廖加美，蔡亞玲，彭俊超，王萬林，高月，易瓊，王魯*

(1 貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2 西南特色藥用生物資源開發(fā)利用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550025)

血管內(nèi)皮細胞(VECs) 作為血管腔內(nèi)的一層特化細胞，排列在血管和淋巴管的內(nèi)表面，不僅能形成血管屏障，還能調(diào)節(jié)血管舒縮張力、凝血和血管通透性等[1]，此外，VECs是一種有效的免疫調(diào)節(jié)細胞，可以控制白細胞的遷移，促進或阻礙免疫反應(yīng)[2]。因此，在各種傳染病在內(nèi)的多種病理狀態(tài)的發(fā)病機制中，內(nèi)皮細胞功能障礙(ECD)起著中心作用[3]。一般來說，微生物病原體可以通過直接靶向和損傷內(nèi)皮細胞，或者通過誘導(dǎo)細胞因子反應(yīng)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞激活不受控制，從而導(dǎo)致ECD[4]。病原體誘發(fā)的ECD的病理后果通常是嚴重的，可能包括血管屏障破壞、水腫、血栓形成、消耗性凝血病、出血、先天性免疫反應(yīng)異常和大量炎性細胞募集[5]，這些與ECD相關(guān)的病理模式是一些最致命的微生物疾病的標志，包括病毒性出血熱，甲型流感病毒引起的急性呼吸窘迫綜合癥，惡性瘧原蟲瘧疾和細菌性敗血癥[6]。值得注意的是，雞高致病性禽流感病毒感染也與ECD有關(guān)。目前，關(guān)于VECs作為禽病原體靶點的作用及其在雞傳染性疾病發(fā)病機制中的作用還知之甚少。因此，本文使用LPS誘導(dǎo)雞血管內(nèi)皮細胞(chPAEC)炎癥模型，來進一步研究禽類VECs相關(guān)的炎癥機制。

LPS是革蘭氏陰性菌崩解時被釋放出來的一種內(nèi)毒素，內(nèi)毒素與細胞膜上的CD14結(jié)合激活TLR4[7]，誘導(dǎo)VEC內(nèi)ICAM-1和VCAM-1 的mRNA水平增加，提高 ICAM-1、VCAM-1、IL-6 和 TNF-α的表達，增強 NF-κB活化，使NF-κB轉(zhuǎn)入細胞核，造成TNF-α、IL-6和NO的大量釋放[8]，最終造成了炎性因子風(fēng)爆，引起一系列病理生理變化。TLR4/NF-κB信號通路在血管內(nèi)皮損傷過程中扮演了重要的角色，下調(diào)該通路可起到對血管內(nèi)皮細胞的保護作用[9]。因此，有效干預(yù) TLR4/NF-κB 信號通路對減輕血管內(nèi)皮細胞炎癥導(dǎo)致的血管損傷有極其重要的意義。

在前期研究中發(fā)現(xiàn)艾納香油抗炎活性與左旋芳樟醇((-)-Linalool)和β-石竹烯(BCP)有關(guān)[10]。現(xiàn)代研究表明(-) -Linalool能有效抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細胞以及巴斯德菌介導(dǎo)的肺炎中炎癥因子的表達，抑制NF-κB信號通路激活，增加轉(zhuǎn)錄因子Nrf2信號通路[11]，BCP可抑制血清及組織中的炎癥因子及干擾素γ的mRNA水平，抑制PI3K/AKT/mTOR途徑和ROS介導(dǎo)的MAPKs活化來抑制生長并誘導(dǎo)凋亡[12]，而(-)-Linalool和BCP在chPAEC抗炎作用的研究目前還未報道。因此，本文對(-) -Linalool和BCP對chPAEC抗炎方面進行研究，為艾納香油及其(-)-Linalool和BCP應(yīng)用于家禽炎癥性疾病的防治提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

