楊澤若，張 燚，胡 柳，溫 軼

(浙江養(yǎng)生堂天然藥物研究所， 杭州 310024)

阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease，AD)是一種慢性神經(jīng)退行性疾病，在臨床上主要表現(xiàn)為記憶喪失與日常行動(dòng)功能障礙。據(jù)阿爾茲海默協(xié)會(huì)(Alzheimer’s Association)報(bào)道[1]，截至2018年， 阿爾茲海默癥是造成美國65歲以上人群死亡的第五大原因。根據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示[2]，作為一種高致殘率、影響?yīng)毩⑸钅芰Φ募膊?，AD所導(dǎo)致的死亡人數(shù)在中國所有疾病中排名第五。AD的病因眾說紛紜，但確切的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，迄今也無特效治療或逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)展的藥物。

隨著高通量測序技術(shù)和全基因組關(guān)聯(lián)分析研究的發(fā)展，多個(gè)與AD患病相關(guān)的基因被發(fā)現(xiàn)，其中已證實(shí)有三個(gè)基因——淀粉樣前體蛋白(APP)、早老素1(PSEN1)和早老素2(PSEN2)是家族性阿爾茲海默癥(Familial Alzheimer disease，F(xiàn)AD)的致病基因。目前針對AD的研究主要集中在高加索人群，而對亞洲人群以及中國人群的研究相對較少。Jia等[3]招募了404個(gè)家系的1 330例AD或輕度認(rèn)知障礙(Mild cognitive impairment，MCI)患者并檢測PSENs / APP突變，鑒定了11個(gè)新的突變位點(diǎn)，新的PSENs / APP突變表明中國人與其他種族之間AD發(fā)病機(jī)制可能存在異質(zhì)性。Zheng等[4]對漢族FAD患者進(jìn)行了全基因組測序，鑒定出了漢族人特有的基因外顯子錯(cuò)義突變r(jià)s3792646，表明Complement C7是漢族人患AD的新風(fēng)險(xiǎn)基因。Han等人指出[5]，CLU rs11136000多態(tài)性與白種人AD發(fā)病顯著相關(guān)，而它與亞洲人群AD發(fā)病并沒有顯著性關(guān)聯(lián)。由此我們猜測，不同人種之間的AD遺傳/發(fā)病機(jī)制存在差異，因此有必要對研究相對匱乏的亞洲人群進(jìn)行研究，以挖掘亞洲人群特有的AD致病基因、生物標(biāo)志物以及風(fēng)險(xiǎn)因素。

microRNA(miRNA)是一類保守的非編碼RNA小分子，它們主要通過抑制靶mRNA翻譯或促使其降解實(shí)現(xiàn)對靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[6]。miRNA在神經(jīng)發(fā)育、組織分化和突觸形成過程中起著重要作用[7]。此外，越來越多的證據(jù)表明血漿miRNA含量可能作為潛在的疾病標(biāo)志物，比如血漿miRNA-206水平升高可預(yù)測認(rèn)知能力下降和癡呆程度[8]。目前，有關(guān)miRNA 在亞洲人群AD發(fā)生過程中的作用研究甚少，而且關(guān)于亞洲人AD的表達(dá)譜研究往往只針對mRNA 或者miRNA表達(dá)譜，并沒有將二者進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)合miRNA 及mRNA表達(dá)譜的亞洲人AD系統(tǒng)分析尚未見報(bào)道。

因此，收集現(xiàn)有公開的亞洲人AD與正常人mRNA/miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)手段，篩選核心差異基因與差異miRNAs，構(gòu)建miRNA-mRNA的差異表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。從轉(zhuǎn)錄組水平系統(tǒng)的對亞洲人群可能的AD發(fā)生機(jī)制進(jìn)行分析，為亞洲人AD的診療提供新的潛在靶標(biāo)。

1 材料與方法

分析流程主要包含以下環(huán)節(jié)：數(shù)據(jù)收集與下載，數(shù)據(jù)集預(yù)處理與單個(gè)數(shù)據(jù)集差異分析，可合并腦區(qū)的薈萃分析(Meta分析)和合并分析，核心差異基因選取，潛在靶基因預(yù)測，核心miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，差異基因/靶基因富集分析，靶基因相關(guān)蛋白的互作分析(見圖1)。

