藍(lán)圓鲹肝臟酯酶的分離純化與性質(zhì)分析

孫樂常，文嘉欣，杜 瀚，林怡晨，劉光明，曹敏杰,*

（1.集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.水產(chǎn)品深加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程中心，福建 廈門 361021；3.大連工業(yè)大學(xué) 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034）

酯酶（EC 3.1.1.1）是一類具有催化水解酯鍵能力的水解酶，它能夠參與包括酯化反應(yīng)、轉(zhuǎn)酯反應(yīng)以及對光活性物質(zhì)進行動力學(xué)拆分等多種反應(yīng)[1]，其催化底物和催化特性與脂肪酶（EC3.1.1.3）相似。酯酶通常水解水溶性酯，如短鏈脂肪酸甘油三酯，一般酯酶催化水解短鏈（＜C10）甘油酯，而脂肪酶優(yōu)先水解以長鏈脂肪酸（＞C12）構(gòu)成的甘油三酯[2]。在動物體內(nèi)，脂肪酶與酯酶參與機體中脂質(zhì)的運輸與代謝，如催化脂肪酰甘油、脂肪酰肉毒膽堿與脂酰CoA酯的水解，以及生物信號分子的跨膜轉(zhuǎn)運、保持生物膜的功能完整性等[3]。由于能催化多種酯類底物水解，且催化特異性高，近年來，酯酶被廣泛應(yīng)用于手性藥物分離篩選、藥物合成、脂精煉以及食品風(fēng)味控制等諸多行業(yè)領(lǐng)域[4-5]。另一方面，魚內(nèi)臟中不僅富含蛋白質(zhì)資源，還含有大量高附加值的魚油以及ω-3系多不飽和脂肪酸[6]。這些高豐度的多不飽和脂肪酸被認(rèn)為是海洋魚類在進食了藻類或浮游植物后在體內(nèi)富集而形成的，而魚肝臟中酯酶與脂肪酶在這過程中起到至關(guān)重要的作用[7-9]。

迄今為止，國外關(guān)于海洋動物內(nèi)臟中脂肪酶的報道僅見于太平洋磷蝦（Euphausia superba）[7]、海鱸魚（Lates calcarifer）[8]、太平洋藍(lán)鰭金槍魚（Thunnus orientalis）[9]、沙丁魚（Sardinella aurita）[10]、海螺（Hexaplex trunculus）[11]、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）[12]、海蟹（Carcinus mediterraneus）[13]、王鮭（Oncorhynchus tshawytscha）與新西蘭鱈魚（Macruronus novaezelandiae）[14]。目前，關(guān)于酯酶的研究大多集中于在微生物來源[15]，相比之下，動物源的酯酶，特別是海洋動物來源的酯酶的相關(guān)分離純化與性質(zhì)研究尤為少見。而對于水產(chǎn)動物酯酶，僅見于Smichi等[16]對灰鯔魚的研究。

藍(lán)圓鲹（Decapterus maruadsi）是我國重要的低值海洋經(jīng)濟魚類之一，其價格低廉、味道鮮美、營養(yǎng)豐富，深受消費者的喜愛。據(jù)統(tǒng)計，2019年藍(lán)圓鲹全國捕撈總量達(dá)44.87萬 t，其中福建捕撈量為21.37萬 t，居全國首位[17]，具有巨大的開發(fā)價值。本研究擬以藍(lán)圓鲹為對象，從其肝臟中分離純化天然酯酶，并對其性質(zhì)進行分析，旨在為海水魚內(nèi)臟中酯酶的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮藍(lán)圓鲹由廈門高崎水產(chǎn)批發(fā)市場購得，平均質(zhì)量約150 g/尾，置于碎冰中，運回實驗室后，立即用剪刀小心從魚肛門處向頭部方向剪開魚肚，并分選出肝臟備用。

Q-Sepharose、Q-HP、Phenyl Fast Flow、Superdex G75美國GE Healthcare公司；脂肪酸對硝基苯酚酯底物、對硝基苯酚、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine，TEMED） 美國Sigma公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白 美國Thermal公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS，電泳純）、丙烯酰胺美國Bio-Rad公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UPC900 AKTA蛋白層析系統(tǒng) 美國GE公司；5800 MALDI-TOF/TOF串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀 美國AB SCIEX公司；ND-1000紫外-可見分光光度計 美國NanoDrop公司；Avanti JA-25高速冷凍離心機、pH計美國Beckman公司；759s紫外-可見分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司；垂直電泳系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 酶活性測定

