吳潔瑩 陳勁松 吳韶清 陸 琰 湯雪薇 李 焱

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市婦女兒童醫(yī)療中心廣州臍血庫(kù)(廣州 510623)

作為除骨髓和外周血干細(xì)胞外的另一移植供體來(lái)源，以實(shí)物形式置于液氮中長(zhǎng)期凍存的臍帶血，具有采集方便、來(lái)源廣泛、可根據(jù)患者需求隨時(shí)解凍回輸?shù)葍?yōu)勢(shì)。但是，與“新鮮”樣本不同，冷凍和復(fù)蘇時(shí)細(xì)胞外環(huán)境的變化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活性降低；隨著凍存時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的造血功能也會(huì)受到影響[1- 3]。根據(jù)現(xiàn)行的全球先進(jìn)輸血和細(xì)胞治療聯(lián)盟(Advancing Transfusion and Cellular Therapies Worldwide，AABB)細(xì)胞治療服務(wù)標(biāo)準(zhǔn)(第9 版)的規(guī)定，臍血產(chǎn)品至少需要兩個(gè)完整的附屬血辮與產(chǎn)品一起冷凍保存，用于造血重建的產(chǎn)品在附屬連接段取樣檢測(cè)集落形成單位和(或)CD34 陽(yáng)性細(xì)胞(直接測(cè)量)[4]。每份臍帶血產(chǎn)品體積有限、細(xì)胞珍貴，可供檢測(cè)的樣本通常僅數(shù)百微升。本文擬探討從冷凍袋附屬小管取樣，是否可用于臍帶血產(chǎn)品的質(zhì)量控制及臍帶血移植供體發(fā)放前復(fù)核。

1 材料與方法

1.1 一般資料

本研究選取2009年3月—2021年2月在廣州臍血庫(kù)保存的53份臍帶血樣本(包括主袋和附屬小管)為研究對(duì)象，分別于2014年6月—2021年3月冷凍復(fù)蘇。根據(jù)取材部位和檢測(cè)時(shí)間，分為冷凍前、小管復(fù)蘇和大袋復(fù)蘇組。

1.2 主要試劑與儀器

IMDM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司， DNA酶購(gòu)自美國(guó)Promega公司，臺(tái)盼藍(lán)溶液購(gòu)自Sigma公司，甲基纖維素半固體培養(yǎng)基購(gòu)自加拿大Stemcell公司，流式抗體：CD45-異硫氰酸熒光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC)、CD34-藻紅蛋白(phycoerythrin, PE)、免疫球蛋白(IgG)-PE、7-氨基放線菌素D(7-aminoactinomycin D, 7-AAD)及溶血素購(gòu)自美國(guó)BD公司。 生物潔凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州蘇靜安泰空氣技術(shù)有限公司，型號(hào)：BCM-1600A；低溫高速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)IEC公司，型號(hào)：GP8R；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，型號(hào)：BD FACS Canto Ⅱ；血細(xì)胞分析儀購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司，型號(hào)：Ac.T diff2；恒溫水浴箱購(gòu)自美國(guó)Coring公司，型號(hào)LSE waterbath 6L；旋渦震蕩儀購(gòu)自美國(guó)IKA公司，型號(hào)：LAB Dancer S25；醫(yī)用冷藏箱購(gòu)自海信(北京)電器有限公司，型號(hào)：BCD-196TA；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)Labotect公司，型號(hào)：C200；倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus及Nikon公司，型號(hào)：CHK及TE300。

1.3 方法

1.3.1 樣本復(fù)溫 將臍血自液氮液相中移至氣相，放置5 min。打開鋁夾，取出臍血冷凍袋的附屬血辮，避免彎折。將附屬血辮浸入恒溫水浴箱，溫度設(shè)置在37 ℃～42 ℃，輕輕晃動(dòng)小管，數(shù)秒后取出，快速完成復(fù)溫。用無(wú)菌注射器抽取100 μL樣本用于有核細(xì)胞計(jì)數(shù)、活率檢測(cè)，其余樣本約400～500 μL轉(zhuǎn)移至15 mL無(wú)菌離心管，緩慢加入預(yù)冷的含2%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和10 U/mL DNase的IMDM(Iscove’s Modified Dulbecco’s Media) 培養(yǎng)基5 mL，輕輕搖動(dòng)離心管。置10 ℃條件下，1 500 r/min、離心10 min。重懸細(xì)胞沉淀，再次洗滌離心。加入IMDM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，用于CD34陽(yáng)性細(xì)胞檢測(cè)和干/祖細(xì)胞集落培養(yǎng)。大袋復(fù)蘇與小管復(fù)溫步驟基本相同，置水浴箱中2 min內(nèi)完成復(fù)溫。