圖1 分析流程圖Fig.1 Analysis flow chart

1.1 基因表達(dá)數(shù)據(jù)收集

亞洲人AD患者與正常人的表達(dá)譜數(shù)據(jù)來自基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus, GEO)[9](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。通過限定關(guān)鍵詞“Alzheimer AND HAN”或者“Alzheimer AND ASIAN”， 選取了包含額葉 (Frontal Cortex, FC) 、顳葉 (Temporal Cortex，TC)、海馬體 (Hippocampus，HP) 與內(nèi)嗅皮質(zhì) (Entorhinal Cortex，EC) 等AD發(fā)病相關(guān)腦區(qū)的數(shù)據(jù)。截止2020年6月，一共收集4個(gè)表達(dá)譜數(shù)據(jù)集，分別是GSE131617[10]、GSE36980[11]、GSE139384[12]和GSE120584[13]。為確保數(shù)據(jù)質(zhì)量，剔除了小于50歲的樣本以及在主成分分析中明顯離群的樣本。最終一共獲得了212個(gè)AD患者腦組織mRNA數(shù)據(jù)(76個(gè)FC，71個(gè)TC，58個(gè)EC以及7個(gè)HP)與92個(gè)正常人(Control，CT)腦組織mRNA數(shù)據(jù)(34個(gè)FC，35個(gè)TC，13個(gè)EC以及10個(gè)HP)。此外，miRNA血清數(shù)據(jù)集中包含1 021個(gè)AD以及288個(gè)CT。4個(gè)數(shù)據(jù)集的具體信息(見表1)。

表1 從GEO收集的亞洲人AD患者與正常對照的表達(dá)譜數(shù)據(jù)集Table 1 Expression data sets for AD patients and normal controls in Asian populations collected from GEO

1.2 數(shù)據(jù)集下載、預(yù)處理以及單個(gè)數(shù)據(jù)集差異分析

首先用R包GEOquery[14]下載數(shù)據(jù)集，利用探針注釋的文件對表達(dá)矩陣進(jìn)行探針I(yè)D轉(zhuǎn)換。接著利用R包limma[15]的線性模型，對單個(gè)表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理、性別校正與差異分析：其中miRNA數(shù)據(jù)集進(jìn)行Benjamini-Hochberg(BH)法[16]校正，P校正值 < 0.05為顯著差異；mRNA數(shù)據(jù)集取P值 < 0.05 為顯著差異。由于GSE131617數(shù)據(jù)集根據(jù)布拉克分期(Braak Staging)[17]將AD樣本分為多組，將該數(shù)據(jù)集中布拉克分期為0的樣本劃分為正常人，將其余布拉克分期樣本統(tǒng)一合并為AD患者。

1.3 FC/TC腦區(qū)多個(gè)mRNA數(shù)據(jù)集整合分析

由于多個(gè)數(shù)據(jù)集中均包含F(xiàn)C和TC兩個(gè)腦區(qū)的數(shù)據(jù)，同時(shí)采用以下兩種算法進(jìn)行整合分析：1)合并同腦區(qū)多個(gè)數(shù)據(jù)集，去除批次效應(yīng)后進(jìn)行差異分析；2)meta分析中的魯棒排名聚集算法(Robust Rank Aggregation，RRA)[18]。

1.3.1 FC/TC腦區(qū)mRNA數(shù)據(jù)集的合并分析

將不同研究的芯片數(shù)據(jù)合并進(jìn)行歸一化，可以移除不同研究的批次效應(yīng)，同時(shí)保留真實(shí)的生物學(xué)差異[19]。通過R包sva中的ComBat函數(shù)[20]，將三個(gè)mRNA數(shù)據(jù)集的表達(dá)矩陣進(jìn)行合并，并且去除批次效應(yīng)，然后用limma的線性模型對合并之后的表達(dá)矩陣進(jìn)行性別校正，最后對合并之后的表達(dá)矩陣進(jìn)行差異分析。