藍(lán)圓鲹肝臟酯酶活性測定參考Chen Chengcheng等[15]方法并適當(dāng)修改。以4-丁酸對硝基苯酚酯（p-nitrophenyl butyrate，p-NPB）為底物，取50 μL樣品液加入900 μL預(yù)熱至37 ℃的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）中，充分混勻后加入50 μL的5 mmol/Lp-NPB溶液，并繼續(xù)在37 ℃條件下孵育10 min，隨后立即用冰水冷卻終止反應(yīng)并測定其在410 nm波長處的吸光度。其酯酶活性單位（U）定義為每分鐘分解p-NPB并釋放1 μmol對硝基苯酚所需的酶量。

藍(lán)圓鲹肝臟脂肪酶活性測定參考Kurtovic等[14]方法并適當(dāng)修改。以4-棕櫚酸對硝基苯酯（4-nitrophenyl palmitate，p-NPP）為底物，取50 μL的樣品液加入900 μL預(yù)熱至37 ℃的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0，含20 mmol/L CaCl2、5 mmol/L膽酸鈉、0.01%阿拉伯膠）中，充分混勻后加入50 μL的5 mmol/Lp-NPP溶液，并繼續(xù)在37 ℃條件下孵育10 min，隨后立即用冰水冷卻終止反應(yīng)并測定其在410 nm波長處的吸光度。其脂肪酶活性單位（U）定義為每分鐘分解p-NPP并釋放1 μmol對硝基苯酚所需的酶量。

1.3.2 藍(lán)圓鲹肝臟酯酶的分離純化

參考Smichi等[16]方法并適當(dāng)修改，純化過程均在4 ℃環(huán)境下進行。取100 g新鮮肝臟加入4 倍體積的20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0冰緩沖液（緩沖液A），充分組織搗碎后，12 000×g離心20 min，上清液用4 層絹布過濾去除漂浮在液面的油脂與變性蛋白，得到粗酶液樣品。得到的粗酶液進行40%～60%的(NH4)2SO4鹽析，離心后收集沉淀部分用少量緩沖液A充分溶解后，用相同緩沖液透析48 h。透析后的樣品，上樣于DEAE-Sepharose陰離子交換層析柱（2.5 cm×15 cm），用含0～1.0 mol/L NaCl溶液（緩沖液A）進行線性洗脫，收集活性峰組分，在緩沖液A透析48 h。透析充分后的樣品上樣于Q-HP（1 mL）陰離子交換層析柱，用含0～1 mol/L NaCl的緩沖液A進行線性洗脫，收集活性峰部分，用含2 mol/L (NH4)2SO4的20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0（緩沖液B）透析過夜。透析充分后的樣品上樣于Phenyl Fast Flow（1 mL）疏水層析柱，用含2.0～0.0 mol/L (NH4)2SO4的20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0緩沖液進行線性洗脫，收集活性峰組分，用10 kDa超濾膜置換緩沖液成含0.15 mol/L NaCl的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.4）中并進一步濃縮。濃縮后的組分上樣于預(yù)先用含0.15 mol/L NaCl的50 mmol/L PBS （pH 7.4）平衡的Superdex G75凝膠過濾柱層析，收集活性峰部分即為高度純化的酯酶。

1.3.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

參照Laemmli[18]的方法，并適當(dāng)改動。配制的SDSPAGE凝膠為12%分離膠和5%濃縮膠。電泳結(jié)束后，凝膠參照Marshak等[19]方法進行質(zhì)譜銀染色。

1.3.4 肽指紋圖譜鑒定純化酯酶

將純化的酯酶上樣于12%聚丙烯酰胺凝膠，電泳結(jié)束后，進行質(zhì)譜銀染色，再小心將目的蛋白條帶切下。將樣品使用胰蛋白酶酶解處理后，使用串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀進行測試分析，設(shè)置激光源為Nd:YAG 激光器（波長335 nm），加速電壓為2 kV，掃描范圍為800～4 000 u，采用正離子模式和自動獲取數(shù)據(jù)的模式采集數(shù)據(jù)。其中，一級質(zhì)譜中選擇信噪比大于50的母離子進行二級質(zhì)譜分析，二級質(zhì)譜激光累計疊加2 500 次。 質(zhì)譜結(jié)果用Mascot 2.2軟件在NCBI數(shù)據(jù)庫檢索，最后得到鑒定的蛋白質(zhì)結(jié)果，根據(jù)Mascot 2.2標(biāo)準(zhǔn)（P＜0.05）對目的蛋白進行評分。

