姚金東 王妮妮 劉亞然

【摘要】 目的：研究羅沙司他減輕小鼠心肌缺血再灌注損傷的作用和機(jī)制。方法：選取20只雄性C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為生理鹽水組和羅沙司他組，每組10只。生理鹽水組腹腔注射生理鹽水，羅沙司他組腹腔注射羅沙司他。結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支45 min，再灌注3 h。記錄小鼠心肌梗死面積;檢測(cè)小鼠血漿中肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）水平;TUNEL檢測(cè)小鼠心肌細(xì)胞凋亡;免疫印跡檢測(cè)小鼠心肌組織中低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）表達(dá);實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)小鼠心肌組織中Ddit4和Ndufa4l2的mRNA表達(dá)。結(jié)果：與生理鹽水組比較，羅沙司他組可明顯減小小鼠心肌梗死面積，降低血漿心肌酶水平，減輕心肌細(xì)胞凋亡，上調(diào)心肌組織中HIF-1α、Ddit4 mRNA和Ndufa4l2 mRNA的表達(dá)水平（P<0.05）。結(jié)論：羅沙司他可通過(guò)上調(diào)HIF-1α和低氧反應(yīng)基因Ddit4和Ndufa4l2的表達(dá)，減輕實(shí)驗(yàn)小鼠的心肌缺血再灌注損傷。

【關(guān)鍵詞】 羅沙司他 心肌缺血再灌注損傷 低氧誘導(dǎo)因子 凋亡

Study on the Effect and Mechanism of Roxadustat in Alleviating Myocardial Ischemia Reperfusion Injury in Mice/YAO Jindong， WANG Nini， LIU Yaran. //Medical Innovation of China， 2022， 19（08）： 0-019

[Abstract] Objective： To study the effect and mechanism of Roxadustat in alleviating on myocardial ischemia reperfusion injury in mice. Method： A total of 20 male C57BL/6 mice were randomly divided into normal saline group and Roxadustat group， 10 mice in each group. The normal saline group was intraperitoneally injected with normal saline， and the Roxadustat group was intraperitoneally injected with Roxadustat. The left anterior descending coronary artery was ligated for 45 min and reperfusion for 3 h. The area of myocardial infarction in mice was recorded; and the levels of creatine kinase （CK） and lactate dehydrogenase （LDH） in plasma were detected; TUNEL was used to detect myocardial cell apoptosis in mice; Western blotting was used to detect the expression of hypoxia-inducible factor-1α （HIF-1α） in mice myocardium; the mRNA expressions of Ddit4 and Ndufa4l2 in mice myocardium were detected by real-time PCR. Result： Compared with the normal saline group， Roxadustat group could significantly reduce the myocardial infarction area， reduce the level of plasma myocardial enzymes， reduce cardiomyocyte apoptosis and up-regulate the expression levels HIF-1α， Ddit4 mRNA， Ndufa4l2 mRNA in myocardial tissue （P<0.05）. Conclusion： Roxadustat alleviates myocardial ischemia reperfusion injury in mice by up-regulating the expression of HIF-1α and hypoxia response genes Ddit4 and Ndufa4l2.

[Key words] Roxadustat Myocardial ischemia reperfusion injury Hypoxic-inducible factor Apoptosis

First-author’s address： Panjin Liaoyou Gem Flower Hospital， Liaoning Province， Panjin 124000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.08.004

早期再灌注是心肌梗死發(fā)生后縮小梗死面積、維持心功能最有效的治療方法，然而，缺血性心臟病仍然是導(dǎo)致心力衰竭的主要原因[1]。為進(jìn)一步改善心血管疾病的預(yù)后，亟須探究缺血性心臟病管理新的方法和新策略。缺血預(yù)處理已被證實(shí)是預(yù)防缺血/再灌注損傷的有效方法。為在藥理學(xué)上實(shí)現(xiàn)缺血預(yù)處理，已有研究報(bào)道了一些潛在的可介導(dǎo)缺血預(yù)處理的藥物，如腺苷、蛋白激酶C、阿片受體和活性氧等[2]。此外，多項(xiàng)研究表明，抑制脯氨酸羥化酶結(jié)構(gòu)域蛋白或過(guò)表達(dá)低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）可顯著減輕缺血性損傷[3-4]。作為缺氧誘導(dǎo)型應(yīng)激反應(yīng)基因，DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄物4（Ddit4）和Ndufa4l2是HIF-1α的直接靶基因，其與細(xì)胞壓力應(yīng)激、凋亡、自噬等生命進(jìn)程息息相關(guān)[5]。