1.3.2 FC/TC腦區(qū)mRNA數(shù)據(jù)集的RRA分析

對單個(gè)數(shù)據(jù)集中FC或TC腦區(qū)得到的差異基因(P< 0.05)，按照絕對值表達(dá)差異倍數(shù)(|logFC|)從大到小進(jìn)行排列，并進(jìn)行RRA運(yùn)算，以RRAscore< 0.05 作為篩選閾值，獲得三個(gè)mRNA數(shù)據(jù)集數(shù)據(jù)中排名相對靠前的差異基因。

1.4 核心差異基因選取

對于存在于多個(gè)數(shù)據(jù)集中的腦區(qū)(FC/TC)，通過1.3中兩種方法的交集來獲得核心差異基因。對于僅存在于單個(gè)數(shù)據(jù)集的腦區(qū)(EC/HP)，通過進(jìn)一步降低P值與增加絕對值表達(dá)差異倍數(shù)(|logFC|)的篩選閾值來獲得核心差異基因。

1.5 差異miRNA潛在靶基因預(yù)測

利用miRWalk在線工具[21](http://zmf.umm.uniheidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/)進(jìn)行差異miRNA的靶基因預(yù)測。選擇靶基因3端UTR作為miRNA的作用區(qū)域，并選擇PicTar5[22]、 miRWalk2.0、 TargetScan[22]、DIANA[23]、miRDB[24]以及miRanda[25]等6個(gè)靶基因數(shù)據(jù)庫，選取至少被其中2個(gè)靶基因數(shù)據(jù)庫收錄的靶基因作為潛在靶基因。

1.6 靶基因選取、miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、靶基因蛋白互作分析

將1.5得到的潛在靶基因與1.4得到的各腦區(qū)核心差異基因進(jìn)行交集，得到四個(gè)腦區(qū)的靶基因。將靶基因與對應(yīng)的差異miRNA以及差異表達(dá)倍數(shù)等導(dǎo)入Cytoscape軟件[26]，構(gòu)建四個(gè)腦區(qū)的miRNA-mRNA差異表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。用geneMANIA[27](https://genemania.org/)數(shù)據(jù)庫，對靶基因進(jìn)行蛋白互作分析。

1.7 基因本體論(GO)以及京都基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(KEGG)通路富集分析

通過R包c(diǎn)lusterprofiler[28]對四個(gè)腦區(qū)的差異基因與靶基因進(jìn)行GO以及KEGG通路富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 AD患者與正常對照組miRNA/mRNA差異表達(dá)結(jié)果

2.1.1 miRNA差異表達(dá)結(jié)果

以P校正值< 0.05和|logFC| > 0.5作為差異miRNA的選擇標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出5個(gè)差異miRNAs， 其中4個(gè)(hsa-mi-22、hsa-miR-24、hsa-miR-125b-1-3p、hsa-mi-125-3p)在AD組下調(diào)，1個(gè)(hsa-miR-208a-5p)在AD組上調(diào)。

2.1.2 mRNA差異表達(dá)結(jié)果(差異基因與核心差異基因)

差異基因與核心差異基因的具體篩選要求及差異個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(見表2)。對于存在于多個(gè)數(shù)據(jù)集中的腦區(qū)(FC/TC)，采用方法1.31的合并分析進(jìn)行差異基因篩選，以上差異基因再與1.32中RRA分析結(jié)果取得交集獲得核心差異基因；對于僅存在于單個(gè)數(shù)據(jù)集的腦區(qū)(EC/HP)，通過常規(guī)篩選條件獲得差異基因，并通過提高篩選條件來獲得核心差異基因。

表2 差異基因與核心差異基因的篩選條件與個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)Table 2 Thresholds for DEGs and KDEGs selections and summary statistics