1.3.2 樣本檢測(cè) 有核細(xì)胞計(jì)數(shù)：采用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀進(jìn)行檢測(cè)。讀取屏幕上顯示的白細(xì)胞(white blood cell, WBC)數(shù)值，細(xì)胞總數(shù)=WBC×臍血體積。細(xì)胞活率檢測(cè)：采用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)量，計(jì)數(shù)100個(gè)有核細(xì)胞，被染色的為死細(xì)胞，未染色的為活細(xì)胞，根據(jù)臺(tái)盼藍(lán)拒染率，計(jì)算活細(xì)胞比例。CD34陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)：標(biāo)記流式管，設(shè)同型對(duì)照，將制備好的細(xì)胞懸液各50 μL分別加入對(duì)照管及實(shí)驗(yàn)管，對(duì)照管加入10 μL CD45-FITC及10 μL IgG-PE熒光抗體，實(shí)驗(yàn)管加入10 μL CD45-FITC及10 μL CD34-PE熒光抗體，避光孵育20 min。各管分別加入5 μL 7-AAD，繼續(xù)孵育5 min。再加入溶血素2 mL，室溫避光孵育10 min。于1 500 r/min離心5 min，棄上清，再加入2 mL磷酸緩沖鹽溶液，于1 500 r/min離心5 min，棄上清，再以300 μL磷酸緩沖鹽溶液重懸細(xì)胞沉淀，上機(jī)檢測(cè)。分析結(jié)果得到CD34陽(yáng)性細(xì)胞占CD45陽(yáng)性有核細(xì)胞的百分比，再根據(jù)復(fù)溫后臍血的細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算出每份臍血中的CD34陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。造血祖細(xì)胞集落分析：采用MethodCult?GF H4434半固體甲基纖維素培養(yǎng)基，以105細(xì)胞/mL的密度接種于12孔板中，每孔終體積1 mL，每標(biāo)本設(shè)雙復(fù)孔。置37 ℃、5% CO2飽和濕度下培養(yǎng)14～16 天。倒置顯微鏡下觀察粒-巨噬細(xì)胞集落形成單位(colony-forming units-granulocyte/macrophage, CFU-GMs)、爆式紅細(xì)胞集落形成單位(burst-forming unit-erythroid, BFU-E)和粒細(xì)胞-紅細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-巨核細(xì)胞集落形成單位(colony-forming unit-granulocyte/erythrocyte/macrophage/mega-karyocyte, CFU-GEMM)，分別計(jì)數(shù)每105細(xì)胞中的各系集落數(shù)量，求和得到祖細(xì)胞集落形成單位總數(shù)(colony-forming unit, CFUs)，再根據(jù)復(fù)蘇臍血的細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算出每份臍血中的集落數(shù)量。

1.4 觀察指標(biāo)

選擇兩種方法制備的樣本在冷凍前后的總有核細(xì)胞數(shù)(total nucleated cells，TNCs)、細(xì)胞活率、CD34陽(yáng)性細(xì)胞活率、CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量、CFU-GMs及CFUs數(shù)量為觀察比較的指標(biāo)，細(xì)胞活率的計(jì)算公式如下：

TNCs細(xì)胞活率(%)=[活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))]×100%

CD34陽(yáng)性細(xì)胞活率(%)=(7-AAD陰性/CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù))/[(7-AAD陰性/CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù))+(7-AAD陽(yáng)性/CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù))]×100%[5]

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 臍血復(fù)蘇后(小管)和冷凍前的各項(xiàng)參數(shù)的比較

復(fù)蘇后(小管)的總有核細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞活率、CFU-GMs及CFUs數(shù)量較冷凍前均有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，P<0.001，P=0.039，P=0.019)，而二者的CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)基本相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.821)，見表1。

表1 臍血復(fù)蘇后(小管)和冷凍前的各項(xiàng)參數(shù)的比較

2.2 臍血復(fù)蘇后(大袋)和冷凍前的各項(xiàng)參數(shù)的比較

復(fù)蘇后(大袋)的總有核細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞活率較冷凍前均有所降低、CFUs數(shù)量略高于冷凍前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，P<0.001，P=0.013)，而二者的CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及CFU-GMs基本相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.646，P=0.136)，見表2。