先前的研究報(bào)道脯氨酸羥化酶抑制劑能夠上調(diào)紅細(xì)胞生成素并促進(jìn)肝臟中紅細(xì)胞產(chǎn)生，隨后開(kāi)發(fā)了第一類脯氨酸羥化酶抑制劑——羅沙司他[6]。羅沙司他可穩(wěn)定提高促紅細(xì)胞生成素和血紅蛋白水平，用于模擬缺氧的自然反應(yīng)，最初被用于治療慢性腎病患者的貧血[7]。然而，羅沙司他對(duì)心肌缺血/再灌注損傷的治療效果仍有待充分闡明。因此，在本研究中，筆者建立心肌缺血小鼠模型，再灌注后觀察羅沙司他對(duì)小鼠心梗面積和HIF-1α信號(hào)通路和低氧反應(yīng)基因的影響，探討羅沙司他預(yù)處理是否能保護(hù)小鼠心肌缺血再灌注損傷，以及其潛在的機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 羅沙司他[阿斯利康（中國(guó)）]，DMSO（上?？脐簧锕こ蹋?，伊文思藍(lán)、TTC染色劑（美國(guó)Sigma公司），血漿肌酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所），TUNEL檢測(cè)試劑盒（上海碧云天），HIF-1α抗體（#36169，美國(guó)CST公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及小鼠心肌缺血再灌注模型制備 于2019年6月-2020年9月進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。選取20只12周齡雄性C57BL/6小鼠，體重20～26 g，隨機(jī)分為兩組，每組10只。3 h后，所有小鼠手術(shù)區(qū)域備皮消毒，行異氟醚（生產(chǎn)廠家：河北一品制藥股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H19980141，規(guī)格：100 mL）麻醉，于胸骨左側(cè)第3、4肋間剪開(kāi)皮膚，逐層鈍性分離皮下組織、肌肉，打開(kāi)胸腔，用開(kāi)胸器撐開(kāi)肋間、充分暴露心臟，剪開(kāi)心包，在體視顯微鏡下仔細(xì)辨認(rèn)，可見(jiàn)在心耳下緣或左側(cè)出現(xiàn)一條粉紅色血管即為左冠狀動(dòng)脈的前降支，開(kāi)胸后迅速結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，45 min后解開(kāi)結(jié)扎，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈的前降支后看到左心室前壁心肌變白，局部收縮運(yùn)動(dòng)受限，左心耳充盈脹滿，心電圖見(jiàn)ST段持續(xù)弓背抬高，表明心肌缺血再灌注模型成功。3 h后靜脈取血1 mL，處理小鼠以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組腹腔注射生理鹽水，羅沙司他組腹腔注射羅沙司他（溶于DMSO溶液）[生產(chǎn)廠家：琺博進(jìn)（中國(guó)）醫(yī)藥技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20180024，規(guī)格：50 mg]25 mg/kg。

1.3 伊文思藍(lán)/TTC染色 各組小鼠再灌注3 h后，從右側(cè)頸內(nèi)靜脈注入1%伊文思藍(lán)。小鼠唇染藍(lán)后，剪下心臟，剔除心房，-80 ℃速凍，切片。平行房室溝將左室切成1.5～2.0 mm厚切片。放入2%的TTC染液中小心避光浸染，30 ℃避光孵育30 min，并隨時(shí)觀察樣本顏色變化。隨后，切片置于10%中性福爾馬林中固定24 h。用生理鹽水沖洗組織表面多余的染色液，拍照記錄各組小鼠心肌梗死面積。

1.4 血漿中心肌酶水平檢測(cè) 再灌注3 h后，小鼠靜脈取血1 mL，分別按說(shuō)明書(shū)用血漿CK和LDH檢測(cè)試劑盒檢測(cè)小鼠血漿中CK和LDH水平。

1.5 心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè) 再灌注3 h后，取小鼠心肌組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切厚度為3～4 μm的組織切片。按照說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行TUNEL染色。小鼠正常心肌細(xì)胞呈藍(lán)色熒光，凋亡心肌呈紅色。分別取3個(gè)不同的視野，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)TUNEL染色陽(yáng)性的小鼠心肌細(xì)胞數(shù)量。

1.6 免疫印跡 再灌注3 h后，摘取小鼠心臟，RIPA裂解液冰上裂解，4 ℃ 12 000 r離心5 min，取上清，加SDS上樣緩沖液100 ℃變性10 min后，即得心肌組織蛋白。行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，BSA封閉1 h，孵育一抗（HIF-1α、GAPDH）4 ℃過(guò)夜，漂洗后孵育二抗4 ℃約4 h，ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯影，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)各組小鼠心肌組織中相關(guān)蛋白的相對(duì)含量。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 用Trizol試劑提取小鼠心肌中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以GAPDH為內(nèi)參，SYBR法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，各基因相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt表示。引物序列為：