1.3.5 藍(lán)圓鲹肝臟酯酶的性質(zhì)分析

1.3.5.1 藍(lán)圓鲹肝臟酯酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性

在不同溫度（10、20 、30、40、50、60、70 ℃）條件下，以p-NPB為底物測定酯酶活性。以最高酶活性為100%，計算其他溫度下的相對酶活性，考察酯酶的最適溫度。

將藍(lán)圓鲹肝臟酯酶在不同溫度（30、40、50、55、60 ℃）條件下放置0.5 h后，在37 ℃、pH 8.0條件下以p-NPB為底物測定酯酶活性。以最高酶活性（4 ℃放置）為100%，計算其他溫度下的相對酶活性，考察酯酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.5.2 藍(lán)圓鲹肝臟酯酶的最適pH值及pH值穩(wěn)定性

在不同pH值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0）條件下，以p-NPB為底物測定酯酶活性。以最高酶活性為100%，計算其他pH值條件下的相對酶活性，考察酯酶的最適pH值。

將藍(lán)圓鲹肝臟酯酶在不同pH值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0）條件下放置0.5 h后，在37 ℃、pH 8.0條件下以p-NPB為底物測定酯酶活性。以最高酶活性為100%，計算其他pH值下的相對酶活性，考察酯酶的pH值穩(wěn)定性。

各pH值所用緩沖液：pH 3.0～5.0為20 mmol/L HAc-NaAc緩沖液，pH 6.0為20 mmol/L PBS，pH 7.0～9.0為20 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH 10.0為20 mmol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液，pH 11.0～12.0為20 mmol/L NaHCO3-NaOH緩沖液。

1.3.5.3 金屬離子對藍(lán)圓鲹肝臟酯酶活性的影響

在20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液中分別加入終濃度為5 mmol/L的 BaCl2、CaCl2、ZnCl2、MnCl2、CuCl2、KCl、NaCl、MgCl2、AlCl3、CoCl2、FeCl2，在37 ℃、pH 8.0條件下以p-NPB為底物測定酯酶活性。

1.3.5.4 Na＋對藍(lán)圓鲹肝臟酯酶活性的影響

在20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液中分別加入NaCl至終濃度為0.005、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mol/L。在37 ℃、pH 8.0條件下以p-NPB為底物測定酯酶活性。

1.3.5.5 表面活性劑及有機溶劑對藍(lán)圓鲹肝臟酯酶活性的影響

分別將50 μL 2%和20%的甲醇、乙醇、丙酮、異丙醇、SDS、TritonX-100、Tween 20與50 μL純化后的樣品混勻，使其終體積分?jǐn)?shù)分別為1%和10%，在4 ℃條件下孵育0.5 h，再從中取50 μL以p-NPB為底物，測定酯酶活性。其中，酶活性測定條件均為pH 8.0和37 ℃。

1.3.5.6 SDS對藍(lán)圓鲹肝臟酯酶活性的影響

向純化后樣品中添加不同含量SDS使其終質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、0.1%、0.5%、1%、2%，混勻，4 ℃孵育0.5 h后，取50 μL以p-NPB為底物，測定酯酶活性。其中，測定條件均為pH 8.0和37 ℃。

1.3.5.7 藍(lán)圓鲹肝臟酯酶的底物特異性

為了確定目的酯酶是否具有脂肪酶的功能，將酯酶在pH 8.0和37 ℃的相同條件下，分別采用脂酶和脂肪酶活力測定方法測定其催化不同底物（C鏈長度的差別）水解的酶活性變化確定其底物特異性。選用的不同底物為4-硝基乙酸酯（4-nitrophenyl acetic，p-NPA）、p-NPB、4-硝基苯基癸酸酯（4-nitrophenyl decanoate，p-NPD）、p-NPP，它們分別是C2、C4、C10、C16的脂肪酸酯。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有的實驗均至少重復(fù)3 次以上，用Excel軟件進行數(shù)據(jù)錄入和圖表制作，用IBM SPSS Statistics 21進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)圓鲹肝臟酯酶的分離純化與鑒定