如表2所示，額葉、顳葉、海馬體與內(nèi)嗅皮質(zhì)中分別存在346、662、461與234個(gè)差異基因(見圖2)，研究發(fā)現(xiàn)NPTX2、SLC14A1與GJA1在四個(gè)腦區(qū)中均為差異基因，且上述基因在AD患者(與正常對照相比)的四個(gè)腦區(qū)中呈現(xiàn)出相同的上調(diào)或下調(diào)表達(dá)趨勢。額葉、顳葉、海馬體與內(nèi)嗅皮質(zhì)中分別存在15、29、63與20個(gè)核心差異基因(見表2)。SLC14A1是唯一一個(gè)在四個(gè)腦區(qū)中都被選入核心差異基因的基因。此外，NPAS4同時(shí)出現(xiàn)在FC、TC與EC腦區(qū)；GMPR、ITGB4、APLNR與NPTX2同時(shí)出現(xiàn)在FC、TC與HP腦區(qū)。

2.2 miRNA潛在靶基因預(yù)測和miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用miRWalk等6個(gè)數(shù)據(jù)庫，對5個(gè)差異miRNAs進(jìn)行潛在靶基因預(yù)測，并與前文所述四個(gè)腦區(qū)的核心差異基因進(jìn)行交集，獲得靶基因。共有4個(gè)差異miRNAs的潛在靶基因與核心差異基因存在交集，分別是hsa-mi-22、hsa-miR-24、hsa-miR-125b-1-3p、hsa-mi-125-3p。4個(gè)差異miRNAs與四個(gè)腦區(qū)靶基因的調(diào)控關(guān)系見miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)(見圖3)。

2.3 四個(gè)腦區(qū)靶基因統(tǒng)計(jì)及GeneMANIA的蛋白互作分析

額葉、顳葉、海馬體與內(nèi)嗅皮質(zhì)中分別存在6、10、25與7個(gè)靶基因(見表3)。其中，SLC14A1同時(shí)出現(xiàn)在四個(gè)腦區(qū)的miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)中，NPTX2出現(xiàn)在FC、TC與HP腦區(qū)的網(wǎng)絡(luò)中，AQP1與ANTXR1出現(xiàn)在FC與TC腦區(qū)的網(wǎng)絡(luò)中，TXNIP出現(xiàn)在TC與HP腦區(qū)的網(wǎng)絡(luò)中。此外，DDIT3、FOSB為FC腦區(qū)特有靶基因；HLA-DMA、TPT1、BRMS1、DLG4、ITPKA為TC腦區(qū)特有靶基因；CD44、EMP1、PRRX1、HCN1、KCNH5、HTR3B、CBLN4、RAB15、GFRA2、GABRA3、HPCA、PTPN3、IL12RB2、CACNG3、CTXN3、LRRC2、NCALD、HTR2A、GABRA1、RGS4、PCSK1、MET為HP腦區(qū)特有靶基因；FOS、SOD2、PDYN、NAMPT、PLAC8、MT1M為EC腦區(qū)特有靶基因。靶基因的GeneMANIA結(jié)果表明，四個(gè)腦區(qū)中的靶基因間均存在復(fù)雜的相互作用，包括共表達(dá)相關(guān)性、共享蛋白結(jié)構(gòu)域、基因相互作用、物理相互作用與共同通路等等。值得注意的是，HP靶基因數(shù)目最多、差異倍數(shù)更大、具有更復(fù)雜的蛋白相互作用關(guān)系、且多在HP中特異表達(dá)；EC靶基因與其他腦區(qū)靶基因交集最少，SLC14A1為唯一交集。

表3 靶基因統(tǒng)計(jì)以及geneMANIA蛋白互作分析結(jié)果Table 3 Target genes and geneMANIA results of the PPI network analyses

