酸價的特異性檢測方法
——銅皂絡(luò)合比色技術(shù)的研究進(jìn)展

曹文明， 薛 斌, 屠炳芳

(1.上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海食品快速檢測工程技術(shù)研究中心，上海 200093； 2.豐益(上海)生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司，上海 200137； 3.月旭科技(上海)股份有限公司，上海 201613； 4.貝雷(上海)生物科技有限公司，上海 201203)

酸價(acid value，AV)反映油脂中游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)含量，是油脂最重要的質(zhì)量等級指標(biāo)之一，也是食用油脂和含油食品的安全指標(biāo)。自1940年美國油脂化學(xué)家學(xué)會(American Oil Chemists Society, AOCS)頒布酸堿中和滴定法測定酸價以來，該酸價測定方法相繼被全球各標(biāo)準(zhǔn)化組織采用。由于酸堿中和滴定技術(shù)無法區(qū)分非FFA的有機(jī)酸和無機(jī)酸[1]，是FFA的非特異性檢測方法，當(dāng)應(yīng)用于含油食品等復(fù)雜基質(zhì)的酸價測定時，酸價正偏差的檢測結(jié)果極大地困擾食品行業(yè)。對于特異性定量測定FFA的技術(shù)，較系統(tǒng)的研究報道僅限于金屬絡(luò)合法，其中最具代表性的是銅皂絡(luò)合比色法，其技術(shù)雛形始于20世紀(jì)50年代。近70年來，因?qū)︺~皂絡(luò)合理論的認(rèn)識局限，以及高毒試劑、顯色穩(wěn)定性等技術(shù)瓶頸，銅皂絡(luò)合比色法在定量檢測油脂F(xiàn)FA、評價脂肪酶活性、脂質(zhì)代謝等領(lǐng)域的應(yīng)用受到限制。直到2020年，銅皂絡(luò)合顯色理論取得了新的進(jìn)展，突破了長期存在的絡(luò)合顯色技術(shù)瓶頸，形成了具有高度特異性和穩(wěn)定性的新銅皂絡(luò)合比色法。本文旨在針對酸價測定的酸堿中和滴定技術(shù)的共性和非特異性的局限，闡述特異性測定FFA技術(shù)中最具代表性的銅皂絡(luò)合比色法的技術(shù)演變和創(chuàng)新發(fā)展歷程，展望新銅皂絡(luò)合比色法在突破若干技術(shù)瓶頸后的應(yīng)用優(yōu)勢，為準(zhǔn)確定量復(fù)雜基質(zhì)中FFA或酸價測定提供一種理想的特異性方法。

1 現(xiàn)行油脂酸價檢測技術(shù)概況

1.1 酸價的本質(zhì)內(nèi)涵

酸價，也稱酸值，是指中和1 g油脂中所有的FFA所需消耗的氫氧化鉀(KOH)的質(zhì)量(毫克)[1]，可反映油脂受脂肪酶等催化發(fā)生氧化水解反應(yīng)的程度。制油過程中，動植物油料的天然細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，同時釋放出脂肪酶混合于油脂中，使油脂在加工和儲存過程中可能不斷地發(fā)生氧化水解反應(yīng)產(chǎn)生FFA[2-4]。油脂中FFA總含量高，會造成油脂的煙點(diǎn)降低、氧化劣變加快、營養(yǎng)成分破壞、不良?xì)馕兜蓉?fù)面作用。FFA總含量是反映油脂氧化水解酸敗[5]最直接的標(biāo)志，酸價既是食用動植物油脂及制品重要的安全指標(biāo)[6-9]，也是食用植物油產(chǎn)品分級的主要質(zhì)量指標(biāo)之一。

酸價僅當(dāng)表示油脂中FFA百分含量時與酸度同義，但單位不同。在我國國家標(biāo)準(zhǔn)中，其他酸度、脂肪酸值等概念都與酸價含義無關(guān)，如表1所示。

表1 國家標(biāo)準(zhǔn)中與酸價易混淆的概念

續(xù)表1

1.2 酸價測定的滴定技術(shù)共性與非特異性局限

目前國際上酸價或FFA總含量檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法[1，10，15-18]，無一例外都采用了酸堿中和滴定技術(shù)，詳見表2。