(-) -Linalool和BCP，均購買于上海優(yōu)寧維科技公司(Absin)；chPAEC，購買于北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司；EA.hy926細胞，購買于昆明細胞庫；1640培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗，美國Gibco公司；脂多糖(型號:O111:B4)，美國Sigma公司；細胞RNA提取試劑盒，北京康為世紀生物科技有限公司；FastQμant cDNA第一鏈合成試劑盒和2×RealStar Green Fast Mixture，購買于GenStar公司；0.25 %胰蛋白酶、MTT、吐溫-80、PBS，北京索萊寶科技有限公司；一氧化氮合酶(iNOS)、前列腺素E2(PGE2)、黏附分子(ICAM-1)、血管內(nèi)皮細胞黏附分子(VCAM-1)、環(huán)氧合酶-2(COX-2)檢測試劑盒武漢基因美生物科技有限公司；細胞蛋白提取試劑購于美國CST生物技術(shù)公司；蛋白濃度測定試劑盒，北京康為世紀生物科技有限公司；兔抗雞NF-κBp65一抗，購于Proteintech公司；一抗鼠抗雞(CD34和β-actin)和二抗(FITC*羊抗鼠IgG、HRP*羊抗兔IgG和HRP*羊抗鼠IgG)，都均購自ImmunoWay Biotechnology Company。其他等試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 chPAEC培養(yǎng)及鑒定

chPAEC采用含100U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素及10% 胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育每24 h換液，待細胞生長至70%～90% 時，0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 chPAEC細胞的鑒定

(1)PCR擴增法:應(yīng)用 TIANamp Genomic DNA Kit (TIAN GEM公司) (硅膠-離心柱型)進行細胞基因組DNA的提取純化，操作步驟按試劑盒說明書進行。取100 ng的基因組 DNA，作為模板 DNA進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系為12 μL:2×DreamTaqTMGreen PCR Master Mix 6 μL，上下游引物各1 μL(見表1)，ddH2O增加至12 μL。PCR反應(yīng)程序為:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變形30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，共30個循環(huán);72 ℃完全延伸 10 min，PCR 擴增完成后，上樣量為6 μL，用1.5%凝膠電泳進行檢測目的條帶，判斷細胞的物種來源。

(2)CD34免疫熒光檢測：細胞爬片后，PBS 洗滌，用4%的多聚甲醛固定30 min；PBS 洗滌；0.1% Triton-100 穿孔2 min，PBS 洗滌,用1%的牛血清白蛋白封閉30 min，加入1%BSA稀釋的CD34(1∶500)一抗，4 ℃孵育過夜，PBS 洗滌；加入1%BSA稀釋的FITC*羊抗鼠IgG二抗(1∶1 000)，37 ℃ 避光孵育1 h，PBS 洗滌；DAPI染色2 min，PBS 洗滌，用抗熒光淬滅封片劑的封片液封片，然后在激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3(-)-Linalool和BCP對chPAEC毒性的測定

將chPAEC以每孔2×105個·mL-1的密度接種96 孔板，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；待細胞長滿后，棄掉孔內(nèi)培養(yǎng)液，(-) -Linalool和BCP分別用DMSO溶解至20 mg·mL-1，-20 ℃保存，給藥時均用細胞培養(yǎng)液稀釋，加入的終濃度分別為0、100、200、300、400、500 μg·mL-1的溶液，加入培養(yǎng)基使終體積為100 μL。孵育24 h 后，每孔加入20 μL的MTT溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h 終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入 150 μL 二甲基亞砜，置于搖床上低速振蕩 10 min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標儀 490 nm 處測OD值。

1.2.4 ELISA檢測(-)-Linalool和BCP對LPS致chPAEC分泌炎性因子及粘附因子的影響

將chPAEC以每孔2×105個·mL-1的密度接種24 孔板，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；待細胞長滿后，實驗設(shè)空白對照組(Contr)，LPS組，LPS +藥物組，其中空白對照組不含LPS和藥物成分，LPS終濃度均為4 μg·mL-1(LPS用PBS溶解至1 mg·mL-1，-20 ℃保存)，藥物的終濃度分別為40、80、120 μg·mL-1，分別設(shè)3個復(fù)孔。給藥12 h后取細胞培養(yǎng)液，3 000 r·min-1離心20 min 取上清液，按ELISA試劑盒說明書進行iNOS、PGE2、VCAM-1、ICAM-1、COX-2含量的測定。

