1.8 g/L甲酸能夠明顯抑制酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)，降低了乙醇產(chǎn)量，并且延長(zhǎng)了葡萄糖消耗和酵母細(xì)胞乙醇發(fā)酵的周期；甲酸處理后改變了酵母細(xì)胞膜通透性，MDA含量增加，使得細(xì)胞內(nèi)溶物發(fā)生泄露，最終導(dǎo)致酵母細(xì)胞的死亡。同時(shí)，釀酒酵母通過(guò)調(diào)節(jié)糖酵解中HK活力，為細(xì)胞提供充足的ATP抵抗脅迫；從甲酸處理前后的SEM圖像可看出原來(lái)光滑的酵母菌體表面出現(xiàn)空洞、大量皺褶以及細(xì)胞之間彼此粘黏現(xiàn)象，而通過(guò)FTIR分析結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)甲酸可以改變蛋白質(zhì)、糖類等分子成分的官能團(tuán)結(jié)構(gòu)，對(duì)酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜進(jìn)行破壞，使細(xì)胞失去了保護(hù)作用而死亡。本研究為提高釀酒酵母酸類物質(zhì)耐受性的方法提供了理論依據(jù)。