數(shù)字序列分析對(duì)兩種大蒜總氨基酸測(cè)定方法結(jié)果間的相關(guān)性研究

擺富葉，張婷婷，劉睿婷,2，李蘭蘭，李喬喬，安澤沖，王 巖，李新霞

（1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011；2新疆大蒜藥用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830013）

大蒜（Allium SativumL.）為百合科或蔥科蔥屬植物蒜的地下鱗莖，富含多種氨基酸[1-2]，具有抗氧化[3-4]，保護(hù)肝臟、降低血小板凝集[5]、增強(qiáng)免疫力[6]、抗輻射[7]、抗炎[8-9]、抗腫瘤[10-11]等功效，多用于抗腫瘤治療，其中的精氨酸還具有免疫調(diào)節(jié)及抗氧化功能[12-15]。目前測(cè)定氨基酸的方法主要有光譜法、色譜法和氨基酸分析儀直接分析法[16-17]。光譜法采用茚三酮顯色法測(cè)總氨基酸，其原理是茚三酮將α-氨基酸氧化成亞氨基后水解成氨與還原的茚三酮和茚三酮之間發(fā)生縮合，產(chǎn)生藍(lán)紫色產(chǎn)物，根據(jù)這個(gè)有色反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行可見光譜法定量。在植物中有多種氨基酸，根據(jù)反應(yīng)原理采用一個(gè)氨基酸對(duì)照品為替代，以它計(jì)總氨基酸含量是一個(gè)經(jīng)典的方法，它的優(yōu)點(diǎn)是快速、節(jié)省對(duì)照品，方法的穩(wěn)定性好，易于操作，適用于大樣本量對(duì)總氨基酸含量數(shù)據(jù)有需求的分析測(cè)定。色譜法常采用柱前衍生化，異硫氰酸苯酯（Phenyl isothiocyanate，PITC）為柱前衍生氨基酸分析常用試劑，該法可以測(cè)定每一種氨基酸的具體含量，但操作冗長(zhǎng)，檢測(cè)成本較高。氨基酸分析儀只能測(cè)定18種已有對(duì)照品的氨基酸，但特殊氨基酸，如蒜氨酸不包括在內(nèi)，且儀器價(jià)格相對(duì)昂貴。數(shù)字序列相關(guān)性分析法[18]是判斷兩個(gè)序列是否具有線性或擬線性關(guān)系的方法。本研究采用茚三酮顯色-可見分光光度法（茚三酮顯色-Vis 法）和PITC 衍生化-HPLC 法（HPLC 法）分別測(cè)定大蒜總氨基酸的含量，采用數(shù)字序列相關(guān)分析法分析兩種測(cè)定方法間的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器LC-2030C 3D Plus 高效液相色譜儀（日本島津公司）；UV2550 紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；AB135-S分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 試劑對(duì)照品：天冬氨酸（百靈威，批號(hào)L660Q23），谷氨酸（百靈威，批號(hào)LQ80Q22），絲氨酸（百靈威，批號(hào)LD10Q112），甘氨酸（百靈威，批號(hào)L6C0Q29），組氨酸（百靈威，批號(hào)L650Q40），精氨酸（百靈威，批號(hào)L280Q27），蘇氨酸（百靈威，批號(hào)LB50P24），丙氨酸（百靈威，批號(hào)LR40Q23），酪氨酸（百靈威，批號(hào)LT60Q16），纈氨酸（百靈威，批號(hào)L330Q56），苯丙氨酸（百靈威，批號(hào)LG50Q57），蛋氨酸（百靈威，批號(hào)LK70Q23），賴氨酸（百靈威，批號(hào)LR60Q15），天冬酰胺（百靈威，批號(hào)L280Q59），脯氨酸（百靈威，批號(hào)LE30Q108），亮氨酸（百靈威，批號(hào)L210Q38），色氨酸（百靈威，批號(hào)LL90Q74），S-烯丙基-L-半胱氨酸（東京化成，批號(hào)J4ZFO-JK），S-甲基-L-半胱氨酸（東京化成，批號(hào)KNGB J-I C），蒜氨酸（新疆埃樂欣，批號(hào)AL160526），正己烷（天津天新，批號(hào)20180710），茚三酮（中國(guó)醫(yī)藥，批號(hào)20040318），磷酸二氫鉀（天津致遠(yuǎn)，批號(hào)2019062059），三乙胺（天津光復(fù)，批號(hào)20110509），磷酸氫二鈉（天津致遠(yuǎn)，批號(hào)201907205），異硫氰酸苯酯（百靈威，批號(hào)T7530），乙酸鈉（天津福晨，批號(hào)20140804），冰醋酸（天津富宇，批號(hào)20120911），乙腈（美國(guó)Sigma）、甲醇（美國(guó)Sigma）。