2.4 四個(gè)腦區(qū)中差異基因/靶基因GO與KEGG通路富集結(jié)果

四個(gè)腦區(qū)差異基因的GO與KEGG富集結(jié)果(見圖4)。結(jié)果表明FC、TC與HP腦區(qū)的GO富集結(jié)果比較接近，主要集中在神經(jīng)遞質(zhì)傳導(dǎo)、化學(xué)突觸傳遞等神經(jīng)信號(hào)傳遞相關(guān)通路，而EC腦區(qū)的GO富集結(jié)果更偏向于免疫相關(guān)，如中性粒細(xì)胞脫顆粒等。KEGG分析中， FC與TC腦區(qū)都富集到了神經(jīng)性退行性疾病通路，如亨廷頓氏病、漸凍癥、帕金森癥等，HP富集到了神經(jīng)遞質(zhì)傳導(dǎo)相關(guān)通路，如神經(jīng)活性配體受體相互作用信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路、GABA能突觸信號(hào)、谷氨酸能突觸信號(hào)，而EC主要富集在炎癥、免疫相關(guān)通路。

四個(gè)腦區(qū)靶基因的GO與KEGG富集結(jié)果(見圖5a,5b)。從GO分析結(jié)果來看，四個(gè)腦區(qū)各自的靶基因可被同時(shí)富集到轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的生物學(xué)過程中；FC、TC與HP的靶基因被同時(shí)富集到神經(jīng)遞質(zhì)受體活性調(diào)控的生物學(xué)過程；HP的靶基因可被特異性地富集到離子跨膜運(yùn)輸調(diào)控過程中；EC的靶基因可被特異性地富集到低溫應(yīng)激、衰老、神經(jīng)元死亡、活性氧應(yīng)激等4個(gè)生物學(xué)過程中。從KEGG分析結(jié)果來看，四個(gè)腦區(qū)的靶基因未能富集到同一通路上，但FC、TC與EC腦區(qū)的靶基因能被同時(shí)富集到可卡因成癮通路。

3 討 論

本研究收集了GEO數(shù)據(jù)庫中亞洲人AD患者與正常人mRNA/miRNA數(shù)據(jù)，通過薈萃分析與合并分析，從轉(zhuǎn)錄組水平系統(tǒng)地對亞洲人群可能的AD發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了分析，首次構(gòu)建了亞洲人四個(gè)腦區(qū)AD的miRNA-mRNA差異表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。

目前有多項(xiàng)生信研究利用已有AD表達(dá)譜數(shù)據(jù)對AD機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)性研究。Xu等[29]運(yùn)用合并分析方法，整合了20個(gè)表達(dá)譜數(shù)據(jù)，構(gòu)建了AD患者四個(gè)腦區(qū)的mRNA轉(zhuǎn)錄譜，發(fā)現(xiàn)了YAP1等AD上游調(diào)控因子。Shi等[30]通過分析1個(gè)RNA-seq數(shù)據(jù)集，鑒定了AD患者上游調(diào)控的lncRNA，構(gòu)建了lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。Moradifard等[31]分析了1個(gè)miRNA以及6個(gè)mRNA芯片數(shù)據(jù)，通過薈萃分析發(fā)現(xiàn)了AD中重要的mRNA/miRNA相互作用關(guān)系。以上工作往往只采用一種整合分析方法，如薈萃分析或合并分析，或者只進(jìn)行了單組學(xué)分析。本研究對多數(shù)據(jù)集腦區(qū)的數(shù)據(jù)同時(shí)應(yīng)用了兩種整合分析方法，可以更加準(zhǔn)確地得到多數(shù)據(jù)集腦區(qū)中的差異基因。此外，上述生信研究的表達(dá)譜數(shù)據(jù)均為高加索人群，而不同人種之間的AD遺傳/發(fā)病機(jī)制可能存在差異，因此本研究旨在收集亞洲人AD表達(dá)譜數(shù)據(jù)，構(gòu)建亞洲人AD的miRNA-mRNA差異表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。

