盛立柱，葉松梅，葉曉菊，何建芬，文冬華，孫孔蘭，林火松

（1.龍泉市食藥用菌產(chǎn)業(yè)辦公室，浙江 龍泉 323700；2.浙江雙益菇業(yè)有限公司，浙江 龍泉 323700）

黑木耳（Auricularia heimuer F.Wu，B.K.Cui&Y.C.Dai），隸屬于擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）木耳目 （Auriculariaceae）木耳科 （Auriculariaceae）木耳屬（Auricularia），別稱黑耳、云耳、樹耳等[1]。黑木耳味道獨(dú)特，嫩口爽滑，營(yíng)養(yǎng)豐富，被現(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)學(xué)家譽(yù)為“素中之葷”，世界上稱之為“中餐中的黑色瑰寶”[2]，兼具食（藥）用價(jià)值，具有提高免疫力、抗凝血和抗腫瘤等保健效果和藥用功效，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富、味道鮮美且口感松脆，深受消費(fèi)者喜愛[3]。

隨著集約化、機(jī)械化生產(chǎn)規(guī)模的日益擴(kuò)大，以及黑木耳產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)的需求提升，液體菌種生產(chǎn)制作技術(shù)成為食用菌企業(yè)、合作社、菇農(nóng)等的迫切需求，故對(duì)黑木耳液體菌種培養(yǎng)基配方進(jìn)行篩選優(yōu)化試驗(yàn)，可為黑木耳產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：選用的黑木耳菌種“黑山”來自龍泉市張良明菌種場(chǎng)。

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g（去皮煮汁）、麩皮（煮汁）40 g、葡萄糖20 g、硫酸鎂1 g、磷酸二氫鉀2 g、瓊脂20 g，加水至1 L[4]。

液體培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g、麩皮30 g、碳源25 g、氮源25 g、磷酸二氫鉀2 g、硫酸鎂2 g、VB 10 mg，加純凈水至1 L，pH自然。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 母種制備

在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行操作，挑取黑木耳木粒種，接種于PDA試管中，于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)避光培養(yǎng)。待菌絲長(zhǎng)滿2/3試管斜面后，挑取邊緣2/3處，直徑為5 mm的菌塊轉(zhuǎn)接于PDA平皿中進(jìn)行擴(kuò)繁。繼續(xù)于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)避光培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿平皿后待用。

1.2.2 液體菌種培養(yǎng)方法

向250 mL搖瓶中加入100 mL液體培養(yǎng)基，接入6塊直徑5 mm大小的菌種塊，置于25℃恒溫?fù)u床中，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)6 d。

1.2.3 黑木耳菌絲體生物量測(cè)定

將培養(yǎng)好的菌絲體裝入離心管，于4 000 r·min-1離心機(jī)內(nèi)離心5 min，85℃條件下烘干至恒重，記錄黑木耳菌絲體生物量，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析[5]。

1.2.4 不同碳源試驗(yàn)

分別以葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、玉米粉為碳源（2.5 g），以蛋白胨為氮源（2.5 g），其他成分不變（去皮馬鈴薯20 g、麩皮3 g、磷酸二氫鉀0.2 g、硫酸鎂0.2 g、VB 10 mg），配制供試培養(yǎng)基。于250 mL搖瓶中加入100 mL供試液體培養(yǎng)基，0.12 MPa、121℃高壓蒸汽滅菌30 min。參照參考文獻(xiàn)[6]的方法，待壓力降至0時(shí)，取出供試液體培養(yǎng)基，冷卻至室溫。在超凈工作臺(tái)內(nèi)取6塊直徑5 mm的活化母種塊，接種于搖瓶?jī)?nèi)。后續(xù)試驗(yàn)方法同1.2.2，培養(yǎng)6 d后測(cè)量菌絲體生物量。以不加碳源的培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.5 不同氮源試驗(yàn)