表2 酸價和FFA總含量測定的標(biāo)準(zhǔn)方法

酸堿中和滴定檢測技術(shù)分為3種：冷溶劑指示劑滴定、熱乙醇指示劑滴定和冷溶劑自動電位滴定。AOCS Cd 3d-63、AOCS Ca 5a-40、AOAC 940.28和AOAC 969.17在其各自的應(yīng)用范圍內(nèi)只規(guī)定了冷溶劑指示劑滴定檢測技術(shù)；而ISO 660：2020卻同時采用了這3種滴定技術(shù)，并規(guī)定了冷溶劑指示劑滴定檢測技術(shù)和冷溶劑自動電位滴定技術(shù)均為參考方法。我國現(xiàn)行的酸價檢測食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 5009.229—2016)與ISO 660:2020的技術(shù)同步而應(yīng)用范圍各異[10]。

酸堿中和滴定不是FFA的特異性檢測技術(shù)，根據(jù)酸堿中和滴定技術(shù)的基本原理[19]，油脂中所有的酸性強(qiáng)度大于或接近于FFA酸性強(qiáng)度的有機(jī)酸類物質(zhì)和無機(jī)酸類物質(zhì)，都會在滴定時與標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液中的KOH或NaOH發(fā)生酸堿中和反應(yīng)，導(dǎo)致酸價檢測結(jié)果偏高。

酸堿滴定技術(shù)的非特異性弊端，對于食用動植物油脂的酸價測定影響并不大，因?yàn)橐话闱闆r下，各類食用油脂中主要的天然酸性物質(zhì)就是FFA。但是，對于基質(zhì)復(fù)雜的含油食品，其中的非FFA類酸性天然產(chǎn)物、酸性食品添加劑和酸性美拉德反應(yīng)產(chǎn)物等(見表3)，都可能溶解于提取的油脂樣品中，導(dǎo)致酸價檢測結(jié)果偏高。薛斌等[33]研究指出，未添加食用香精香料的調(diào)味醬，其自動電位滴定法的酸價測定值與銅皂絡(luò)合比色法的測定值相差無幾，但添加食用香精香料的調(diào)味醬，其自動電位滴定法的酸價測定值就顯著偏高。因此，銅皂絡(luò)合比色法在酸價測定時可以免受酸性食用香精香料的干擾。

表3 可能存在食品中的酸性物質(zhì)

2 特異性定量FFA的經(jīng)典銅皂絡(luò)合比色法

2.1 銅皂絡(luò)合比色法的兩相絡(luò)合技術(shù)及其適用范圍

銅皂絡(luò)合比色法是一種用于測定油脂中FFA總含量的技術(shù)[34-36]，該技術(shù)是將油脂試樣溶于烴類溶劑作為有機(jī)相，用吡啶-銅離子的絡(luò)合離子染色液作為水相，進(jìn)行液-液雙相反應(yīng)，反應(yīng)過程中水相中的絡(luò)合離子會與有機(jī)相中的各種FFA發(fā)生反應(yīng)，形成三位一體的(吡啶-銅離子-脂肪酸根離子)銅皂絡(luò)合物，易溶于有機(jī)相的銅皂絡(luò)合物顯現(xiàn)特殊的靛藍(lán)色，在700 nm波長附近有特征吸收峰，且符合朗伯-比爾定律，從而可以準(zhǔn)確定量。銅皂絡(luò)合物結(jié)構(gòu)以及銅皂絡(luò)合反應(yīng)示意圖如圖1和圖2所示。

注：R1～R4分別為不同脂肪酸碳鏈。

有研究指出，銅皂絡(luò)合比色法僅對C8及其以上的中長碳鏈FFA有顯色反應(yīng)，而對C8以下的短碳鏈脂肪酸無顯色反應(yīng)[33，36](FFA的碳數(shù)與FFA銅皂絡(luò)合反應(yīng)后吸光度的相對強(qiáng)度關(guān)系如圖3所示)。

圖3 不同碳鏈長度FFA銅皂絡(luò)合反應(yīng)后吸光度的相對強(qiáng)度[36]

相比于酸堿中和滴定技術(shù)，銅皂絡(luò)合比色法可避免溶解在油脂中的山梨酸和苯甲酸等對酸價檢測的干擾[33]。銅皂絡(luò)合比色法是食用油脂中各種天然FFA的特異性檢測技術(shù)。

2.2 經(jīng)典銅皂絡(luò)合比色法的技術(shù)演變與發(fā)展瓶頸

銅皂絡(luò)合比色法研究始于20世紀(jì)50年代。 日本Iwayama[37]研究發(fā)現(xiàn)，在三乙醇胺存在的條件下，脂肪酸的硝酸銅溶液能夠溶于氯仿，使C10～C22 的FFA所形成的銅鹽轉(zhuǎn)移入有機(jī)相并顯現(xiàn)藍(lán)色，在691 nm波長處測定吸光度，所測得的吸光度與FFA含量在7.5～150 mg/L FFA質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。這就是銅皂絡(luò)合比色技術(shù)的雛形。