發(fā)現(xiàn)5個(gè)差異miRNAs，已有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-22與miR-24在AD病人中低表達(dá)，與本研究中的發(fā)現(xiàn)一致：Jovicic等[32]指出miR-22在阿爾茲海默癥患者中低表達(dá)；Hu等[33]通過薈萃分析發(fā)現(xiàn)miR-24在AD患者的腦脊液中低表達(dá)。盡管Ylmaz等[34]指出hsa-mi-125-3p和hsa-miR-125b-5p在AD患者中(相比于正常人)并沒有顯著差異，但是其研究樣本較少(AD 172個(gè)，CT 109個(gè))，且亞洲人群占比較少。因此，這兩個(gè)差異miRNAs及其靶基因在亞洲人群AD發(fā)生發(fā)展中的作用值得進(jìn)一步的研究。此外，本研究發(fā)現(xiàn) NTPX2、GJA1與SLC14A1在四個(gè)腦區(qū)中均為差異基因。Xiao等[35]表明NPTX2在 AD患者皮質(zhì)中大量減少，且與患者認(rèn)知能力和海馬體積密切相關(guān)。Kajiwara等[36]指出星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性表達(dá)的GJA1在AD病人大腦上調(diào)，并發(fā)現(xiàn)GJA1與AD淀粉樣蛋白、tau病理以及認(rèn)知功能密切相關(guān)。Kerstin等[37]指出，SLC14A1的表達(dá)在AD病人和小鼠模型中均顯著上調(diào)。上述基因在本研究的表達(dá)趨勢與文獻(xiàn)報(bào)道一致，進(jìn)一步證明了本研究分析策略和結(jié)果的可靠性。

SLC14A1(尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1)是唯一在四個(gè)腦區(qū)中共有的靶基因。通過蛋白互作分析，發(fā)現(xiàn)SLC14A1和AQP1(水通道蛋白1)存在蛋白相互作用，同時(shí)AQP1在AD患者中表達(dá)上調(diào)，且四個(gè)腦區(qū)靶基因的GO都富集到液體轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)過程。有研究表明SLC14A1在亨廷頓舞蹈病中顯著增高，從而破壞大腦中的尿素平衡，導(dǎo)致紋狀體神經(jīng)元大量死亡[38]。此外，Hansmannel等[39]通過AD患者額葉皮層的轉(zhuǎn)錄組測序，指出腦中尿素平衡與AD發(fā)病相關(guān)。因此猜測SLC14A1與AQP1在AD患者中的表達(dá)上調(diào)與相互作用，可能會(huì)引起腦中尿素循環(huán)與水循環(huán)紊亂，從而造成神經(jīng)損傷并誘導(dǎo)AD發(fā)病。此外，通過艾倫大腦圖譜(Allen Brain Map)[40]中的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)AQP1、SLC14A1都在星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astro L1-6 FGFR3)中特異表達(dá)。 Misawa等[41]也指出，星形膠質(zhì)細(xì)胞中AQP1上調(diào)可能與AD患者腦中Aβ沉積相關(guān)。因此本研究進(jìn)一步推測，AD患者星形膠質(zhì)細(xì)胞SLC14A1、AQP1的差異表達(dá)，將破壞星形膠質(zhì)細(xì)胞的水平衡與尿素平衡，從而引起細(xì)胞腫脹破裂，最終影響神經(jīng)元功能。

通過整合四個(gè)腦區(qū)靶基因和miRNA-mRNA的差異網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，對單腦區(qū)的特異性靶基因進(jìn)行了分析，特別是HP腦區(qū)，其靶基因數(shù)目最多、差異倍數(shù)更大、多數(shù)在海馬中特異表達(dá)、并且主要是配體門控性離子通道相關(guān)基因，包括GABRA1(A型γ-氨基丁酸受體亞基Alpha1)，GABRA3(A型γ-氨基丁酸受體亞基Beta3)，HTR3B(5-羥色胺受體3B)與HTR2A(5-羥色胺受體2A)等。Agenor等[42]表明GABA受體 α1、β3亞型在AD患者的海馬中表達(dá)下調(diào)。Garcia-Alloza等[43]發(fā)現(xiàn)膽堿能與5-羥色胺能系統(tǒng)之間的不平衡，可能與AD的認(rèn)知障礙相關(guān)。此外，Pedro 等[44]證明Cbln4參與形成并維持GABA能連接，敲除Cbln4后神經(jīng)元GABA能連接大大減少，且Cbln4在AD小鼠的海馬區(qū)中表達(dá)顯著下調(diào)。上述基因在本研究中的HP腦區(qū)中均表達(dá)下調(diào)，因此，本研究推斷亞洲人群AD患者的海馬體GABA受體亞型與5-羥色胺能受體亞型表達(dá)下調(diào)，可能破壞興奮性能與抑制性能神經(jīng)元之間信號(hào)平衡，最終造成海馬體中神經(jīng)元的功能障礙。