1.3 藥材大蒜于2021年8月-9月購(gòu)買自11個(gè)產(chǎn)地（1-托克遜鄉(xiāng)十大隊(duì)秋播大蒜、2-康其鄉(xiāng)大蒜、3-黑英山五大隊(duì)大蒜、4-托克遜鄉(xiāng)九村秋播大蒜、5-托克遜鄉(xiāng)十大隊(duì)春播大蒜、6-托克遜鄉(xiāng)九村春播大蒜、7-察合哥鎮(zhèn)四大隊(duì)秋蒜、8-托克遜鄉(xiāng)一村春播大蒜、9-托克遜鄉(xiāng)一村秋播大蒜、10-大橋鄉(xiāng)五村大蒜、11-察合哥鎮(zhèn)四大隊(duì)春蒜）；大蒜粉于2018 年10 月24 日購(gòu)買自23個(gè)產(chǎn)地（12-甘肅武威（紫皮蒜）、13-青海西寧（獨(dú)頭蒜）、14-河南、15-青海西寧（白蒜）、16-山東（巴里坤種植）、17-甘肅武威（獨(dú)頭蒜）、18-青海西寧（紅蒜）、19-新疆拜城縣、20-新疆昭蘇、21-山東（紫皮蒜）、22-李寨三社、23-新疆且末（大蒜）、24-新疆巴里坤（第一批次）、25-新疆且末（高原香蒜）、26-新疆且末（香蒜）、27-名聯(lián)十二社、28-甘肅酒泉（第一批次）、29-新疆塔城、30-新疆巴里坤（第二批次）、31-新疆三棵樹（第四批次）、32-新疆吉木薩爾、33-甘肅酒泉（第二批次）、34-甘肅民樂），經(jīng)冷凍干燥后獲得大蒜的凍干粉。

2 方法與結(jié)果

2.1 茚三酮顯色-Vis法測(cè)定大蒜總氨基酸的含量

2.1.1 溶液的配制 磷酸鹽緩沖液的配制(pH8.0)：取0.9 %磷酸二氫鉀溶液10 mL 加入2.4 %磷酸氫二鈉溶液190 mL混勻即得。2%茚三酮溶液的配制：稱取2.0 g 茚三酮置于錐形瓶，加入70 mL 蒸餾水溶解，加入氯化亞錫80 mg，過濾，蒸餾水定容至100 mL，備用。氨基酸對(duì)照品溶液的配制：稱定精氨酸對(duì)照品0.1 g 置于50 mL 量瓶中，用蒸餾水溶解并定容至刻度，搖勻，即得（每1 mL中約含精氨酸2.0 mg）。

2.1.2 供試品溶液制備 大蒜經(jīng)凍干粉碎獲得蒜粉，稱取大蒜粉0.5 g 置于50 mL 量瓶中，加5 mL 甲醇超聲10 min，加水定容至刻度，搖勻，離心，取上清液備用。稱取大蒜100 g 于500 mL 的燒杯，加水200 mL煮沸10 min，勻漿，轉(zhuǎn)移至500 mL 容量瓶，加水定容至刻度，離心，取上清備用。

2.1.3 實(shí)驗(yàn)方法 量取1.0 mL 供試品或?qū)φ掌啡芤?，置?0 mL 具塞試管中，加磷酸鹽緩沖液（pH8.0）至5.0 mL，加1.0 mL 2%茚三酮溶液，80℃水浴30 min，放置室溫，加水至16.0 mL。以相應(yīng)的試劑為空白，測(cè)定567 nm處的吸光度。

2.1.4 回歸方程的建立 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求量取精氨酸對(duì)照品溶液0、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 和2.0 mL，分別置20 mL 具塞試管中，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，以濃度和吸光度分別為橫縱坐標(biāo)，建立回歸方程：Y=0.004 2X-0.640 1，r=0.999 5。結(jié)果表 明，在200.00～400.00 μg/mL范圍內(nèi)氨基酸的質(zhì)量濃度與吸光度線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度實(shí)驗(yàn) 量取供試品溶液6 份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作，結(jié)果精密度RSD＜2%。

2.1.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作，每隔5 min 測(cè)定1 次已反應(yīng)完畢的供試品溶液，連續(xù)測(cè)定45 min。結(jié)果表明，在45 min 內(nèi)氨基酸與茚三酮反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度穩(wěn)定。

2.1.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 按1:1 加入精氨酸對(duì)照溶液（0.3 mg/mL）于供試品溶液(5.002 mg/mL)（n=6）中，按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作，結(jié)果顯示加樣回收率在95.0%～105.0%范圍內(nèi)，RSD＜2.0%。

2.1.8 含量測(cè)定分別稱取31 批不同批號(hào)的大蒜樣品（n=3），按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定567 nm 處吸光度，以精氨酸計(jì)大蒜總氨基酸含量，見表1。