1.2.5 qRT-PCR法檢測(-)-Linalool和BCP對LPS致chPAEC中炎癥因子IL-6和TNF-α及TLR4信號通路相關(guān)因子mRNA表達的影響

將chPAEC以每孔2×105個·mL-1的密度接種6 孔板，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；待細胞長滿后，藥物處理同1.2.4，給藥12 h后棄去培養(yǎng)基，PBS洗2次，根據(jù)試劑盒說明提取細胞的RNA。然后按照GenStar 公司的StarScript II First-strand cDNA Synthesis Mix With gDNA Remover StarScript II cDNA 第一鏈合成預(yù)混試劑(含去基因組)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，進行熒光定量PCR反應(yīng)，引物序列見表2，PCR反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性 15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，經(jīng)40個循環(huán)后，65 ℃延伸5 s，95 ℃延伸5 s，采集樣品信息。以GAPDH作為內(nèi)部標準化參照，采用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達水平。

表2 引物序列及退火溫度

1.2.6 Western-blot檢測(-)-Linalool和BCP對LPS刺激chPAEC中NF-κBp65的影響

將chPAEC以 2×105個·mL-1的密度接種于六孔板中，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，藥物處理同1.2.3，給藥12 h后，吸棄培養(yǎng)基，用 PBS 洗滌2次，加入適量的RIPA 裂解液(使用前以1∶100的比例加入PMSF)，冰上裂解 15 min，然后4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，電泳60 min后轉(zhuǎn)膜。膜用含5%脫脂奶粉的 1×TBST 室溫封閉1.5 h，抗體均用5%脫脂奶粉稀釋，加入稀釋后的NF-κBp65(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000) 一抗，4 ℃孵育過夜，用 1×TBST洗膜 3 次，每次6 min，然后分別用HRP*羊抗兔IgG和HRP*羊抗鼠IgG二抗(1∶10 000) 室溫孵育1 h，用1×TBST洗膜3次，每次6 min，發(fā)光試劑顯色2 min，后進行壓片顯影。以β-actin為內(nèi)參檢測NF-κBp65目的蛋白的表達量。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 chPAEC的鑒定

不同種屬來源的2種細胞進行特異性驗證，見圖1A。

由電泳結(jié)果可知，各引物僅對同源物種的細胞擴增出目的條帶，Mitochondrial DNA基因在chPAEC和雞全血泳道都在197pb出現(xiàn)了清晰條帶，β-globin基因在EA.hy926細胞泳道1 411 pb出現(xiàn)了清晰條帶，而對其他種屬細胞的DNA 模板無擴增條帶；VECs特有CD34 抗原，進行CD34抗體及FITC*羊抗鼠IgG免疫熒光染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，細胞核呈藍色，其胞漿呈特征性綠色熒光，見圖1B。

圖1 chPAEC的鑒定結(jié)果

2.2 (-)-Linalool和BCP對chPAEC的毒性作用

運用MTT法來檢測(-)-Linalool和BCP對chPAEC的毒性作用，結(jié)果如圖2所示，與未加(-)-Linalool和BCP處理的空白對照組相比，用不同濃度的(-)-Linalool和BCP作用細胞24 h后，對細胞活力無明顯影響(P> 0.05)，因此濃度在500 μg·mL-1內(nèi)均可用于后續(xù)實驗。