此外，EC腦區(qū)靶基因與其他腦區(qū)靶基因交集只有SLC14A1，且其GO/KEGG富集通路與其他三個(gè)腦區(qū)有較大區(qū)別。Flynn等[45]表明SOD2(線粒體超氧化物歧化酶2)可以將超氧化物還原為過氧化氫，保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞免受谷氨酸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞毒性。Xing等[46]指出，NAMPT(煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶)減少導(dǎo)致NAD +減少，從而導(dǎo)致NAD+ / NADH的比率降低與線粒體功能障礙。在本研究中，SOD2、NAMPT等基因在EC中下調(diào)，因此本研究猜測亞洲人群AD患者EC中SOD2與NAMPT的下調(diào)可能引起線粒體功能障礙，繼而造成突觸受損、神經(jīng)細(xì)胞凋亡，最終促使AD的病情發(fā)展。

本研究主要基于GEO數(shù)據(jù)庫中的微陣列芯片數(shù)據(jù)，因此具有一些局限性。首先，微陣列芯片數(shù)據(jù)受制于其技術(shù)的局限性，例如技術(shù)動(dòng)態(tài)范圍較窄、靈敏度較低等。其次，本研究使用的芯片數(shù)據(jù)來自不同條件下的多個(gè)研究，樣本量不均并且許多患者臨床細(xì)節(jié)未知(如用藥情況等)，增加了本研究不確定性。盡管本研究采用兩種整合分析方法，也無法完全消除各項(xiàng)研究的異質(zhì)性。此外，本研究受限于亞洲人數(shù)據(jù)集的樣本量，某些腦區(qū)(如海馬體)樣本量較少，其結(jié)果可能不具備普適性。值得注意的是，上述芯片數(shù)據(jù)的基因表達(dá)量為單腦區(qū)所有細(xì)胞的平均值，并沒有達(dá)到單細(xì)胞精確度，因此我們無法直接證實(shí)SLC14A1是否在AD患者的星形膠質(zhì)細(xì)胞特異差異表達(dá)，并影響AD患者星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能。最后，本研究沒有詳細(xì)探究FC與TC腦區(qū)特異性變化的靶基因，可能忽略了這些靶基因在上述腦區(qū)的特異性作用。本研究雖然對SLC14A1在亞洲人AD中的潛在作用進(jìn)行了推測，但仍然需要構(gòu)建相應(yīng)的細(xì)胞和動(dòng)物模型進(jìn)一步研究其確切的作用機(jī)制。此外，本研究希望通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，核實(shí)本研究的推測，并進(jìn)一步研究星形膠質(zhì)細(xì)胞在亞洲人AD中的作用機(jī)制。

4 結(jié) 論

收集現(xiàn)有公開的亞洲人AD與正常人mRNA/miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)手段，從轉(zhuǎn)錄組水平系統(tǒng)地對亞洲人群可能的AD發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了分析，最終篩選出差異miRNAs與核心差異基因，首次構(gòu)建了亞洲人四個(gè)腦區(qū)的關(guān)鍵miRNA-mRNA差異表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)了SLC14A1基因在四個(gè)腦區(qū)均差異表達(dá)。本研究推測SLC14A1和AQP1蛋白相互作用，影響了AD患者星形膠質(zhì)細(xì)胞的體液轉(zhuǎn)運(yùn)功能，最終影響神經(jīng)元細(xì)胞，從而誘導(dǎo)AD的發(fā)病。此外，研究發(fā)現(xiàn)亞洲人AD海馬體與內(nèi)嗅皮質(zhì)中的特異表達(dá)靶基因，分別與神經(jīng)元間信號(hào)傳遞與線粒體功能障礙相關(guān)。以上研究為亞洲人AD的診療提供新的潛在靶標(biāo)，也為組學(xué)分析提供了新的思路。