分別以蛋白胨、酵母粉、麩皮、豆粕、硫酸銨為氮源（2.5 g），以葡萄糖為碳源（2.5 g），其余成分不變（去皮馬鈴薯20 g、麩皮3 g、磷酸二氫鉀0.2 g、硫酸鎂0.2 g、VB 10 mg），配制供試培養(yǎng)基。以不加氮源的培養(yǎng)基為對(duì)照，試驗(yàn)方法同1.2.4。

1.2.6 無機(jī)鹽配比試驗(yàn)

選用最佳碳源、最佳氮源，使用磷酸二氫鉀和硫酸鎂分別設(shè)置3個(gè)添加量配比。配比1為磷酸二氫鉀0.2%、硫酸鎂0.1%（比例為2∶1）；配比2為磷酸二氫鉀0.3%、硫酸鎂0.3%（比例為1∶1）；配比3為磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.2%（比例為1∶2）。試驗(yàn)方法同1.2.2，每個(gè)配比3次重復(fù)。

1.2.7 培養(yǎng)基配方優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選用最佳碳源、最佳氮源、硫酸鎂和磷酸二氫鉀為影響因子，采用L9（34）法進(jìn)行正交試驗(yàn)。接種量5%、25℃、150 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)6 d，測(cè)量黑木耳菌絲體生物量，確定黑木耳液體培養(yǎng)基最優(yōu)配方。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.8 搖床培養(yǎng)溫度試驗(yàn)

以篩選出的最優(yōu)碳源、氮源、無機(jī)鹽比例配制好供試培養(yǎng)基，接種量5%，搖床轉(zhuǎn)速150 r·min-1，培養(yǎng)溫度設(shè)置23℃、24℃、25℃共3個(gè)試驗(yàn)處理。每個(gè)處理3次重復(fù)，培養(yǎng)6 d。

1.2.9 搖瓶培養(yǎng)天數(shù)試驗(yàn)

試驗(yàn)以篩選的碳源、氮源和無機(jī)鹽比例配置供試培養(yǎng)基。接種量5%，最優(yōu)培養(yǎng)溫度為1.2.8中篩選所得，150 r·min-1進(jìn)行搖床培養(yǎng)，試驗(yàn)設(shè)置為培養(yǎng)3 d、4 d、5 d、6 d共4個(gè)試驗(yàn)處理，試驗(yàn)方法同1.2.2，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.10 搖床轉(zhuǎn)速試驗(yàn)

試驗(yàn)以最佳的碳源、氮源和無機(jī)鹽比例配置好供試培養(yǎng)基，接種量5%，按25℃培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)置 140 r·min-1、150 r·min-1、 160 r·min-1，3 個(gè)處理，培養(yǎng)6 d，試驗(yàn)方法同1.2.2，每個(gè)處理3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對(duì)黑木耳菌絲生物量的影響

不同碳源對(duì)黑木耳菌絲生物量的影響見表1。

表1 不同碳源對(duì)黑木耳菌絲生物量的影響Tab.1 Effect of different carbon source on mycelial biomass of Auricularia heimuer

由表1可知，以玉米粉為碳源的試驗(yàn)組菌絲生物量最高，平均達(dá)到1 630 mg·100-1mL-1；其次是麥芽糖、蔗糖，菌絲生物量分別達(dá)450 mg·100-1mL-1、313.33 mg·100-1mL-1；幾種碳源對(duì)黑木耳菌絲生物量影響的排序依次為玉米粉＞麥芽糖＞蔗糖＞果糖＞葡萄糖；其中葡萄糖和果糖效果較差，低于對(duì)照。

2.2 不同氮源對(duì)黑木耳菌絲生物量的影響

不同氮源對(duì)黑木耳菌絲生物量的影響見表2。

表2 不同氮源對(duì)黑木耳菌絲生物量的影響Tab.2 Effect of different nitrogen source on mycelial biomass of Auricularia heimuer

