蘭清秀 ，柯斌榕 ，盧政輝 **，馬 璐 ，黃晨陽 ，廖劍華

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，福建福州 350013；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081；3.特色食用菌繁育與栽培國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建福州 350013）

菌種是食用菌產(chǎn)業(yè)的“芯片”，相當(dāng)于作物的種苗，菌種質(zhì)量決定著食用菌的品質(zhì)與產(chǎn)量，是影響食用菌經(jīng)濟(jì)效益的關(guān)鍵因素。但是，大多食用菌菌種易發(fā)生退化，造成產(chǎn)量減少甚至不出菇的現(xiàn)象，嚴(yán)重威脅食用菌產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[1-2]。因此，食用菌菌種保藏技術(shù)和菌種質(zhì)量控制越來越受到重視。目前食用菌菌種保藏常用方法有斜面保藏法、草管保藏法和液氮超低溫保藏法[3-8]。有關(guān)雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）、糙皮側(cè)耳 （Pleurotus ostreatus）、草菇（Volvariella volvacea）、靈芝（Ganoderma lingzhi）、杏鮑菇（Pleurotas eryngii）等食用菌菌種保藏研究較多[9-13]。此外，有關(guān)食用菌菌種的保藏方法、保護(hù)基質(zhì)、保護(hù)劑、降溫方式、解凍方式的研究也有大量報(bào)道[14-22]。研究表明，液氮超低溫保藏的效果最好，但是運(yùn)行和維護(hù)成本高，普及性差。除此之外，冰箱4℃斜面保藏也是不錯(cuò)的選擇，設(shè)備運(yùn)行和維護(hù)成本低，被業(yè)內(nèi)廣泛使用。但是，由于不同種類食用菌的生物學(xué)特性不同，對低溫的響應(yīng)存在顯著差異，不同種類的食用菌采用冰箱保藏的效果不同。

秀珍菇（Pleurotus pulmonarius）子實(shí)體含有豐富的營養(yǎng)，包括黃酮、多糖等活性物質(zhì)，可以提高人體免疫力，預(yù)防糖尿病，降血脂，且對酒精肝具有較好的抗氧化和保護(hù)作用，還可以輔助患者進(jìn)行腫瘤化療等[23-31]。近年，消費(fèi)者對秀珍菇的接受程度越來越高，消費(fèi)量逐年上升，2019年全國秀珍菇總產(chǎn)量超過30萬噸，比上年增長20.27%[32]。然而，菌種質(zhì)量穩(wěn)定性差導(dǎo)致秀珍菇在出菇時(shí)常發(fā)生減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)，菌種質(zhì)量成為限制秀珍菇產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要問題。

食用菌生產(chǎn)中采用冰箱4℃保藏極具普遍性。冰箱4℃保藏條件下，篩選合適的培養(yǎng)基是提高菌種保藏效果的重要手段，由于合成培養(yǎng)基成分相對比較單一，半合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基是保藏菌種的優(yōu)先選擇。其中，半合成培養(yǎng)基保藏時(shí)間較短，一般為3個(gè)月～6個(gè)月；天然培養(yǎng)基保藏時(shí)間較長，一般1年～3年[33]。目前，有關(guān)使用半合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基4℃保藏秀珍菇菌種的研究尚未見報(bào)道。因此，通過使用不同配方的半合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基4℃保藏秀珍菇菌種，研究其對菌種萌發(fā)時(shí)間、萌發(fā)率、菌絲體生長速度及出菇表現(xiàn)等的影響，具有重要的科學(xué)和產(chǎn)業(yè)指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

秀珍菇菌株，編號(hào)Y710-14，保藏于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所；從保藏管中取出后，經(jīng)PDA培養(yǎng)基活化2次后使用。

1.1.2 半合成培養(yǎng)基

為了驗(yàn)證可溶性淀粉和酵母粉對秀珍菇菌種中、短期保藏的效果，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則設(shè)置了4種處理，每個(gè)處理的具體配方如下。

1）馬鈴薯瓊脂葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g、瓊脂粉20 g、葡萄糖20 g，水1 000 mL。

2）馬鈴薯瓊脂葡萄糖+淀粉培養(yǎng)基（PDSA）：馬鈴薯200 g、瓊脂粉20 g、葡萄糖20 g、可溶性淀粉5 g，水1 000 mL。

3）馬鈴薯瓊脂葡萄糖+酵母培養(yǎng)基（PDYA）：馬鈴薯200 g、瓊脂粉20 g、葡萄糖20 g、酵母粉5 g，水 1 000 mL。

4）馬鈴薯瓊脂葡萄糖+酵母+淀粉培養(yǎng)基（PDSYA）：馬鈴薯200 g、瓊脂粉20 g、葡萄糖20 g、酵母粉2.5 g、可溶性淀粉2.5 g，水1 000 mL。

