以甘藍(lán)中花青素為例探究數(shù)碼成像比色法的應(yīng)用

陳妍言 林麗

摘要：選擇甘藍(lán)作為實(shí)驗(yàn)材料，以電腦屏幕、96孔微孔板、手機(jī)和ImageJ作為數(shù)碼成像比色法的主體，進(jìn)行未知溶液含量的測(cè)定、酸堿滴定終點(diǎn)的判斷。在學(xué)生已有知識(shí)的基礎(chǔ)上，逐步接觸到朗伯-比爾定律、導(dǎo)數(shù)法求解酸堿滴定終點(diǎn)。所有的實(shí)驗(yàn)材料均可以在生活中獲得或找到對(duì)應(yīng)的替代品。

關(guān)鍵詞：比色;花青素;甘藍(lán);天然酸堿指示劑;微孔板;一階導(dǎo)數(shù);滴定終點(diǎn)

文章編號(hào)：1008-0546（2022）04-0084-04

中圖分類號(hào)：G632.41

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

doi：10.3969/j.issn.1008-0546.2022.04.018

一、問(wèn)題提出

比色法廣泛運(yùn)用于物質(zhì)含量的檢測(cè)，即根據(jù)溶液顏色的深淺判斷物質(zhì)含量的多少?？梢苑譃槟恳暠壬ê头止夤舛确?。目視比色法通過(guò)人眼對(duì)溶液顏色的判斷，快速對(duì)大量樣品進(jìn)行分析，但精確度和準(zhǔn)確度有限;分光光度法依據(jù)物質(zhì)對(duì)特定光的定量吸收，由吸光度得到溶液的濃度，但需要使用昂貴的分光光度計(jì)，且學(xué)生困惑于儀器盒內(nèi)儀器工作的原理[1]。解決辦法之一是使用簡(jiǎn)單的材料讓學(xué)生自主構(gòu)建分光光度計(jì)[1]，學(xué)生通過(guò)分光光度計(jì)觀察到光經(jīng)過(guò)溶液發(fā)生的強(qiáng)度變化比他們只能看見(jiàn)等式、圖解或者顯示屏上的數(shù)字更加記憶深刻。分光光度計(jì)通常由光源、單色器、吸收池和檢測(cè)器四個(gè)部分構(gòu)成。生活中常見(jiàn)的材料可以用來(lái)構(gòu)建簡(jiǎn)易“分光”光度計(jì)：光源用白熾燈、激光筆或LED代替[1];單色器使用光柵、DVD或CD光盤(pán)[1];比色皿用試管、試劑瓶等透明玻璃容器[2];檢測(cè)器則使用光電二極管或智能手機(jī)[3]，其中可以用特定顏色的光，如紅光，來(lái)達(dá)到光源和單色器“合并”的“分光”目的[2，4]。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外有大量文獻(xiàn)報(bào)道使用數(shù)碼成像的方法進(jìn)行比色，即在朗伯-比爾定律、RGB色彩空間模型的基礎(chǔ)上，通過(guò)照相機(jī)、手機(jī)，將拍攝的照片輸入到圖像處理軟件中進(jìn)行數(shù)值分析。在測(cè)定物質(zhì)含量上，數(shù)碼成像比色法與分光度法相比，需要選取有代表性的物質(zhì)，例如藍(lán)色的硫酸銅溶液[4]、紫紅色的高錳酸鉀溶液[5]，即具有一定的局限性。不過(guò)，就測(cè)定物質(zhì)含量和理解朗伯-比爾定律的教育目的上來(lái)看，數(shù)碼成像比色法簡(jiǎn)單易理解、價(jià)格低廉且可以利用生活中常見(jiàn)的器材，在中學(xué)課堂或課外探究實(shí)驗(yàn)中都能實(shí)現(xiàn)。

在圖像處理軟件上，ImageJ優(yōu)勢(shì)明顯，是生命科學(xué)領(lǐng)域常用的分析軟件[6，7]。其中插件“readplate”可以在一分鐘內(nèi)讀取96孔微孔板的圖像信息[6]。已有文獻(xiàn)報(bào)道微孔板可以與平板掃描儀配合使用，或直接用LED取代平板掃描儀作為光源[6]。

紫色果蔬如藍(lán)莓、桑葚、紫甘藍(lán)、紫薯等花青素含量豐富，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高?；ㄇ嗨鼐哂袠O強(qiáng)的抗氧化活性，可以有效清除自由基，廣泛應(yīng)用于延緩衰老、保護(hù)大腦和改善視力。且花青素在酸性條件下呈現(xiàn)紅色，堿性條件下呈現(xiàn)黃綠色，可以代替酸堿指示劑判定滴定終點(diǎn)。

中學(xué)化學(xué)實(shí)驗(yàn)要求簡(jiǎn)單、有趣味和啟發(fā)性?；诖?，本文使用LED作為光源，96孔微孔板作為吸收池，手機(jī)采集圖像并用ImageJ軟件進(jìn)行甘藍(lán)中花青素含量的測(cè)定;在酸堿滴定曲線的基礎(chǔ)上，借助高中數(shù)學(xué)一階導(dǎo)數(shù)的簡(jiǎn)單知識(shí)進(jìn)行滴定終點(diǎn)的判定[8]。