1964年，美國Baker[34]使用乙酸銅水溶液為水相染色液，苯作為有機(jī)相，率先應(yīng)用于檢測植物油脂中FFA總含量。

1976年，美國Lowry等[35]首次初步闡明了銅皂絡(luò)合物的結(jié)構(gòu)，建立了苯為有機(jī)相、乙酸銅水溶液(吡啶調(diào)節(jié)pH至6.0～6.2)為水相染色液的技術(shù)框架，至此經(jīng)典的銅皂絡(luò)合比色法基本定型并沿用至今。但是由于對銅皂絡(luò)合顯色理論認(rèn)識的局限，過窄的pH范圍(pH 6.0～6.2)使實(shí)驗(yàn)操作難度較大，劇毒試劑苯與替代有機(jī)相顯色強(qiáng)度的矛盾，以及顯色穩(wěn)定性等因素限制了該方法的廣泛應(yīng)用。

1986年，韓國Kwon等[36]首次建立以異辛烷替代苯為有機(jī)相、乙酸銅-吡啶為水相的改良銅皂絡(luò)合比色法，并用于測定FFA，將其應(yīng)用于脂肪酶活性的研究發(fā)現(xiàn)，銅皂絡(luò)合比色法僅適用C8以上FFA的檢測，F(xiàn)FA碳鏈長度對顯色強(qiáng)度無顯著影響。但是，異辛烷替代苯為有機(jī)相，銅皂絡(luò)合物顯色強(qiáng)度銳減了2/3，靈敏度大幅下降，對固態(tài)油脂溶解穩(wěn)定性差等弊端凸顯。

從1976至今，經(jīng)典的銅皂絡(luò)合比色法測定FFA在脂肪酶活性評價、脂質(zhì)組學(xué)的研究報道未曾間斷，其中包括銅皂絡(luò)合比色法用于谷物脂肪酸值的測定(2012年)[38]，采用銅皂絡(luò)合比色法監(jiān)測水產(chǎn)及其制品在長期儲存過程中所含油脂成分中FFA總含量的變化情況以評價水產(chǎn)及其制品在儲存過程中品質(zhì)變化規(guī)律(2014—2017年)[39-41]。在酶學(xué)研究中，一直以來都采用銅皂絡(luò)合比色法測定脂肪酶水解產(chǎn)物中FFA總含量(2011—2016年)[42-44]來評價脂肪酶的活性。2017年 Chen等[45]在運(yùn)用脂質(zhì)組學(xué)方法研究牡蠣在儲存過程中磷脂類物質(zhì)的代謝機(jī)理時發(fā)現(xiàn)，牡蠣的代謝產(chǎn)物會引起pH的變化，干擾了酸堿滴定法測定FFA的結(jié)果，而改用銅皂絡(luò)合比色法測定FFA則可以避免此缺陷。

2021年報道了以低毒溶劑環(huán)己烷替代高毒的苯作為有機(jī)相，解決了用銅皂絡(luò)合比色法檢測固態(tài)油脂酸價的問題，并驗(yàn)證了酸性添加劑和食用香精對傳統(tǒng)酸堿滴定法檢測酸價的干擾。銅皂絡(luò)合比色法可特異性定量復(fù)雜基質(zhì)樣品中油脂F(xiàn)FA總含量，免受非FFA的有機(jī)酸和無機(jī)酸的干擾[33]。

3 銅皂絡(luò)合比色法的技術(shù)進(jìn)展

3.1 銅皂絡(luò)合顯色理論創(chuàng)新

3.1.1 銅皂絡(luò)合反應(yīng)原理新發(fā)現(xiàn)

經(jīng)典的銅皂絡(luò)合比色法，要求銅皂染色液pH嚴(yán)格維持在6.0～6.2，偏離該狹窄pH區(qū)間則會導(dǎo)致銅皂絡(luò)合顯色強(qiáng)度大幅降低[35-36]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：銅皂染色液中吡啶分子與銅離子的物質(zhì)的量比(以下簡稱摩爾比,MR)才是決定銅皂絡(luò)合顯色反應(yīng)的關(guān)鍵[46]。MR大于等于3時，無論銅皂染色液的pH如何變化，都失去了對FFA進(jìn)行銅皂絡(luò)合顯色反應(yīng)的能力。根據(jù)金屬離子絡(luò)合原理推導(dǎo)的絡(luò)合機(jī)制，在水溶液中銅離子與吡啶分子形成銅-吡啶絡(luò)合物離子([Cu(C5H5N)n]2+，n=1～4)，銅離子作為中心離子，可以與配位體吡啶分子絡(luò)合形成1～4個不同配位數(shù)[47]的絡(luò)合物。絡(luò)合的吡啶分子數(shù)目越多，形成的絡(luò)合物也越穩(wěn)定，如表4所示。