1.1.3 天然培養(yǎng)基

為了對比雜木屑、棉籽殼含量及麥粒對秀珍菇菌種的中期保藏效果，根據(jù)pH和含水量適宜原則，設(shè)置了5種處理，每個(gè)處理的具體配方如下。

1）F1：雜木屑80%、麩皮14%、棉籽殼5%、輕質(zhì)碳酸鈣1%，含水量60%～63%。

2）F2：雜木屑60%、麩皮14%、棉籽殼25%、輕質(zhì)碳酸鈣1%，含水量60%～63%。

3）F3：雜木屑40%、麩皮14%、棉籽殼45%、輕質(zhì)碳酸鈣1%，含水量60%～63%。

4）F4：雜木屑10%、麩皮10%、棉籽殼79%、輕質(zhì)碳酸鈣1%，含水量60%～63%。

5）F5：雜木屑22%、麥粒75%、輕質(zhì)碳酸鈣2%、石膏1%，含水量60%～63%。

1.1.4 出菇菌袋配方

雜木屑60%、棉籽殼35%、麩皮3%、輕質(zhì)碳酸鈣1%、石膏1%，含水量60%～63%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 半合成培養(yǎng)基保藏法

1）母種保藏：將活化好的秀珍菇菌塊分別接于PDA、PDSA、PDYA、PDSYA培養(yǎng)基的試管（試管規(guī)格：直徑18 mm，長180 mm）斜面中，25℃培養(yǎng)，待菌絲滿管后，用自封袋裝好，置于冰箱4℃保藏，設(shè)置3個(gè)月、9個(gè)月、12個(gè)月、18個(gè)月共4個(gè)保藏時(shí)間。

2）原種擴(kuò)繁：按時(shí)取出母種接種至PDA平板中，觀察并記錄其萌發(fā)率、萌發(fā)時(shí)間、菌絲生長速度。其中菌絲生長速度以平板中菌絲直徑日增長量計(jì)算，每個(gè)處理重復(fù)5次。

1.2.2 天然培養(yǎng)基保藏法

1）母種保藏：將活化好的秀珍菇菌塊分別接于T1～T5不同配方的試管（試管規(guī)格：直徑20 mm，長200 mm）中，做好標(biāo)記并于25℃培養(yǎng)，待菌絲長滿，用自封袋裝好，置于冰箱4℃保藏，設(shè)置保藏時(shí)間為12個(gè)月、18個(gè)月。

2）原種擴(kuò)繁：按時(shí)取出母種，接種至天然培養(yǎng)基培養(yǎng)，待菌種萌發(fā)、生長至試管約1/3時(shí)，劃線測定菌絲生長速度、培養(yǎng)基的含水量和pH。其中菌絲生長速度以試管中菌絲直徑日增長量計(jì)算，每個(gè)處理重復(fù)5次。

1.2.3 出菇管理

1）栽培種擴(kuò)繁：采用不同的培養(yǎng)基保藏母種1年，將其活化、轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基，擴(kuò)大培養(yǎng)成原種，再轉(zhuǎn)接成栽培種。具體方法為，采用17 cm×33 cm×0.008 cm聚乙烯袋，121℃滅菌120 min。接種后，置于25℃培養(yǎng)，待菌絲萌發(fā)、生長至菌袋約1/3時(shí)，劃線測定菌絲生長速度，并觀察菌絲長勢情況。其中菌絲生長速度以菌包中菌絲直徑日增長量計(jì)算。

2）出菇：菌絲長滿菌袋后進(jìn)行后熟管理，20℃后熟15 d；置于人工氣候箱，10℃溫差處理48 h；出菇管理于溫度23℃、相對濕度90%～95%的條件下進(jìn)行。觀察并記錄現(xiàn)蕾時(shí)間、出菇率和第一潮菇產(chǎn)量，每個(gè)處理重復(fù)10次。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用Excel 2007、DPS 7.05進(jìn)行記錄和差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 半合成培養(yǎng)基保藏法對秀珍菇原種的影響

采用不同配方的半合成培養(yǎng)基保藏秀珍菇母種3個(gè)月、9個(gè)月、12個(gè)月和18個(gè)月，進(jìn)行菌種活化，觀察其菌絲萌發(fā)情況。發(fā)現(xiàn)除了在PDYA和PDSYA培養(yǎng)基保藏18個(gè)月后的原種的萌發(fā)率為0，其余處理萌發(fā)率均為100%。在不同配方的半合成培養(yǎng)基上原種菌絲的生長速度見圖1。

圖1 半合成培養(yǎng)基保藏法對秀珍菇原種菌絲生長速度的影響Fig.1 Effects of semi-synthetic medium preservation methods on the growth rate of mycelium of Pleurotus pulmonarius mother spawn