藍(lán)圓鲹肝臟粗酶液經(jīng)過40%～60% (NH4)2SO4鹽析后上樣于Q-Sepharose陰離子交換層析柱。如圖1A所示，在0～1.0 mol/L NaCl線性洗脫過程中，出現(xiàn)2 個較高的酯酶活性峰，收集酶活性較高而蛋白含量較低的第2個酶活性峰組分（133～143管）。將活性峰用緩沖液A透析后上樣于Q-HP陰離子交換層析預(yù)裝柱，如圖1B所示，目的蛋白在NaCl濃度約0.5 mol/L下被洗脫（31～37管）。將其收集后用緩沖液B透析后上樣于Phenyl Fast Flow疏水層析預(yù)裝柱。如圖1C所示，大量的雜蛋白在(NH4)2SO4濃度約為0.8 mol/L之前被洗脫下來，而目的蛋白在(NH4)2SO4濃度約0.5 mol/L被洗脫下來。收集的活性組分最終通過Superdex G75凝膠過濾層析柱得到純化（圖1D）。由表1可知，經(jīng)40%～60% (NH4)2SO4分級沉淀、Q-Sepharose、Q-HP、Phenyl Fast Flow和Superdex G75后獲得了高純度的酯酶，最終的純化倍數(shù)為1 150，回收率為0.69%。

圖1 藍(lán)圓鲹肝臟酯酶分離純化柱層析圖Fig. 1 Chromatographic patterns for the purification of esterase from liver of blue round scads

表1 藍(lán)圓鲹肝臟酯酶的純化Table 1 Summary of the purification steps of esterase from liver of blue round scads

通過銀染結(jié)果（圖2A）可知，純化的蛋白在還原與非還原條件均顯示分子質(zhì)量為61.18 kDa的單一條帶，說明該酶不存在二聚體。該結(jié)果與Superdex G75凝膠過濾層析后對照標(biāo)準(zhǔn)蛋白所測算的分子質(zhì)量一致（圖2B），也與其他來源酯酶的分子質(zhì)量相近，如：雞肝酯酶的分子質(zhì)量為63 kDa和58 kDa[20]，灰鯔魚（Mugil auratus）內(nèi)臟酯酶的分子質(zhì)量為55 kDa[16]。然而，本實驗得到的酯酶分子質(zhì)量與微生物來源的酯酶存在較大差異，如：曲霉（Aspergillus westerdijkiae）的酯酶分子質(zhì)量為32 kDa[21]，革蘭氏陽性鏈霉菌（Streptomyces lividansTK64）的酯酶分子質(zhì)量為31.43 kDa[22]，伊麗莎白菌（Elizabethkingiasp.）中的酯酶TT1分子質(zhì)量為103 kDa[5]。對純化得到的蛋白進行蛋白質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜的肽指紋圖譜鑒定，得到一條含14 個氨基酸殘基的肽段（LAAPQPVEGWEGVR），檢測m/z為1 508.858 3。在NCBInr數(shù)據(jù)庫中進行序列比對，發(fā)現(xiàn)其與紅鰭東方鲀假定脂酰輔酶A水解酶（序列號：XP_003967349.2 ）一致，進一步表明純化的酶為一種新型酯酶。實驗中酯酶鑒定匹配的多肽數(shù)量較少可能是由于目前數(shù)據(jù)庫中缺乏足夠的魚類內(nèi)臟酯酶的蛋白一級序列數(shù)據(jù)。

圖2 純化酯酶的SDS-PAGE分析（A）、Superdex G75分子質(zhì)量測定（B）和肽指紋圖譜（C）Fig. 2 SDS-PAGE analysis (A), determination of molecular mass by Superdex G75 column chromatography (B) and peptide mass fingerprinting (C) of esterase from liver of blue round scads

2.2 藍(lán)圓鲹酯酶的性質(zhì)