（1） GAPDH。 F，5’-GGCACAGTCAAGGCTAGAATG-3’，R，5’-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3’。（2）Ddit4：F，5’-TGGACAGCAGCAACAGTGG-3’;R，5’-TGCATCAGGTTGGCACACAG-3’。（3）Ndufa4l2：F，5’-CTGGGACAAGATGGCAGGAAC-3’;R，5’-GGGCAAGTCGCAGCAAGTAGA-3’。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 7.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 羅沙司他對(duì)心肌缺血再灌注小鼠梗死面積的影響 在小鼠冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎術(shù)后3 h給予羅沙司他腹腔注射25 mg/kg，與生理鹽水組相比，再灌注3 h后，羅沙司他可顯著誘發(fā)小鼠對(duì)心肌缺血再灌注損傷的抵抗，表現(xiàn)為小鼠心肌梗死面積縮小（未染色區(qū)域）;再灌注3 h后，兩組危險(xiǎn)區(qū)面積比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;羅沙司他組心肌梗死面積/危險(xiǎn)區(qū)面積百分比較生理鹽水組顯著下降（P<0.05）。見(jiàn)表1、圖1。

2.2 羅沙司他對(duì)心肌缺血再灌注小鼠血漿心肌酶水平的影響 小鼠行心肌缺血再灌注后，與生理鹽水組相比，羅沙司他組小鼠血漿CK、LDH的水平均顯著下降（P<0.05），見(jiàn)表2。

2.3 羅沙司他對(duì)心肌缺血再灌注小鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響 小鼠行心肌缺血再灌注后，與生理鹽水組小鼠心肌中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（214.37±20.65）/mm2相比，羅沙司他組（96.45±11.94）/mm2顯著減少（t=-15.633，P<0.001），見(jiàn)圖2。

2.4 羅沙司他對(duì)心肌缺血再灌注小鼠心肌HIF-1α表達(dá)的影響 與生理鹽水組小鼠心肌中HIF-1α的表達(dá)水平（1.14±0.10）相比，羅沙司他組（1.62±0.25）顯著升高（t=5.637，P<0.001），見(jiàn)圖3。

2.5 羅沙司他對(duì)心肌缺血再灌注小鼠心肌低氧反應(yīng)基因表達(dá)的影響 結(jié)果顯示，與生理鹽水組相比，羅沙司他組小鼠心肌中Ddit4和Ndufa4l2的mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），見(jiàn)表3、圖4。

3 討論

近年來(lái)，世界范圍內(nèi)心肌梗死的發(fā)病率顯著增加，嚴(yán)重威脅人類健康?；颊叩男募」Ｋ烂娣e與其長(zhǎng)期臨床預(yù)后密切相關(guān)，早期經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入再灌注是現(xiàn)有減少心梗后梗死面積和改善臨床預(yù)后的最有效策略[8]。然而，心肌梗死仍然是心力衰竭的常見(jiàn)誘因，且此類患者的死亡率很高。因此，針對(duì)減輕心肌缺血損傷作用的心臟保護(hù)策略顯得至關(guān)重要。盡管目前已經(jīng)報(bào)道了一些潛在的心臟保護(hù)療法，但仍缺乏針對(duì)再灌注損傷的治療方法和藥物。因此，筆者通過(guò)建立心肌缺血小鼠模型，探討羅沙司他預(yù)處理對(duì)小鼠心肌缺血再灌注損傷的作用，以及其潛在的機(jī)制。

羅沙司他是全球首個(gè)口服強(qiáng)效可逆低氧誘導(dǎo)因子脯氨酸羥化酶抑制劑，是阿斯利康中國(guó)在國(guó)內(nèi)研發(fā)的Ⅰ類新藥，主要用于治療慢性腎病透析患者貧血。為了維持更持久的藥效，羅沙司他臨床上治療慢性腎臟病患者貧血通常采用間歇性給藥策略。羅沙司他的半衰期約為10 h，每周給藥三次，可使低氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）轉(zhuǎn)錄活性在兩次給藥之間恢復(fù)到基線水平，并誘導(dǎo)HIF-1及其靶基因介導(dǎo)的紅細(xì)胞生成[9]。在本研究中，筆者首次將羅沙司他預(yù)處理應(yīng)用在心肌缺血實(shí)驗(yàn)小鼠上，發(fā)現(xiàn)給予羅沙司他預(yù)處理的小鼠，其心肌缺血再灌注后心肌梗死面積顯著減少，心肌酶水平降低，心肌凋亡程度減輕，心肌組織中HIF-1α、Ddit4和Ndufa4l2的表達(dá)均顯著升高。