表4 不同數(shù)目配位體的銅-吡啶絡(luò)合物離子的穩(wěn)定系數(shù)[47]

3.1.2 銅皂絡(luò)合反應(yīng)的抑制

根據(jù)表4的數(shù)據(jù)推測，銅離子、吡啶分子和FFA形成的銅皂絡(luò)合物的穩(wěn)定系數(shù)(lgβn)應(yīng)當(dāng)在(4.33, 5.93)范圍內(nèi)。所以，當(dāng)MR在[1，3)范圍時，銅皂染色液中總會存在一定量的[Cu(C5H5N)2]2+或[Cu(C5H5N)]2+絡(luò)合離子，正是這些含有1個或2個吡啶配位體數(shù)的銅-吡啶絡(luò)合物離子直接與FFA進(jìn)行了銅皂絡(luò)合反應(yīng)，形成了銅皂絡(luò)合物。但當(dāng)MR大于等于3時，銅皂染色液中所有的銅離子與吡啶分子形成[Cu(C5H5N)3]2+或[Cu(C5H5N)4]2+，這些含有3個或4個吡啶配位體數(shù)的銅-吡啶絡(luò)合物離子的絡(luò)合穩(wěn)定系數(shù)大于與FFA形成的銅皂絡(luò)合物，從而完全抑制了銅皂絡(luò)合反應(yīng)。

3.1.3 銅皂絡(luò)合顯色理論突破

新銅皂絡(luò)合比色法不必嚴(yán)控銅皂染色液的pH在6.0～6.2范圍內(nèi)的要求，論證了MR在[1，3)條件下(MR在2左右最優(yōu)),銅皂染色液的pH達(dá)到6.8后(pH 6.8～7.5)顯色強(qiáng)度最佳[46]。對新銅皂絡(luò)合比色法研究證明，MR在[1，3)條件下，銅皂染色液中主體絡(luò)合物離子[Cu(C5H5N)2]2+，在pH 5～7 的水溶液中不僅可有效抑制銅離子形成氫氧化銅沉淀(當(dāng)pH>5時)[46]，而且不影響脂肪酸銅皂絡(luò)合物的形成，而一旦MR達(dá)到3時，形成的[Cu(C5H5N)3]2+會抑制銅皂絡(luò)合物的形成。

經(jīng)典銅皂絡(luò)合比色法用吡啶將染色液pH調(diào)節(jié)到6.0～6.2之間時，MR恰好接近2，所以本質(zhì)上已將染色液MR調(diào)節(jié)到最佳。

研究表明，MR在2左右時用10%氫氧化鈉水溶液不斷調(diào)節(jié)升高銅皂染色液的pH，銅皂絡(luò)合反應(yīng)的顯色強(qiáng)度也會隨之不斷地增強(qiáng)。一旦染色液的pH大于6.8，顯色強(qiáng)度不再隨pH的上升而明顯增強(qiáng)[46]。其原因是各種中長碳鏈FFA的pH都在4.8左右[48]，屬于弱酸。因此，隨著銅皂染色液pH的升高，有機(jī)相中FFA的電離度不斷加大，釋放出FFA酸根離子的量也不斷增加，導(dǎo)致更多的FFA酸根離子從有機(jī)相轉(zhuǎn)移入水相，形成更多的銅皂絡(luò)合物，銅皂絡(luò)合顯色強(qiáng)度因此不斷增強(qiáng)，直到銅皂染色液的pH達(dá)到6.8，此時有機(jī)相中的FFA已經(jīng)99%解離為FFA酸根離子。

3.2 緩沖鹽染色液的增強(qiáng)顯色與抑制乳化作用

3.2.1 促進(jìn)銅皂絡(luò)合物向有機(jī)相遷移而增強(qiáng)顯色強(qiáng)度與穩(wěn)定性

新銅皂絡(luò)合比色法采用0.05～2.0 mol/L乙酸鈉-乙酸緩沖液配制的銅皂染色液，降低了銅皂染色液的水活性，銅皂絡(luò)合物在染色液(水相)的溶解度也相應(yīng)降低，促進(jìn)了絡(luò)合反應(yīng)后更多的銅皂絡(luò)合物遷移進(jìn)入有機(jī)相，從而增強(qiáng)了銅皂絡(luò)合顯色強(qiáng)度[46]。同時，由于緩沖液極化了銅皂絡(luò)合物在水相和有機(jī)相之間的分配系數(shù)，最大程度降低了銅皂絡(luò)合物在水相中的溶解度，從而縮小了銅皂絡(luò)合物在水相中溶解度隨溫度變化的幅度，即進(jìn)一步降低了溫度對顯色穩(wěn)定性的影響。過高濃度的緩沖液(>2.0 mol/L)，不利有機(jī)相中形成的FFA酸根離子在銅皂染色液中的溶解，使其難以完全與銅皂染色液中的銅離子和吡啶接觸形成銅皂絡(luò)合物，反而導(dǎo)致銅皂絡(luò)合顯色強(qiáng)度降低[46]。