表1 茚三酮顯色-Vis法和HPLC法測(cè)定31批大蒜總氨基酸含量及數(shù)據(jù)變換結(jié)果

2.2 HPLC法測(cè)定大蒜總氨基酸的含量

2.2.1 溶液的配制 對(duì)照品溶液的配制：稱取適量各氨基酸對(duì)照品，加水溶解并稀釋至所需濃度（天冬氨酸：151.44 μg/mL，谷氨酸：146.76 μg/mL，絲氨酸：82.08 μg/mL，甘氨酸：80.96 μg/mL，組氨酸：78.56 μg/mL，精氨酸：1002.14 μg/mL，蘇氨酸：161.04 μg/mL，丙氨酸：159.88 μg/mL，脯氨酸：161.52 μg/mL，酪氨酸：80.44 μg/mL，纈氨酸：149.12 μg/mL，蛋氨酸：131.56 μg/mL，亮氨酸：80.36 μg/mL，苯丙氨酸：148.40 μg/mL，色氨酸：79.52 μg/mL，賴氨酸：151.72 μg/mL，S-烯丙基-L-半胱氨酸：98.28 μg/mL，S-甲基-L-半胱氨酸：80.72 μg/mL，天冬酰胺：98.80 μg/mL），備用。蒜氨酸對(duì)照品溶液的配制：稱取蒜氨酸對(duì)照品適量，用50%甲醇配制成濃度為368 μg/mL的溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的配制 鮮蒜經(jīng)凍干得蒜粉，取各產(chǎn)地蒜粉100 mg 置于10 mL 容量瓶中，加5 mL 甲醇超聲10 min，用水定容至刻度，即得。大蒜供試品溶液配制見“2.1.2”。

2.2.3 色譜條件 色譜柱：日本島津VP-ODS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相A：pH6.5 乙酸鈉溶液（1 000 mL-乙腈70 mL）；流動(dòng)相B：甲醇-乙腈-水(20∶60∶20)，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，流速1.0 mL/min，柱溫35℃，進(jìn)樣量10 μL，按流動(dòng)相A：0～5 min，98%；5～6 min，95%；6～14 min，91%；14～18 min，79%；18～32 min，55%；32～34 min，45%；34～38 min，0%，程序洗脫，見圖1。

圖1 20種氨基酸對(duì)照品HPLC色譜圖

2.2.4 含量測(cè)定 取供試品溶液，衍生化處理，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以外標(biāo)法對(duì)各氨基酸含量進(jìn)行計(jì)算，各氨基酸含量結(jié)果之和為大蒜總氨基酸含量，結(jié)果見表1。

2.3 建立茚三酮顯色-Vis 法和HPLC 法測(cè)定大蒜總氨基酸相關(guān)性數(shù)學(xué)模型采用數(shù)字序列相關(guān)性分析法建立茚三酮顯色-Vis 法和HPLC 法測(cè)定大蒜總氨基酸結(jié)果是否具有相關(guān)性的數(shù)學(xué)模型，用相關(guān)系數(shù)Cμ1·μ2、r來(lái)判斷。

按不同方法分別計(jì)算相關(guān)系數(shù)得：

式中:Cμ1·μ2，r為相關(guān)系數(shù)，μ1、μ2和x、y 為變量，μ1=xi/maxxi，μ2=yi/maxyi），xi和yi分別是茚三酮顯色-Vis 法和HPLC 法測(cè)定大蒜總氨基酸含量；maxxi和maxyi分別是茚三酮顯色-Vis法和HPLC 法測(cè)定大蒜總氨基酸含量中的最大值，x和y分別是茚三酮顯色-Vis 法和HPLC 法測(cè)定大蒜總氨基酸含量變換結(jié)果。按照Cμ1·μ2相關(guān)程度判定：若|Cμ1·μ2|＜0.5，無(wú)明顯相關(guān)性；若|Cμ1·μ2|≥0.9，有相當(dāng)明顯相關(guān)性。按照r相關(guān)程度判定：若0.7≤|r|＜1，高度相關(guān)；若|r|＜0.4，低度相關(guān)。本研究將茚三酮顯色-Vis 法和HPLC 法兩種方法的測(cè)定數(shù)據(jù)按μ1=xi/maxxi，μ2=yi/maxyi進(jìn)行數(shù)據(jù)變換，見表1。將表1 數(shù)據(jù)按照公式（1）和（2）計(jì)算得：Cμ1·μ2=0.921 7，r=0.932 0，表明測(cè)定大蒜總氨基酸含量所采用的茚三酮顯色-Vis 法和HPLC 法具有“相當(dāng)明顯即高度相關(guān)性”，擬合出線性方程：Y=1.003 3X+2.278 1，r=0.932 0，且P＜0.01，說明相關(guān)性具有顯著性意義，見圖2。