HIF-1α是在心血管系統(tǒng)生理和病理中發(fā)揮關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子。西門(mén)子等在1991年首次發(fā)現(xiàn)HIF-1α作為促紅細(xì)胞生成素的轉(zhuǎn)錄因子[10];另有學(xué)者研究揭示了HIF-1α在常氧下被VHL降解、以及缺氧下HIF-1α激活的機(jī)制[11]。在缺氧情況下，HIF-1α由抑制脯氨酸羥化酶結(jié)構(gòu)域蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生，在缺血預(yù)處理扮演著重要的角色。在復(fù)氧條件下，脯氨酸羥化酶低氧誘導(dǎo)因子-1α被希佩爾林道（VHL）連接，募集泛素連接酶，進(jìn)一步降解和泛素化蛋白酶體。與此相反，在缺氧條件下，HIF-1α的羥基化以及接下來(lái)的泛素化和降解均中止[12-13]。因此，HIF-1α在細(xì)胞中可作為轉(zhuǎn)錄和非轉(zhuǎn)錄因子聚集。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)羅沙司他可以顯著減少小鼠心肌梗死面積，顯著升高小鼠心肌中HIF-1α的表達(dá)，從而減輕實(shí)驗(yàn)小鼠的心肌缺血再灌注損傷。

Ddit4是一種高度保守的細(xì)胞應(yīng)激性蛋白，在缺氧、DNA損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、能量匱乏、營(yíng)養(yǎng)消耗等細(xì)胞應(yīng)激情況下顯著高表達(dá)，已被報(bào)道參與調(diào)節(jié)細(xì)胞壓力應(yīng)激、DNA損傷修復(fù)、凋亡和自噬等細(xì)胞進(jìn)程[14]。作為缺氧誘導(dǎo)型應(yīng)激反應(yīng)基因，Ddit4基因是HIF-1α的直接轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)。Ndufa4l2蛋白是線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ亞基家族的一員。研究表明，Ndufa4l2蛋白是唯一在低氧環(huán)境下高表達(dá)的線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ亞基蛋白，且其基因是HIF-1α的直接靶基因。在低氧環(huán)境下，嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞以及腦細(xì)胞等的Ndufa4l2蛋白水平均高表達(dá)，Ndufa4l2參與介導(dǎo)細(xì)胞低氧適應(yīng)性以及損傷保護(hù)等生理病理機(jī)制[15]。研究證實(shí)，在缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞模型中，Ndufa4l2可通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ亞基蛋白減輕心肌細(xì)胞凋亡、改善線粒體功能障礙，進(jìn)一步預(yù)防心肌缺血再灌注損傷[16]。此外，丁苯酞可通過(guò)HIF-1α/Ndufa4l2調(diào)節(jié)線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ亞基蛋白表達(dá)，進(jìn)一步保護(hù)線粒體、減輕氧化應(yīng)激，發(fā)揮對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用，可能參與腦缺血損傷的修復(fù)[17]。本研究結(jié)果表明，羅沙司他組小鼠心肌中HIF-1α的表達(dá)顯著上調(diào)，且Ddit4和Ndufa4l2的mRNA表達(dá)水平均顯著升高，提示羅沙司他可上調(diào)HIF-1α以及低氧反應(yīng)基因Ddit4和Ndufa4l2的表達(dá)，進(jìn)而減輕實(shí)驗(yàn)小鼠的心肌缺血再灌注損傷。

然而，本研究尚存在一定不足。例如，本研究雖揭示了羅沙司他可通過(guò)調(diào)節(jié)心肌中HIF-1α表達(dá)進(jìn)而減輕小鼠的心肌缺血再灌注損傷，但關(guān)于羅沙司他是如何作用在小鼠心肌HIF-1α上的，是通過(guò)通路調(diào)節(jié)還是與之直接相結(jié)合，是否存在其他靶點(diǎn)，尚不清楚，有待進(jìn)一步深入探究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)羅沙司他可通過(guò)上調(diào)HIF-1α和低氧反應(yīng)基因Ddit4和Ndufa4l2的表達(dá)，減輕實(shí)驗(yàn)小鼠的心肌缺血再灌注損傷，提示羅沙司他藥理學(xué)預(yù)處理可能成為對(duì)抗心肌缺血再灌注損傷的新策略。

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（收稿日期：2021-07-30） （本文編輯：姬思雨）