2.2.1 溫度和pH值對酯酶活性的影響

如圖3A所示，藍(lán)圓鲹肝臟酯酶的最適溫度為50 ℃，在30～60 ℃有較強的活性，當(dāng)溫度上升至70 ℃，酯酶活性明顯降低。該酶在4～40 ℃之間有較高的穩(wěn)定性，隨著溫度升高，酶穩(wěn)定性降低，當(dāng)溫度上升到60 ℃后，只保留約30%的酶活性，這與灰鯔魚內(nèi)臟酯酶[16]、蘇門答臘青霉（Penicillium sumatrense）堿性阿魏酰酯酶[23]、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereusWZZ006）中嗜熱性酯酶[24]以及海鱸魚（Lates calcarifer）肝臟中的脂肪酶[8]相似。而Zhang Yinjun等[4]從芽孢桿菌（Bacillus aryabhattaiB8W22）中分離得到一種新型酯酶，其最適溫度僅為30 ℃。Castro等[21]從曲霉（Aspergillus westerdijkiae）中純化得到一種新型酯酶，其最適溫度則為40 ℃。由此可見，魚和微生物的酯酶在不同溫度下的活性可能與其生理活動特性相關(guān)。

如圖3B所示，藍(lán)圓鲹肝臟酯酶的最適pH值為8.0，在7.0～8.0有較強的活性，當(dāng)pH值超過9.0時，酶活性快速下降，并在pH 10.0時完全失活。該酶在pH值在6.0～10.0之間具有較高的穩(wěn)定性，在酸性環(huán)境下不穩(wěn)定，在pH 4.0時，該酶活性完全喪失。相比之下，在堿性條件下較穩(wěn)定，當(dāng)pH值達(dá)到11.0時，依然能保留50%以上的活力。這與灰鯔魚[16]、西葫蘆（Cucurbita pepo）[25]以及微生物來源的酯酶[15]相似。酯酶的催化位點通常存在Gly-X-Ser-XGly保守序列，其活性中心由Ser/Cys/Asp-His-Asp/Glu組成的催化三聯(lián)體構(gòu)成，而中性偏弱堿性的pH值環(huán)境更有利于催化三聯(lián)體形成電荷中繼網(wǎng)，使Ser殘基上的—OH表現(xiàn)出親核特性，進而攻擊底物的酯鍵[21,26]。

圖3 溫度和pH值對藍(lán)圓鲹肝臟酯酶活性的影響Fig. 3 Effects of temperature and pH on the activity of esterase from liver of blue round scads

2.2.2 金屬離子和Na＋對酯酶活性的影響

如圖4A所示，金屬離子Al3＋、K＋、Zn2＋、Fe2＋和Cu2＋會使酯酶活性顯著下降，其中Fe2＋和Cu2＋對該酶有強烈抑制作用。Mn2＋、Ba2＋、Ca2＋、Co2＋和Mg2＋則會促進酶的活性，其中Mn2＋對酶的激活作用最強，而Mg2＋和Co2＋對酶活性的影響較小。二價金屬離子對酯酶活性影響的內(nèi)在機制復(fù)雜，其抑制作用可能是由于部分二價金屬離子會優(yōu)先結(jié)合到酶的活性中心，進而影響酶與底物的結(jié)合與催化[22]。本實驗Ca2＋對酯酶活性的激活作用與西葫蘆酯酶[25]以及灰鯔魚內(nèi)臟脂肪酶[27]類似，這可能是由于Ca2＋不僅能穩(wěn)持酯酶空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，還能與Gly-X-Ser-X-Gly相結(jié)合，進而增強Ser殘基—OH基團的親核活性[22,26]。而Wang Baojuan等[22]發(fā)現(xiàn)Ca2＋對革蘭氏陽性霉菌TK64酯酶沒有激活作用，可能是因為該酶的氨基酸序列中沒有Ca2＋的結(jié)合位點。

為評估酯酶在食品加工中的潛在應(yīng)用前景，探究了不同濃度Na＋對酯酶活性的影響。如圖4B所示，在0～2 mol/L范圍內(nèi)，不同濃度Na＋對酯酶活性都具有促進作用，在0.02～0.5 mol/L范圍內(nèi)，Na＋對酯酶活性具有較強的促進作用，在濃度為0.2 mol/L時促進作用最顯著，為空白對照的1.9 倍。這可能是因為Na＋改變了溶液的極性，促進了底物與酶活性中心的相互作用，從而使酶活性升高，而高濃度Na＋會使酶發(fā)生鹽析作用，使酶活性降低[16]。

圖4 不同金屬離子（A）和Na＋（B）對酯酶活性的影響Fig. 4 Effects of metal ions (A) and sodium chloride (B) on the activity of esterase from liver of blue round scads