表2 臍血復(fù)蘇后(大袋)和冷凍前的各項(xiàng)參數(shù)的比較

2.3 臍血復(fù)蘇后(小管)和復(fù)蘇后(大袋)的各項(xiàng)參數(shù)的比較

復(fù)蘇后(小管)的總有核細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞活率、CD34陽(yáng)性細(xì)胞活率、CFU-GMs及CFUs數(shù)量較復(fù)蘇后(大袋)均有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，P<0.001，P<0.001，P=0.003，P=0.002)，而二者的CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)基本相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.245)，見表3。

表3 臍血復(fù)蘇后(小管)和復(fù)蘇后(大袋)的各項(xiàng)參數(shù)的比較

2.4 臍血復(fù)蘇后(小管)和復(fù)蘇后(大袋)的各項(xiàng)參數(shù)的相關(guān)性分析

復(fù)蘇后(小管)的總有核細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞活率、CD34陽(yáng)性細(xì)胞活率、CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、CFU-GMs及CFUs數(shù)量與復(fù)蘇后(大袋)的各相應(yīng)參數(shù)均具有高度相關(guān)性(P<0.001)，見表4。復(fù)蘇后小管和復(fù)蘇后大袋的TNCs、CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、CFU-GMs和CFUs的相關(guān)性曲線見圖1。

表4 臍血復(fù)蘇后(小管)和復(fù)蘇后(大袋)的 各項(xiàng)參數(shù)的相關(guān)系數(shù)

3 討 論

隨著深低溫冷凍技術(shù)的發(fā)展和臨床臍血移植的廣泛開展，世界各地紛紛建立公共和自體臍帶血庫(kù)。據(jù)美國(guó)國(guó)家骨髓捐獻(xiàn)者計(jì)劃的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，全球已有約54家機(jī)構(gòu)可提供超過802 000份臍帶血，完成超過50 000例臍帶血移植[6- 7]。臍血的平均使用率不到10%，隨著時(shí)間的推移，越來(lái)越多的臍血將處于長(zhǎng)期凍存狀態(tài)，面臨著細(xì)胞活力丟失、環(huán)境溫度失控、人為操作失誤等風(fēng)險(xiǎn)。因此，臍血庫(kù)應(yīng)建立嚴(yán)格完善的質(zhì)控體系，定期評(píng)估臍帶血的質(zhì)量和性能，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并清除不合格產(chǎn)品。

含有臍帶血終產(chǎn)品的冷凍袋在封口前保留一段附屬連接小管，通過熱合機(jī)隔斷為數(shù)段，可作為長(zhǎng)期凍存臍帶血的質(zhì)控樣本。小管與大袋連接，一同存放于鋁夾內(nèi)，避免了樣本混淆。

本臍血庫(kù)從2009年起對(duì)入庫(kù)的樣本保留了與血袋相連的備份小管。本研究選取2009年3月—2021年2月在廣州臍血庫(kù)凍存的53份臍帶血樣本為研究對(duì)象，分為冷凍前、小管復(fù)蘇和大袋復(fù)蘇三組。臨床實(shí)踐表明，臍血輸注劑量與植入及造血重建速度密切相關(guān)，而無(wú)論是冷凍前還是復(fù)溫后的CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量、CFUs數(shù)量比TNCs與移植效果的相關(guān)性更為密切[8-10]，因此，我們?cè)u(píng)價(jià)了各組樣本的TNCs、細(xì)胞活率、CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量、CFU-GMs、CFUs等質(zhì)量參數(shù)。結(jié)果顯示，小管復(fù)蘇后TNCs數(shù)量、細(xì)胞活率、CFU-GMs數(shù)量及CFUs數(shù)量均低于冷凍前，而二者的CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量相當(dāng)；大袋復(fù)蘇后TNCs數(shù)量、細(xì)胞活率亦低于冷凍前， CFUs數(shù)量略高于冷凍前，但 CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及CFU-GMs數(shù)量相當(dāng)；小管復(fù)蘇后的TNCs數(shù)量、細(xì)胞活率、CD34陽(yáng)性細(xì)胞活率、CFU-GMs數(shù)量及CFUs數(shù)量均低于大袋復(fù)蘇后，而二者的CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量相當(dāng)。同時(shí)，小管復(fù)蘇與大袋復(fù)蘇后的TNCs數(shù)量、細(xì)胞活率、CD34陽(yáng)性細(xì)胞活率、CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量、CFU-GMs數(shù)量及CFUs數(shù)量均存在高度相關(guān)性。

圖1 臍血復(fù)蘇后小管和復(fù)蘇后大袋的TNCs、CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、CFU-GMs和CFUs的相關(guān)性曲線注：A：復(fù)蘇后小管和大袋的TNCs相關(guān)分析曲線(n=53, Y=1X+0.12, R2=0.948) B：復(fù)蘇后小管和大袋的CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)相關(guān)分析曲線(n=36, Y=0.56X+2.11, R2=0.577) C：復(fù)蘇后小管和大袋的CFU-GMs相關(guān)分析曲線(n=28, Y=0.54X+3.93, R2=0.612) D：復(fù)蘇后小管和大袋的CFUs相關(guān)分析曲線(n=28,Y=0.54X+10.9, R2=0.704)