圖2 (-)-Linalool和BCP 對chPAEC毒性的影響

2.3 (-)-Linalool和BCP對LPS刺激chPAEC中炎癥因子IL-6和TNF-a及TLR4信號通路相關(guān)因子mRNA表達的影響

利用qRT-PCR法檢測(-)-Linalool和BCP對LPS刺激chPAEC細胞分泌IL-6、TNF-α、CD14、TLR4和MyD88 mRNA的影響。結(jié)果如圖3所示，與空白對照組相比，LPS均能使IL-6、TNF-α、CD14、TLR4和MyD88 mRNA表達顯著升高(P<0.05)，與LPS組相比，(-)-Linalool的低、中、高劑量均能使IL-6、TNF-α、CD14、TLR4和MyD88 mRNA顯著或極顯著降低(P<0.05，P<0.01)，且呈劑量依賴性；而BCP的中、高劑量組能使IL-6和TNF-α mRNA分泌量顯著或極顯著降低(P<0.05，P<0.01)，對CD14、TLR4和MyD88 mRNA表達低劑量就能極顯著降低(P<0.05，P<0.01)，且呈劑量依賴性。從圖中可知，在同一劑量條件下，(-)-Linalool的作用會更佳。

2.4 (-)-Linalool和BCP對LPS刺激chPAEC炎性因子PGE2、COX-2和iNOS及黏附因子VCAM-1和ICAM-1的影響

采用ELISA法檢測(-)-Linalool和BCP對LPS刺激chPAEC分泌PGE2、COX-2、iNOS、VCAM-1和ICAM-1的影響。結(jié)果如圖4所示，與空白對照組相比，LPS均能使PGE2、COX-2、iNOS、VCAM-1和ICAM-1分泌量極顯著升高(P<0.01)；與LPS組相比，(-)-Linalool中、高劑量組能使PGE2、COX-2、VCAM-1分泌量顯著或極顯著降低(P<0.05，P<0.01)，對iNOS分泌量低劑量就能顯著降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性，對ICAM-1高劑量才能極顯著降低(P<0.01)；而BCP低劑量就能使PGE2、COX-2、iNOS和VCAM-1分泌量顯著或極顯著降低(P<0.05，P<0.01)，且呈劑量依賴性，對于ICAM-1中劑量組能使分泌量顯著降低(P<0.05)。

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 與對照組相比；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001與LPS組相比。圖3 (-)-Linalool和BCP對LPS刺激chPAEC分泌的IL-6(A)、TNF-α(B)、CD14(C)、TLR4(D)和MyD88(E) mRNA表達的影響

**P<0.01，***P<0.001 與對照組相比；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001與LPS組相比。圖4 (-)-Linalool和BCP對LPS刺激chPAEC分泌的COX-2(A)、PGE2(B)、iNOS(C)、VCAM-1(D)和ICAM-1(E) 表達的影響

2.5 (-)-Linalool和BCP對 LPS刺激chPAEC中NF-κBp65蛋白的影響

采用Western-blot法檢測(-)-Linalool和BCP對 LPS刺激chPAEC中NF-κBp65蛋白的影響，結(jié)果如圖5所示。

與空白對照組相比，LPS能使NF-κBp65蛋白的表達極顯著升高(P<0.001)，與LPS組相比，(-)-Linalool和BCP的低、中、高劑量均能使NF-κBp65蛋白的表達極顯著降低(P<0.001)，且呈劑量依賴性。結(jié)果表明，(-)-Linalool和BCP能夠通過作用于NF-κB通路，抑制炎癥因子和黏附因子的釋放。