如圖1所示，4℃保藏菌種3個(gè)月～18個(gè)月，不同配方的半合成培養(yǎng)基保藏秀珍菇母種后產(chǎn)生的效果不同。保藏3個(gè)月時(shí)，無顯著性影響；保藏9個(gè)月時(shí)，用PDSA、PDYA和PDSYA培養(yǎng)基保藏的原種菌絲生長速度顯著快于PDA；保藏12個(gè)月時(shí)，PDYA和PDSYA培養(yǎng)基保藏的原種菌絲生長速度顯著慢于PDA與PDSA；保藏18個(gè)月時(shí)，影響最顯著，用PDSA保藏的原種菌絲生長速度最快，PDA次之。

2.2 天然培養(yǎng)基保藏法對秀珍菇原種的影響

采用不同配方的天然培養(yǎng)基保藏秀珍菇母種12個(gè)月、18個(gè)月后，進(jìn)行菌種活化，觀察其菌絲萌發(fā)情況。結(jié)果表明，秀珍菇原種在試驗(yàn)的5個(gè)天然培養(yǎng)基配方上均能萌發(fā)。原種菌絲生長速度的測定結(jié)果見圖2；培養(yǎng)基含水量及pH測定結(jié)果見表1。

圖2 不同天然培養(yǎng)基配方保藏對秀珍菇原種菌絲生長速度的影響Fig.2 Effects of different natural medium preservation methods on the growth rate of mycelium of Pleurotus pulmonarius mother spawn

表1 保藏秀珍菇母種后天然培養(yǎng)基的含水量和pHTab.1 The water content and pH of natural medium after preserving the stock culture of Pleurotus pulmonarius

如圖2和表1所示，用以木屑和棉籽殼為主要原料的天然培養(yǎng)基F1和F2配方保藏12個(gè)月和18個(gè)月，轉(zhuǎn)接活化后對原種菌絲生長的影響無顯著性差異，培養(yǎng)基的含水量和pH范圍正常。以麥粒為主的F5配方，母種轉(zhuǎn)接后，原種的菌絲生長速度最慢，與其他4個(gè)配方有顯著性差異。分別比較5個(gè)配方保藏12個(gè)月和18個(gè)月的母種，轉(zhuǎn)接后原種在同樣的天然培養(yǎng)基上菌絲生長速度無顯著性差異。

2.3 不同保藏方式對秀珍菇栽培種的影響

半合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基2種方式保藏秀珍菇母種12個(gè)月后，對栽培種菌絲體和出菇的影響見表2。

表2 不同培養(yǎng)基保藏母種12個(gè)月后秀珍菇栽培種的生長情況Tab.2 The growth of spawn of Pleurotus pulmonarius after preserving the stock culture in different medium for one year

如表2所示，經(jīng)采用不同配方的半合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基4℃保藏的秀珍菇Y(jié)710-14母種，經(jīng)活化后接入栽培袋，栽培種均能形成原基并出菇。采用4種半合成培養(yǎng)基保藏后的栽培種菌絲生長速度無顯著性差異，出菇率均為100%；PDYA保藏后的栽培種菌絲生長速度最快，粗壯濃白，但現(xiàn)蕾時(shí)間晚于其他3種培養(yǎng)基；PDSYA保藏后的栽培種菌絲生長勢稍弱于其他3種培養(yǎng)基。采用天然培養(yǎng)基保藏母種后，F(xiàn)4配方的栽培種菌絲生長速度較慢，與其他4種配方有顯著性差異，第一潮鮮菇單袋產(chǎn)量也最低，菌絲生長勢與F1栽培種均較弱；F5配方的栽培種菌絲生長速度稍快，但與F1～F3配方無顯著性差異，菌包出菇率低于其他配方，為83.3%，其余4個(gè)配方出菇率均為100%；F1配方現(xiàn)蕾時(shí)間最長，為72 h～96 h；F2配方第一潮鮮菇單袋產(chǎn)量最高，為32.83 g/袋。