由表2可知，以豆粕為碳源的試驗(yàn)組黑木耳菌絲生物量最高，平均達(dá)到1 930 mg·100-1mL-1；其次是酵母粉、麩皮，菌絲生物量達(dá)740 mg·100-1mL-1、720 mg·100-1mL-1；幾種氮源對(duì)黑木耳菌絲生物量影響的排序依次為豆粕＞酵母粉＞麩皮＞蛋白胨＞硫酸銨；其中只有硫酸銨效果較差，低于對(duì)照。

2.3 無機(jī)鹽配比對(duì)黑木耳菌絲生物量的影響

不同無機(jī)鹽配比對(duì)黑木耳菌絲生物量的影響結(jié)果見表3。

表3 不同無機(jī)鹽添加量及配比對(duì)黑木耳菌絲生物量的影響Tab.3 Effect of different addictive amount ratio of inorganic on mycelial biomass of Auricularia heimuer

由表3可以看出，磷酸二氫鉀和硫酸鎂比例為1∶1時(shí)，黑木耳菌絲生物量最高，平均達(dá)218.33 mg·100-1mL-1；其次是比例為 2∶1時(shí)；比例為 1∶2時(shí)，黑木耳菌絲生物量最低。

2.4 黑木耳液體菌種培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用L9（34）設(shè)計(jì)，選用最佳碳源、最佳氮源、硫酸鎂和磷酸二氫鉀為因子，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平見表4，優(yōu)化結(jié)果見表5。

表4 正交試驗(yàn)因素和水平Tab.4 Factors and levels of orthogonal experiment

表5 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Rusult of orthogonal test

由表5可知，在4個(gè)單因子之間，對(duì)黑木耳菌絲生物量的影響排序依次為A＞B＞D＞C；玉米粉影響最大，其次是豆粕、硫酸鎂，磷酸二氫鉀影響最小。從正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出各因素水平的較理想培養(yǎng)基配方為A3B2C1D2。培養(yǎng)6天后菌絲生物量達(dá)296.28 mg·100-1mL-1，結(jié)果較理想。

2.5 搖床培養(yǎng)溫度試驗(yàn)

搖床培養(yǎng)溫度試驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 搖床培養(yǎng)溫度試驗(yàn)Tab.6 Temperature test of shake cultivation

由表6可知，25℃搖床培養(yǎng)時(shí)，黑木耳菌絲生物量最大，為330.2 mg·100-1mL-1；其次是23℃搖床培養(yǎng)時(shí)，黑木耳菌絲生物量達(dá)319.30 mg·100-1mL-1；24℃搖床培養(yǎng)時(shí)，黑木耳菌絲生物量最小，為288.60 mg·100-1mL-1；各溫度對(duì)黑木耳菌絲體生物量影響排序依次25℃＞23℃＞24℃；但試驗(yàn)所設(shè)溫度對(duì)搖瓶黑木耳菌絲生物量影響不大，無顯著差異。

2.6 搖床培養(yǎng)天數(shù)試驗(yàn)

搖床培養(yǎng)天數(shù)試驗(yàn)結(jié)果見表7。

表7 搖床培養(yǎng)天數(shù)試驗(yàn)Tab.7 Test of shake cultivation for different days

由表7可知，搖床培養(yǎng)黑木耳液體菌種，培養(yǎng)6 d菌絲生物量最高，平均達(dá)393.23 mg·100-1mL-1；其次是培養(yǎng)5 d和4 d；培養(yǎng)3 d，黑木耳菌絲生物量最低，平均為148.30 mg·100-1mL-1。培養(yǎng)天數(shù)對(duì)黑木耳菌絲生物量影響排序依次為6 d＞5 d＞4 d＞3 d；其中培養(yǎng)3 d和4 d黑木耳的菌絲生物量差異不顯著；培養(yǎng)5 d和6 d黑木耳菌絲生物量差異不顯著；培養(yǎng)3 d、4 d與培養(yǎng)5 d、6 d間黑木耳菌絲生物量差異顯著。搖床培養(yǎng)5 d和6 d對(duì)黑木耳菌絲生物量影響較大。