***P<0.001 與對照組相比；###P<0.001與LPS組相比。圖5 (-)-Linalool和BCP對LPS刺激chPAEC中NF-κBp65(A-C)蛋白表達的影響

3 討論

有研究表明，微血管內(nèi)皮細胞是內(nèi)毒素作用的主要靶細胞，通常內(nèi)毒素直接作用于微血管內(nèi)皮細胞而產(chǎn)生的損傷效應(yīng)，另外可與免疫細胞膜上的CD14結(jié)合，誘導(dǎo)免疫細胞釋放多種細胞因子和炎性介質(zhì)，最后再影響微血管內(nèi)皮細胞的通路[13]。LPS是革蘭氏陰性菌崩解時被釋放出來的一種內(nèi)毒素，能夠誘導(dǎo)大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞分泌TNF-α，會導(dǎo)致大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞形態(tài)變形、黏附分子及細胞因子增加、大量炎癥介質(zhì)產(chǎn)生、誘導(dǎo)細胞凋亡等病理表現(xiàn)[14]。TLR4激活可以誘導(dǎo)微血管內(nèi)皮細胞細胞內(nèi)黏附分子(ICAM-1)和血管內(nèi)皮細胞黏附分子(VCAM-1) 的mRNA水平增加，提高 ICAM-1、VCAM-1、IL-6 和 TNF-α的表達，增強 NF-κB活化[15]。NF-κB 是在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控COX-2和 iNOS基因表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。特別是在 LPS 誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)中,NF-κB 起著關(guān)鍵的調(diào)控作用[16]。前期研究發(fā)現(xiàn)，(-)-Linalool和BCP無論在體內(nèi)還是體外都具有抗炎作用，而且對LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞分泌炎癥介質(zhì)也具有較好的抑制作用[17]，但是對VECs作用及可能的作用機制還尚未清楚。因此，本文從炎性黏附和炎性因子分泌兩方面來評價(-)-Linalool和BCP對血管內(nèi)皮細胞炎癥損傷的保護作用。

為確定細胞來源的可靠性，以及培養(yǎng)過程中是否存在不同種屬間細胞的交叉污染現(xiàn)象，本研究針對不同物種的特異性基因(Mitochondrial DNA[18]和β-globin[19])進行引物設(shè)計，建立PCR擴增體系[20]，對2種不同種屬來源的細胞 (chPAEC，EA.hy926細胞) 進行種屬鑒定，由結(jié)果可知，在目標泳道、目標位置出現(xiàn)了清晰可見的條帶，Mitochondrial DNA基因在chPAEC和雞全血泳道都在197pb出現(xiàn)了清晰條帶，β-globin基因在EA.hy926細胞泳道1411pb出現(xiàn)了清晰條帶，而在其他泳道沒有出現(xiàn)對應(yīng)于該種屬的目的條帶，可判斷chPAEC來源于雞源，為進一步證實培養(yǎng)的是血管內(nèi)皮細胞，采用CD34相關(guān)抗原抗體熒光染色進行鑒定[21]，通過激光共聚焦顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)均出現(xiàn)綠色的熒光反應(yīng)，說明所培養(yǎng)細胞為VECs，進而可判斷該細胞無交叉污染，后續(xù)的實驗提供了細胞質(zhì)量保證。

在前期實驗中,發(fā)現(xiàn)具有抗炎活性的艾納香油中含(-)-Linalool和BCP[22]，而他們在chPAEC方面的抗炎作用還是未知的，所以本文對(-)-Linalool和BCP在chPAEC方面的炎性損傷進行了研究。然而，目前國內(nèi)外關(guān)于雞的VECs方面的研究還較少，因而它的抗體也比較少，所以在本研究中只做一部分基因的蛋白表達。研究結(jié)果表明(-)-Linalool和BCP可降低了LPS刺激chPAEC的TNF-α、IL-6、iNOS、PGE2和COX-2表達，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。這些結(jié)果表明，(-)-Linalool和BCP組分可改善 LPS誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷，降低炎癥反應(yīng)，減少VECs的炎性損傷。進一步研究發(fā)現(xiàn)，(-)-Linalool和BCP能顯著降低LPS致TLR4/NF-κB信號通路中CD14、TLR4和MyD88 mRNA表達和NF-κBp65蛋白的表達，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。這些結(jié)果提示，(-)-Linalool和BCP通過下調(diào) TLR4/NF-κB 信號通路來發(fā)揮作用，而TLR4激活可以誘導(dǎo)VECs中ICAM-1和VCAM-1并降低黏附因子的產(chǎn)生，減弱血管內(nèi)皮炎癥損傷程度。因此，有效干預(yù) TLR4/NF-κB 信號通路對減輕血管內(nèi)皮細胞炎癥導(dǎo)致的血管損傷有極其重要的意義，這些結(jié)果將為艾納香油及其(-)-Linalool和BCP應(yīng)用于家禽炎癥性疾病的防治提供基礎(chǔ)理論參考。