圖2 兩法測(cè)定大蒜總氨基酸含量的回歸曲線

2.4 相關(guān)性數(shù)學(xué)模型的驗(yàn)證隨機(jī)抽取3 批大蒜粉進(jìn)行茚三酮顯色-Vis 法和HPLC 法測(cè)定大蒜總氨基酸含量，所得數(shù)據(jù)用本文建立的相關(guān)性數(shù)學(xué)模型分析，驗(yàn)證相關(guān)性數(shù)學(xué)模型的適用性。結(jié)果表明茚三酮顯色-Vis 法測(cè)得的大蒜粉總氨基酸含量測(cè)算HPLC 法測(cè)得的大蒜粉總氨基酸含量，與HPLC 法測(cè)得的大蒜粉總氨基酸含量的真實(shí)值比較，絕對(duì)值誤差較小，說明該相關(guān)性數(shù)學(xué)模型具有較高的適用性，見表2。

表2 相關(guān)性數(shù)學(xué)模型的驗(yàn)證

3 討論

茚三酮顯色-Vis 法的原理是含有伯氨基的氨基酸經(jīng)茚三酮氧化為游離氨，再與茚三酮及還原性茚三酮縮合成藍(lán)紫色產(chǎn)物，根據(jù)該產(chǎn)物的吸收波長(zhǎng)進(jìn)行定量測(cè)定，因此不論氨基酸是何種結(jié)構(gòu)，只要含有伯氨基，均可定量轉(zhuǎn)化為游離氨，可以反映含有伯氨基的氨基酸總含量。本研究采用20種氨基酸對(duì)其經(jīng)茚三酮氧化后縮合產(chǎn)物的光譜分別進(jìn)行了掃描，對(duì)縮合反應(yīng)條件進(jìn)行了考察，是穩(wěn)定可靠的，故選擇567 nm 為測(cè)定波長(zhǎng)。但無(wú)法檢測(cè)到脯氨酸和天冬酰胺在567 nm 處的最大吸收峰，因脯氨酸是沒有伯氨基的，與茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì)；天冬酰胺則因?yàn)榱硗夂粋€(gè)酰胺基可與茚三酮反應(yīng)，生成棕色產(chǎn)物。因此任選一種含有伯氨基的氨基酸，就可以采用茚三酮顯色-Vis 法對(duì)總氨基酸進(jìn)行含量測(cè)定。本研究以精氨酸為對(duì)照品，是因?yàn)榫彼崤c蒜氨酸占大蒜總氨基酸含量的80%以上，精氨酸約為總氨基酸的49%，而精氨酸與蒜氨酸相比易獲得、更經(jīng)濟(jì)，以精氨酸為對(duì)照品采用茚三酮顯色-Vis 法測(cè)定大蒜總氨基酸是可靠的，缺點(diǎn)是不知道各氨基酸分別是多少。

茚三酮顯色-Vis 法和HPLC 法測(cè)定大蒜總氨基酸結(jié)果通過數(shù)字序列相關(guān)性分析法建立相關(guān)性數(shù)學(xué)模型，并由茚三酮顯色-Vis 法測(cè)得的大蒜總氨基酸結(jié)果預(yù)測(cè)大蒜總氨基酸結(jié)果，驗(yàn)證數(shù)據(jù)的結(jié)果表明結(jié)果是可行的。HPLC 柱前衍生化可以得到每一種氨基酸（只要有對(duì)照品）的含量，相加后就是總氨基酸含量。對(duì)于大蒜來(lái)說，蒜氨酸是特征氨基酸需要采用HPLC 方法獲得含量，課題組已經(jīng)建立了非衍生化的測(cè)定方法，較為簡(jiǎn)便，如果再采用茚三酮顯色-Vis 法結(jié)合數(shù)學(xué)模型獲得總氨基酸含量，就可以評(píng)價(jià)大蒜氨基酸的情況。經(jīng)HPLC 法測(cè)定脯氨酸和天冬酰胺僅占總氨基酸含量的0.57%，是兩種方法誤差的原因之一，但影響不大。

本研究從原理和大批量數(shù)據(jù)測(cè)定結(jié)果及數(shù)學(xué)模型分析均顯示測(cè)定大蒜樣品中總氨基酸含量的茚三酮顯色-Vis 法相對(duì)HPLC 法更快速更經(jīng)濟(jì)，可以結(jié)合蒜氨酸HPLC 法測(cè)定結(jié)果控制和評(píng)價(jià)大蒜樣品原料的質(zhì)量，本研究采用數(shù)字序列相關(guān)性分析評(píng)價(jià)該方法替代HPLC 柱前衍生化法測(cè)定大蒜總氨基酸的可靠性是有意義的。