3.2.2 抑制銅皂絡(luò)合反應(yīng)時的乳化作用和水溶性酸性物質(zhì)的干擾

從復(fù)雜基質(zhì)的加工食品中提取的油脂會含有微量水溶性的酸性物質(zhì)，如乙酸。對于缺乏緩沖鹽的經(jīng)典銅皂染色液，即使油脂樣品中有極微量的乙酸，也會破壞極窄范圍的pH限制，使銅皂絡(luò)合顯色強(qiáng)度出現(xiàn)明顯的降低，一旦pH低于6.0，則顯色強(qiáng)度劇烈下降[35-36]。新銅皂絡(luò)合比色法染色液中的乙酸鈉-乙酸緩沖液可高效維持穩(wěn)定的pH環(huán)境,即使較高濃度的外來乙酸等酸性物也難以明顯影響顯色強(qiáng)度[46]。

相比于傳統(tǒng)的純水配制的銅皂染色液，用緩沖液配制的銅皂染色液，增強(qiáng)了銅皂染色液的離子強(qiáng)度，增大了水相和有機(jī)相的極性差異，因而降低了兩相之間發(fā)生乳化作用的可能性。

3.3 破解非苯有機(jī)溶劑絡(luò)合顯色弱的難點(diǎn)

經(jīng)典銅皂絡(luò)合比色法中溶劑苯[34-35]是銅皂絡(luò)合顯色反應(yīng)最佳的有機(jī)相溶劑，具有最強(qiáng)的顯色強(qiáng)度。其他常見有機(jī)溶劑銅皂絡(luò)合反應(yīng)顯色強(qiáng)度強(qiáng)弱順序?yàn)楸?甲苯>鄰二甲苯>間二甲苯≈對二甲苯>環(huán)己烷>C8～C16的直鏈烷烴≈異辛烷[46]。苯是高毒溶劑。在銅皂絡(luò)合比色技術(shù)發(fā)展中，有嘗試用低毒溶劑異辛烷[36]作為有機(jī)相，但其顯色強(qiáng)度和固脂溶解穩(wěn)定性較差[33，46]。研究顯示，以乙酸鈉-乙酸緩沖液配制的銅皂染色液為水相，用環(huán)己烷替代苯為有機(jī)相的銅皂絡(luò)合比色法，其顯色強(qiáng)度達(dá)到經(jīng)典銅皂絡(luò)合比色法的60%以上，完全滿足定量比色的靈敏度和穩(wěn)定性要求[33]。同樣條件下，若用低毒的甲苯或二甲苯(略有異味)替代高毒的苯為有機(jī)相，顯色強(qiáng)度與經(jīng)典銅皂絡(luò)合比色法基本相當(dāng)[46]。

3.4 新銅皂比色法與傳統(tǒng)銅皂比色法的比較

傳統(tǒng)銅皂比色法與新銅皂比色法技術(shù)上的主要差異對比見表5。

表5 傳統(tǒng)銅皂比色法與新銅皂比色法技術(shù)上的主要差異對比

4 結(jié) 語

在經(jīng)典銅皂絡(luò)合比色技術(shù)的基礎(chǔ)上，經(jīng)系統(tǒng)研究形成的新銅皂絡(luò)合比色法，發(fā)展了吡啶-銅離子摩爾比為核心的新銅皂絡(luò)合顯色理論，解決了經(jīng)典銅皂絡(luò)合比色法顯色強(qiáng)度易受pH變化影響、有機(jī)相只能用高毒溶劑苯才能達(dá)到高顯色強(qiáng)度等問題，使銅皂絡(luò)合比色技術(shù)的操作便捷性、穩(wěn)定性、特異性顯著提升。作為一種FFA的特異性檢測技術(shù)，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)的酸堿中和滴定法無法區(qū)分FFA和其他油溶性酸性物質(zhì)、油脂樣品消耗量大等不足，更適合于復(fù)雜基質(zhì)的加工食品的酸價檢測，成為特異性定量FFA和AV的理想方法。