王曉丹, 李 杰, 劉 宇, 丁廣洲,*

(1.黑龍江大學(xué) 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院, 哈爾濱 150080; 2.黑龍江省甜菜技術(shù)創(chuàng)新中心, 哈爾濱 150080; 3.國(guó)家糖料改良中心, 哈爾濱 150080)

0 引 言

對(duì)于所有生命體來(lái)說(shuō)，磷(P)是磷脂、核酸和 ATP 的主要組成元素，也是酶反應(yīng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的調(diào)節(jié)因子[1]。植物以無(wú)機(jī)磷酸鹽(Pi)的形式獲取磷，由于無(wú)機(jī)磷酸鹽分布不均勻，溶解性低，在土壤中存在很低的水平(<10 μM)。因此，施用化肥已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中確保作物生產(chǎn)力的做法[2-3]。這導(dǎo)致了不可再生的磷礦資源巖儲(chǔ)量迅速下降，如按照目前的速度開(kāi)采，只可持續(xù)50～100 a。磷肥的過(guò)度使用造成土壤中難溶性磷的積累，威脅到糧食生產(chǎn)，以及土壤磷流入水體后導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化，帶來(lái)了系列生態(tài)環(huán)境問(wèn)題[4]。因此，挖掘促進(jìn)磷高效吸收的基因資源，探討植物高效吸收磷素的分子機(jī)制，提高低磷條件下植物吸收磷素的能力，具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[5]。

磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠調(diào)節(jié)植物對(duì)磷的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)提高植物磷利用率具有重要作用。在植物中，磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PT)被分為 PHT1，PHT2，PHT3，PHT4，PHT5 和 PHO1 家族[6]。PHT1和PHO1 是質(zhì)膜磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，PHT2，PHT3，PHT4，PHT5 是細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[7-9]。Wang D等首次從擬南芥[8]中克隆出植物的PHT1家族基因，并與釀酒酵母 PHO84進(jìn)行了序列同源性分析。近年來(lái)在水稻、煙草、馬鈴薯、大豆、大麥、玉米、小麥、番茄、高粱和楊樹(shù)等植物體中均發(fā)現(xiàn)了PHT1s的同源性，如擬南芥的AtPT1;1、AtPT1;4、小麥TaPT1;1、TaPT1;3、大豆GmPT1;8、水稻OsPT1;8等在植物體內(nèi)的表達(dá)模式及對(duì)植物吸收的影響已被報(bào)道。PHO1蛋白主要參與 Pi 從根部向地上轉(zhuǎn)運(yùn)，具有長(zhǎng)的細(xì)胞質(zhì) N-末端，含有3部分SPX結(jié)構(gòu)域，具有EXS 結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞質(zhì)C-末端和6個(gè)跨膜螺旋。EXS 結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)PHO1的信號(hào)傳導(dǎo)能力和Pi轉(zhuǎn)運(yùn)活性[10-11]。

甜菜(Beta vulgaris L.)屬藜科甜菜屬，作為世界上最重要的糖料作物之一，且在我國(guó)北方農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)重要地位[12]。甜菜種植主要分布在高寒地區(qū)，特別是東北地區(qū), 土壤肥沃，有機(jī)磷含量高, 但直接可利用的游離無(wú)機(jī)正磷酸鹽(土壤有效磷)含量一直處于較低水平[13]。正由于土壤中有效磷含量有限[14]，高效利用磷的甜菜品種對(duì)于甜菜的大規(guī)模生產(chǎn)和新品種的選育與開(kāi)發(fā)具有重要意義。迄今為止，低磷脅迫下的甜菜生理響應(yīng)已有報(bào)道，但是涉及甜菜耐低磷相關(guān)基因的表達(dá)模式研究較少，對(duì)甜菜PTs磷酸鹽蛋白基因家族的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究從甜菜中克隆出磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因BvPT1;4和BvPHO1，并運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)BvPT1;4和BvPHO1蛋白的理化性質(zhì)分析，對(duì)甜菜磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因深層次的功能研究具有一定的借鑒作用，同時(shí)為培養(yǎng)甜菜的優(yōu)良品種提供了候選基因。

1 材料與方法

1.1 植物材料和生長(zhǎng)條件

以甜菜磷高效品種‘B8033’為材料，為催芽選取飽滿、大小均勻的甜菜種子浸泡過(guò)夜(12 h)。在1∶600的福美霜溶液浸泡6 h, 然后用蒸餾水洗凈備用。將種子放在72孔穴盤(pán)中培養(yǎng)至子葉完全展平后開(kāi)始移苗，將甜菜幼苗移入盛有改良版1/2Hougland完全營(yíng)養(yǎng)液玻璃槽中。在溫度 25 ℃、光照16 h、黑暗8 h、濕度25%的條件下培養(yǎng)20 d。

1.2 基因的克隆

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI和轉(zhuǎn)錄組的序列數(shù)據(jù)來(lái)獲得甜菜BvPT1;4和BvPHO1基因的序列，利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，將設(shè)計(jì)好的引物送至上海生工生物股份有限公司合成。