3 結(jié)論與討論

半合成培養(yǎng)基制作簡單，營養(yǎng)成分清晰；天然培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，但含有許多未知營養(yǎng)成分。采用PDA培養(yǎng)基、冰箱4℃保藏的方式適合大多數(shù)食用菌，但需3個(gè)月～6個(gè)月轉(zhuǎn)管1次，轉(zhuǎn)接頻繁，易導(dǎo)致菌種發(fā)生變異[34-36]。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，冰箱4℃條件下保藏秀珍菇Y(jié)710-14母種，保藏3個(gè)月、9個(gè)月，原種于24 h內(nèi)萌發(fā)，且菌絲形態(tài)正常，粗壯濃白；保藏12個(gè)月，PDA和PDSA菌種48 h內(nèi)萌發(fā)，PDYA和PDYSA菌種72 h內(nèi)萌發(fā)；保藏18個(gè)月，PDA和PDSA菌種72 h內(nèi)萌發(fā)，PDYA和PDYSA菌種未萌發(fā)。由此推斷秀珍菇Y(jié)710-14菌株用PDA和PDSA培養(yǎng)基于冰箱4℃保藏，18個(gè)月內(nèi)種性保持較穩(wěn)定，秀珍菇在冰箱半合成培養(yǎng)基上的保藏時(shí)間比大多食用菌種類長。以雜木屑和棉籽殼為主料，麩皮、輕質(zhì)碳酸鈣為輔料的天然培養(yǎng)基，雖然在不同配方中含量比例不同，但都能用于秀珍菇菌種的保藏；且在保藏12個(gè)月和18個(gè)月后，秀珍菇Y(jié)710-14原種菌絲的生長速度無顯著性差異；說明秀珍菇菌種對棉籽殼和木屑天然培養(yǎng)基配方的比例適用范圍較廣。以麥粒為主的配方，雖然也能保藏秀珍菇菌種，但母種轉(zhuǎn)接后原種的菌絲生長速度顯著慢于其他保藏配方；且菌種發(fā)生了收縮，輕微出黃水，退化現(xiàn)象較明顯；因此，在保藏秀珍菇菌種時(shí)，不建議選擇以麥粒為主的天然培養(yǎng)基。

PDYA及PDSYA培養(yǎng)基保藏秀珍菇Y(jié)710-14菌種9個(gè)月后，原種菌絲生長速度比PDA更快，肉眼看菌絲生長最旺盛；說明酵母粉可促進(jìn)秀珍菇菌絲生長，這與馮志勇等[37]的研究結(jié)果一致。但母種保藏至第18個(gè)月，原種未萌發(fā)；推斷因?yàn)樘砑恿私湍阜?，培養(yǎng)基營養(yǎng)更豐富，導(dǎo)致Y710-14菌種菌絲生長代謝過快，造成退化現(xiàn)象；說明氮源營養(yǎng)較豐富的培養(yǎng)基不能用于秀珍菇菌種的中、長期保藏，應(yīng)選擇營養(yǎng)相對貧瘠的培養(yǎng)基，以降低菌種生長代謝速度，這一結(jié)果與前人研究一致[38]?？扇苄缘矸凼窃耘嘈阏涔捷^好的碳素來源，試驗(yàn)結(jié)果表明，PDSA培養(yǎng)基保藏的菌種活化后菌絲生長速度與PDA培養(yǎng)基保藏的效果相當(dāng)；保藏至18個(gè)月，PDSA培養(yǎng)基保藏的菌種活化后菌絲生長速度快于PDA培養(yǎng)基保藏。PDSA培養(yǎng)基保藏12個(gè)月后，第一潮菇的鮮重優(yōu)于PDA保藏。

食用菌菌種保藏的目標(biāo)是保持菌種種性的穩(wěn)定；最大限度降低菌種的代謝強(qiáng)度，抑制菌絲的生長和繁殖，減少退化和變異的產(chǎn)生，從而保持菌種原有特性，方便用于后續(xù)的研究與生產(chǎn)；同時(shí)也應(yīng)考慮保藏方法的簡便經(jīng)濟(jì)[38-39]。根據(jù)這個(gè)原則，結(jié)合秀珍菇Y(jié)710-14保藏時(shí)間、菌絲長勢和生長速度、出菇表現(xiàn)等進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)中、短期保藏秀珍菇Y(jié)710-14菌株時(shí)，12個(gè)月內(nèi)可采用PDA培養(yǎng)基，18個(gè)月內(nèi)建議使用以木屑和棉籽殼為主料的天然培養(yǎng)基。

試驗(yàn)雖然探究了多種培養(yǎng)基配方對保藏秀珍菇Y(jié)710-14菌株的影響，但仍需設(shè)計(jì)其他試驗(yàn)方案進(jìn)行更深入的研究。1）后續(xù)可設(shè)計(jì)多個(gè)菌株的對比試驗(yàn)，探究不同配方培養(yǎng)基保藏不同菌株的影響情況。2）在測定指標(biāo)上除了觀察、對比菌種的形態(tài)特征、生長速度和出菇表現(xiàn)等，還可增加樣本量，借助生理生化及分子生物學(xué)技術(shù)，測定菌種保藏后遺傳物質(zhì)的差異情況[40-41]，提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，綜合鑒定保藏菌種的穩(wěn)定性，以及后續(xù)生產(chǎn)或研究中的可行性。3）研究碳源和氮源等營養(yǎng)物質(zhì)對秀珍菇菌種影響的機(jī)理。4）進(jìn)一步深入研究采用PDA、PDSA及天然培養(yǎng)基保藏秀珍菇菌種時(shí)，時(shí)間與栽培、生產(chǎn)情況等之間的關(guān)系。