二、裝置的構(gòu)建

1.理解原理

利用學(xué)生已有的知識(shí)，如綠色植物呈現(xiàn)綠色是因?yàn)榉瓷渚G光，吸收綠光的互補(bǔ)光，展示自然界中的白光是一種光與其互補(bǔ)光復(fù)合而成;亦可使用office辦公軟件的調(diào)色盤(pán)展示白色由紅、綠、藍(lán)三原色組成[9]。

因此當(dāng)白光通過(guò)一有色溶液時(shí)，溶液吸收的顏色與其本身互為互補(bǔ)色。物質(zhì)與光的相互作用體現(xiàn)在物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收上。當(dāng)強(qiáng)度為I0的光通過(guò)溶液時(shí)，溶液選擇性吸收一部分光，透射另一部分光。吸收光強(qiáng)度和透射光強(qiáng)度之和為入射光強(qiáng)度。

I0=Ia+It吸光度被定義為入射光強(qiáng)度與透射光強(qiáng)度的比值的以10為底的對(duì)數(shù)。

而吸收光強(qiáng)度與溶液濃度、吸收池厚度呈現(xiàn)正比例關(guān)系，因此吸光度可以用來(lái)定量分析溶液濃度，即朗伯-比爾定律。

因此，當(dāng)一束光透過(guò)紅色溶液時(shí)，物質(zhì)將選擇性吸收互補(bǔ)光。通過(guò)軟件分析透射光強(qiáng)度變化，即可獲得吸光度變化。

在酸堿滴定曲線中，臨近終點(diǎn)會(huì)發(fā)生pH的突變，即終點(diǎn)附近的斜率會(huì)陡然增大，在δpH/δV圖像上能觀察到最值[9];如果加入指示劑，可觀察到指示劑顏色的改變，利用軟件所得圖像的強(qiáng)度也會(huì)發(fā)生類似于的突變。故可以收集滴定過(guò)程中的溶液，采集圖像信息，繪制圖像強(qiáng)度的一階導(dǎo)數(shù)圖，從而判定滴定終點(diǎn)。

2.設(shè)計(jì)裝置

由于96孔板是平面裝置，可以直接將其放置在電腦屏幕上，在正上方70厘米處進(jìn)行拍照，如圖1所示。

三、實(shí)驗(yàn)

1.實(shí)驗(yàn)用品

新鮮甘藍(lán)、DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海鴻都電子科技有限公司）、粉碎機(jī)、篩網(wǎng)、Sartorius分析天平、無(wú)水乙醇（AR，成都市科隆化學(xué)品有限公司）、蒸餾水、無(wú)水檸檬酸（AR，成都市科龍化工試劑廠）、錐形瓶、量筒、棕色試劑瓶、96孔微孔板、玻璃比色皿若干、玻璃試劑瓶若干、100-1000μLDragonlab移液槍、燒杯、玻璃棒、7230G可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）、電腦、手機(jī)。

2.實(shí)驗(yàn)過(guò)程（1）樣品的制備

新鮮的甘藍(lán)洗凈，切成小塊后放入烘箱于60°C烘干至恒重[10]。用粉碎機(jī)粉碎、過(guò)篩，裝入樣品袋于干燥處保存。

（2）花青素提取液的制備

稱取1.0000g甘藍(lán)粉末，加入50mL2%檸檬酸-60%無(wú)水乙醇于60°C提取兩小時(shí)。到達(dá)預(yù)定時(shí)間后，過(guò)濾，收集濾液至棕色瓶中保存[10]。

（3）花青素濃度梯度液體的制備

用移液槍移取0-5mL的花青素提取液，分別加入到試劑瓶中，補(bǔ)加蒸餾水至10mL（表1）。

（4）溶液吸光度的測(cè)量打開(kāi)可見(jiàn)分光光度計(jì)，預(yù)熱20min后于波長(zhǎng)525nm處測(cè)定吸光度[10]。（5）手機(jī)比色法測(cè)定樣品吸光度使用PowerPoint制作白色的背景圖，將花青素濃度梯度液體和未知濃度液體一同加入到96孔微孔板中，依照設(shè)計(jì)好的裝置圖擺放樣品，用手機(jī)對(duì)樣品進(jìn)行拍照。將圖片輸入到ImageJ中，打開(kāi)插件“read?plate”，框選左上角第一個(gè)孔至右下角第96個(gè)孔，如圖2所示，設(shè)置采集孔的直徑大?。ú灰诉^(guò)大）和分析的通道[6]，輸出數(shù)據(jù)至Excel中。

（6）氫氧化鈉和鹽酸的滴定

取20mL濃度大約為1mol/L的鹽酸溶液于錐形瓶中，加入蒸餾水至200mL，加入指示劑，用已知濃度的氫氧化鈉進(jìn)行滴定，在特定的滴定體積處取200μL的溶液至96孔微孔板中，平行測(cè)定三組[8]，按照測(cè)定吸光度的方法采集圖像信息。