2.7 搖床轉(zhuǎn)速試驗(yàn)

搖床轉(zhuǎn)速試驗(yàn)結(jié)果見表8。

表8 搖床轉(zhuǎn)速試驗(yàn)Tab.8 Rotating speed of shaking table

由表8可以看出，在3個(gè)搖床轉(zhuǎn)速處理中，對(duì)黑木耳菌絲生物量的影響排序依次為160 r·min-1＞150 r·min-1＞140 r·min-1；其中，160 r·min-1影響最大，黑木耳菌絲生物量達(dá)350.73 mg·100-1mL-1；其次是 150 r·min-1；140 r·min-1影響最小，菌絲生物量達(dá)287.70 mg·100-1mL-1。在設(shè)置的3個(gè)轉(zhuǎn)速處理試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)速對(duì)黑木耳菌絲生物量的影響不大，無顯著差異。

3 小結(jié)

從試驗(yàn)結(jié)果中可以看出碳源是影響黑木耳液體菌種菌絲生物量的重要因素。不同碳源對(duì)黑木耳液體菌種菌絲生物量影響程度不同，其中多糖＞雙糖＞單糖。黑木耳液體菌種制作較適宜的碳源為玉米粉。

氮源為食用菌細(xì)胞生長(zhǎng)必不可少的營(yíng)養(yǎng)，可促進(jìn)蛋白質(zhì)和核酸的合成[7]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同氮源對(duì)黑木耳液體菌種菌絲生物量影響程度不同，其中有機(jī)氮＞無機(jī)氮。黑木耳液體菌種制作較適宜的氮源為豆粕、酵母粉和麩皮。

硫酸鎂是食用菌合成氨基酸過程中重要的酶激活劑；磷酸鹽在培養(yǎng)基中起到緩沖作用；磷是蛋白質(zhì)、核酸和細(xì)胞膜的重要組成部分[8]。因此不同無機(jī)鹽比例對(duì)黑木耳液體菌種菌絲生物量影響不同，磷磷酸二氧鉀與硫酸鎂的比例為1∶1時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果較理想。

不同碳源、氮源、無機(jī)鹽比例，直接影響著黑木耳液體菌種的菌絲生物量。試驗(yàn)結(jié)果顯示，玉米粉對(duì)黑木耳液體菌種菌絲生物量影響最大；其次是豆粕、硫酸鎂；磷酸二氫鉀影響最小。正交試驗(yàn)結(jié)果顯示適宜的培養(yǎng)基配比為：玉米粉2.5 g·L-1、豆粕2.0 g·L-1、硫酸鎂 0.2 g·L-1、磷酸二氫鉀 0.3 g·L-1。

培養(yǎng)條件是黑木耳液體菌種制作的關(guān)鍵，不同培養(yǎng)條件對(duì)黑木耳菌絲生物量的影響不同。培養(yǎng)溫度25℃時(shí)對(duì)黑木耳液體菌種菌絲生物量影響最大，但各溫度試驗(yàn)處理對(duì)黑木耳菌絲生物量影響差異不顯著；培養(yǎng)5 d和6 d的黑木耳液體菌種菌絲生物量和培養(yǎng)3 d和4 d的黑木耳液體菌種菌絲生物量差異顯著，較理想的培養(yǎng)天數(shù)為5 d～6 d；搖床培養(yǎng)轉(zhuǎn)速160 r·min-1時(shí)，黑木耳液體菌種菌絲生物量最大，但試驗(yàn)設(shè)置的3個(gè)轉(zhuǎn)速處理對(duì)黑木耳液體菌種菌絲生物量影響差異不顯著。

液體菌種具有生產(chǎn)周期短、菌齡一致[9]、菌種純度高、省工、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，大大提升了黑木耳生產(chǎn)效益，故黑木耳液體菌種生產(chǎn)技術(shù)越來越受歡迎，試驗(yàn)對(duì)黑木耳液體菌種培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，但培養(yǎng)條件對(duì)菌絲生物學(xué)活性的影響機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。