理論上，小管與大袋共同經(jīng)歷了臍血制備、程序降溫到長(zhǎng)期凍存的全過程，其復(fù)蘇后的檢測(cè)指標(biāo)應(yīng)接近，但文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果卻不盡相同[11-17]。van Haute等[13]發(fā)現(xiàn)，附屬小管的CD34陽(yáng)性細(xì)胞比大袋高15%，而同時(shí)備份的0.5 mL凍存管中的CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與大袋接近，他們認(rèn)為除附屬小管外，臍血庫(kù)應(yīng)保留更多的凍存管備份樣本，并提供給移植中心自行檢測(cè)，以獲得更為準(zhǔn)確的輸注劑量。Lee[15]等發(fā)現(xiàn)，附屬小管的活率、CD34陽(yáng)性細(xì)胞、CFU-GM和CFUs 均高于大袋，推測(cè)可能是小管的管徑厚度均勻，有利于細(xì)胞活性的維持。他們發(fā)現(xiàn)小管和大袋的各相應(yīng)指標(biāo)之間存在高度相關(guān)性，認(rèn)為小管的檢測(cè)結(jié)果可以代表大袋中臍血的質(zhì)量，并可通過回歸方程推算大袋的細(xì)胞數(shù)量，供臨床移植參考。但Faivre[16]等發(fā)現(xiàn)，復(fù)蘇后小管的細(xì)胞活率低于大袋，認(rèn)為可能是二者的體積和容量不同，造成冷凍時(shí)溫度差異，導(dǎo)致細(xì)胞活力受損；小管的檢測(cè)結(jié)果不能預(yù)測(cè)大袋中臍血質(zhì)量的好壞，甚至可能導(dǎo)致合格的臍血被召回，使患者失去治療的機(jī)會(huì)。他們建議應(yīng)更加關(guān)注冷凍前數(shù)據(jù)，并強(qiáng)調(diào)臍血庫(kù)應(yīng)該接受權(quán)威機(jī)構(gòu)認(rèn)證，保證臍血制備和凍存的質(zhì)量。Galindo[17]等發(fā)現(xiàn)，復(fù)蘇后近端和遠(yuǎn)端小管的細(xì)胞活率和集落增殖效率與大袋接近，但中段小管低于大袋，推測(cè)可能是由于中段小管在冷凍過程中接觸到大袋表面不規(guī)則突起(如接口處或凹痕)導(dǎo)致活率降低。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫凍存和復(fù)蘇過程會(huì)降低臍帶血的TNCs及細(xì)胞活率，但CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量相當(dāng)，各觀察指標(biāo)間均存在高度相關(guān)性，因此，附屬小管可作為臍血庫(kù)質(zhì)量控制和樣本發(fā)放前復(fù)核的取材。

本研究的臍血均為內(nèi)部質(zhì)控樣本，所有檢測(cè)在本實(shí)驗(yàn)室完成。我們未將移植供體納入分組，是考慮到臍血已發(fā)往臨床，只能在當(dāng)?shù)貙?shí)驗(yàn)室檢測(cè)，存在取樣和操作誤差，但也導(dǎo)致本研究缺乏臨床數(shù)據(jù)。另外，總體例數(shù)偏少，各組間樣本數(shù)不平衡(主要是部分樣本取樣量不足，無(wú)法檢測(cè))是本研究的另一局限。值得注意的是，雖然各組的CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量相當(dāng)，但造血集落的生長(zhǎng)卻存在差異，復(fù)蘇后大袋略高于冷凍前，而復(fù)蘇后小管又低于冷凍前和復(fù)蘇后大袋，表明CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的多少并不意味著造血功能是否完好，這也從Morgenstern等[18]和Brand等[19]的報(bào)道中得到證實(shí)。

總之，臍帶血作為一種既可長(zhǎng)期凍存，又能隨時(shí)回輸?shù)母杉?xì)胞治療產(chǎn)品，其產(chǎn)品質(zhì)量應(yīng)備受關(guān)注。臍血庫(kù)應(yīng)依照國(guó)內(nèi)外最新行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，不斷修訂和完善質(zhì)量控制體系，細(xì)化臍血處理、凍存、復(fù)溫等關(guān)鍵步驟的操作規(guī)程，確保臨床移植用血的安全。