四、結(jié)果分析

1.甘藍(lán)吸光度分析

如圖3所示，分別使用96孔微孔板和紫外-可見(jiàn)酚酞作為指示劑時(shí)，圖像強(qiáng)度對(duì)體積的導(dǎo)數(shù)度測(cè)量時(shí)，兩者均可以表現(xiàn)出很好的線性關(guān)系，滿足分析的需求，但分光光度計(jì)的斜率明顯大于微孔板所測(cè)，即靈敏度更高。其中，由96孔微孔板計(jì)算所得的未知溶液濃度為2.60mL/10mL，即真實(shí)加樣濃度，當(dāng)使用綠色和藍(lán)色通道分析時(shí)，均可以得到相似的結(jié)果（圖中未展示），紅色通道則不能;紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)所得為2.68mL/10mL，略微偏大。

當(dāng)使用比色皿、玻璃瓶取代微孔板進(jìn)行分析時(shí)，均可以取得很好的線性關(guān)系（R2>0.98），且分析結(jié)果也接近于真實(shí)加樣濃度，即在無(wú)法獲取微孔板時(shí)，便可以使用透光性好的玻璃材料代替。此外，還比較了多種獲取RGB值的方法，如網(wǎng)頁(yè)版的色彩拾取器、截圖時(shí)的對(duì)話框信息，ImageJ點(diǎn)像素分析，結(jié)果表明，使用ImageJ中的插件“ROI”更能獲取穩(wěn)定的分析結(jié)果，且用于分析的區(qū)域位置信息可以以壓縮文件的形式進(jìn)行保存，方便查看和校對(duì)。以上均說(shuō)明數(shù)碼成像比色的適用性強(qiáng)，ImageJ分析方便快速。

2.酸堿滴定終點(diǎn)的判斷

圖4是酚酞作為指示劑進(jìn)行酸堿滴定時(shí)繪制的一階導(dǎo)數(shù)圖像，圖中的最值所對(duì)應(yīng)的體積為21.625mL，因?yàn)镹aOH濃度已知（用鄰苯二甲酸氫鉀標(biāo)定），故可以求得鹽酸的濃度為1.031mol/L。

圖5是甘藍(lán)作為指示劑進(jìn)行酸堿滴定時(shí)繪制的一階導(dǎo)數(shù)圖像，圖中的最值所對(duì)應(yīng)的體積為21.125mL，與酚酞作為指示劑相比偏小。由于酚酞的變色范圍為8.2-10.0，因此，甘藍(lán)作為指示劑能更好地指示滴定終點(diǎn)。

五、反思與展望

本文以甘藍(lán)中的花青素為例，使用96孔微孔板的數(shù)碼成像比色法對(duì)其含量和作為指示劑時(shí)滴定終點(diǎn)的判斷進(jìn)行了探究。含量測(cè)定結(jié)果表明，利用ImageJ圖像分析結(jié)果與紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)所得結(jié)果類似;酸堿滴定實(shí)驗(yàn)中，甘藍(lán)的滴定終點(diǎn)更接近中性溶液。

96孔微孔板價(jià)格便宜，使用電腦屏幕作為光源代替平板掃描儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，同樣可以獲得很好的結(jié)果;實(shí)驗(yàn)中所使用的移液槍可以用1mL的醫(yī)用微量注射器代替，后者便宜且容易獲取，以上均說(shuō)明以96孔微孔板的數(shù)碼成像比色法推廣到中學(xué)實(shí)驗(yàn)中的經(jīng)濟(jì)可行性。

運(yùn)用生活中的材料甘藍(lán)，提取花青素的操作簡(jiǎn)單，運(yùn)用ImageJ分析圖像并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Excel中，操作熟悉時(shí)可在5min內(nèi)完成，即滿足中學(xué)實(shí)驗(yàn)課的時(shí)長(zhǎng)限制。

利用學(xué)生對(duì)綠色植物顏色的已有認(rèn)知以及高中數(shù)學(xué)涉及到的一階導(dǎo)數(shù)知識(shí)，搭建“腳手架”，使學(xué)生逐步接觸到物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收、朗伯-比爾定律，以及加深對(duì)滴定曲線的認(rèn)識(shí)和滴定終點(diǎn)的判斷。即本實(shí)驗(yàn)所涉及到的知識(shí)體現(xiàn)了學(xué)科交融的思想，同時(shí)也在學(xué)生的“最近發(fā)展區(qū)”內(nèi)。

實(shí)驗(yàn)中體現(xiàn)的節(jié)約思想，如從低濃度到高濃度配制濃度梯度溶液，避免多次更換實(shí)驗(yàn)耗材;微量移取液體的操作;使用熟悉的手機(jī)進(jìn)行化學(xué)實(shí)驗(yàn)......以上均可以引導(dǎo)學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行思考，增加實(shí)驗(yàn)過(guò)程的趣味性。

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