2.2.3 表面活性劑和有機溶劑對酯酶活性的影響

如圖5A所示，當(dāng)用量為1%時，4 種有機溶劑對酯酶活性幾乎沒有影響，而用量為10%時，4 種有機溶劑對酯酶活性都起到了不同程度的促進作用，其中，丙酮的促進作用較小。值得注意的是，王潔[28]研究發(fā)現(xiàn)乙醇和異丙醇會使豬腦乙酰膽堿酯酶活性降低。這類現(xiàn)象被認(rèn)為是由于水溶性有機溶劑能將水從酯酶中剝離，導(dǎo)致蛋白分子的展開，其內(nèi)部的疏水殘基發(fā)生暴露，進而使酶發(fā)生了變性失活[29]。而本實驗有機溶劑對酶具有激活作用，可能是因為適量的有機溶劑導(dǎo)致酶蛋白空間結(jié)構(gòu)展開反而促進了底物與活性中心的結(jié)合，從而提高了酶活性[30]。

表面活性劑經(jīng)常用于酶的純化和表征，它們能通過破壞酶的三級結(jié)構(gòu)而引起酶變性，也能防止酶的聚集，從而提高酶活性。因此，在純化過程中，表面活性劑的選擇都是至關(guān)重要的。非離子型的表面活性劑曲拉通和吐溫20對酯酶活性有較強的抑制作用，其用量越高，抑制作用越強。與吐溫20相比，曲拉通對酯酶的抑制作用更強，這可能是因為曲拉通的親水性更低，導(dǎo)致與酶的親和性更差[30]。相比之下，曲拉通對芽孢桿菌中的酯酶具有激活作用[4]，這也說明藍(lán)圓鲹酯酶與芽孢桿菌酯酶的催化機制不同。另一方面，陰離子表面活性劑SDS對酯酶活性有極強的抑制作用，在1%和10%條件下都使酯酶完全失活。進一步探究不同濃度SDS對酯酶活性的影響，結(jié)果如圖5B所示，當(dāng)SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%時就使酯酶完全失活，這可能是SDS能夠使酯酶中的氫鍵和疏水鍵被破壞從而使其空間構(gòu)象發(fā)生改變從而使酯酶失活[28]。

圖5 表面活性劑、有機溶劑（A）和SDS（B）對酯酶活性的影響Fig. 5 Effects of surfactants, organic solvents (A) and SDS (B) on the activity of esterase from liver of blue round scads

2.2.4 酯酶的底物特異性

酯酶的底物特異性是指酯酶在水解不同脂肪酸（不同長度碳鏈）時表現(xiàn)的特殊反應(yīng)性[31]，一般來說，酯酶對短鏈脂肪酸（＜C10）表現(xiàn)出優(yōu)先活性，而脂肪酶催化水解和合成不溶于水的長鏈脂肪酸（＞C10）[26]。如表2所示，藍(lán)圓鲹肝臟酯酶在水溶液中對短鏈脂肪酸的特異性較高，隨著底物碳鏈的增長，其水解能力有所下降。該酶在水溶液中對p-NPA（C2）的水解活性最高，其次是p-NPB（C4），其相對酶活性接近90%，而該酶在水溶液中對p-NPD（C10）和p-NPP（C16）脂肪酸的水解作用微弱。而在乳化體系中，酯酶對p-NPD（C10）和p-NPP（C16）也有較高的水解能力，相對酶活性達(dá)到70%以上。以上結(jié)果說明，純化的酶為一種新型酯酶，在界面活化后同時擁有酯酶和脂肪酶的功能，具有較大的應(yīng)用價值。

表2 酯酶的底物特異性Table 2 Substrate specificity of esterase from liver of blue round scads

3 結(jié) 論

通過色譜分離從藍(lán)圓鲹肝臟中分離純化出一種新型酯酶，分子質(zhì)量約為60 kDa，最適溫度和最適pH值分別為50 ℃和8.0，高溫和酸性條件下不穩(wěn)定，對有機試劑和鹽的耐受性高。Zn2＋、Cu2＋和Fe2＋會使酯酶活性顯著下降，而Ba2＋、Ca2＋和Mn2＋能顯著提高酶活性。該酶在乳化體系中，對短鏈和長鏈酯都具有較強的水解能力，同時具備酯酶與脂肪酶活性。