表1 甜菜磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因克隆所用引物

1.2.2 RNA提取和cDNA合成

取適量甜菜幼嫩葉片置于預(yù)冷的研缽中，加入適量的液氮充分研磨。采用Trizol法提取甜菜的總RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。利用核酸蛋白儀Nanodrop2000測(cè)定OD260和 OD280，根據(jù) OD260/OD280比值的質(zhì)量。按照TIANGEN逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟獲得cDNA。

1.2.3 甜菜BvPT1;4基因的克隆和測(cè)序

由反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用引物進(jìn)行擴(kuò)增。25 μL按照說(shuō)明書(shū)設(shè)置反應(yīng)體系，為：PrimeSTAR Max Premix(2×)12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O為9.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，98 ℃變性10 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，變性-退火-延伸為1個(gè)循環(huán)，連續(xù)30個(gè)循環(huán)，然后在 72 ℃延伸5 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%凝膠電泳檢測(cè)，回收目的片段，-20 ℃保存?zhèn)溆?。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化后與pMD19-T Vector連接。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)菌落PCR檢測(cè)后，挑選陽(yáng)性克隆菌液送至上海生工進(jìn)行測(cè)序。

1.3 生物信息學(xué)分析

通過(guò)在線軟件ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)甜菜BvPT1;4和BvPHO1蛋白的氨基酸組成、正負(fù)電荷殘基數(shù)、親水平均系數(shù)等理化性質(zhì)[10]，使用跨膜螺旋預(yù)測(cè)工具TMHNM Serverv2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域；利用 NCBI 中的 CDD 數(shù)據(jù)庫(kù)(conserved domain database)預(yù)測(cè)甜菜BvPT1;4和BvPHO1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；利用Blastp在線工具查找甜菜BvPT1;4和BvPHO1蛋白的同源氨基酸序列，并使用DNAMAN 7.0軟件多重比對(duì)同源氨基酸序列；利用軟件MEGA7制作進(jìn)化樹(shù)。利用軟件Prabi(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)BvPT1;4和BvPHO1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用軟件SignalP(http://ww w.cb s.dtu.dk/services/SignalP/)在線預(yù)測(cè)與BvPT1;4和BvPHO1蛋白的信號(hào)肽；用SWISSMODEL(https://swiss model.expasy.org/interactive)在線預(yù)測(cè)工具預(yù)測(cè)BvPT1;4和BvPHO1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)；應(yīng)用網(wǎng)站NetPhos(http://www.cbs.dtu.dk/servic-es/NetPhos/)預(yù)測(cè)BvPT1;4和BvPHO1蛋白的磷酸化位點(diǎn)；利用WOLFPSORT(https://www.genscript.com/tools/wolf-psort)預(yù)測(cè)BvPT1;4和BvPHO1蛋白的亞細(xì)胞定位信息[15-18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜幼苗RNA的的提取

Trizol法提取甜菜幼苗總RNA，采用1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1(a)，提取的RNA 28S、18S和5S條帶清晰表明RNA質(zhì)量良好。分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的A260/A280比值在1.9～2.0，說(shuō)明RNA純度較高，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 甜菜BvPT1;4和BvPHO1基因的擴(kuò)增

以上述提取的甜菜幼苗RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行基因擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1(b,c)。由圖1可見(jiàn)，甜菜BvPT1;4基因PCR擴(kuò)增獲得產(chǎn)物長(zhǎng)度約為1 600 bp,BvPHO1基因產(chǎn)物長(zhǎng)度約為2 400 bp。切膠回收，克隆轉(zhuǎn)化，獲得測(cè)序結(jié)果BvPT1;4基因?yàn)? 581 bp，BvPHO1基因?yàn)? 394 bp?；虍a(chǎn)物的大小與引物設(shè)計(jì)時(shí)基因產(chǎn)物相符。

圖1 甜菜幼苗總RNA電泳檢測(cè)(a)和甜菜PT基因基擴(kuò)增 M:2 000 bp DNA ladder(b,c)

2.3 甜菜PT基因編碼蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析

甜菜PT蛋白理化性質(zhì)分析見(jiàn)表2。BvPHO1和BvPT1;4蛋白分別編碼797、526個(gè)氨基酸，分子量分別為91 910.50 Da、57 859.43 Da。理論等電點(diǎn)(pI)分別為9.24、8.76，均大于7，為堿性蛋白質(zhì)。不穩(wěn)定系數(shù)均小于40，為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。相對(duì)較高的脂肪系數(shù)可以維持蛋白質(zhì)良好的穩(wěn)定性，有助于在不同環(huán)境中發(fā)揮正常的功能?？偲骄H水性分析表明BvPHO1的值為負(fù)數(shù)，說(shuō)明BvPHO1為親水性蛋白，BvPT1;4的值為正數(shù)，說(shuō)明BvPT1;4為疏水性蛋白。

表2 甜菜PT蛋白理化性質(zhì)分析

2.4 甜菜PT基因編碼蛋白疏水性、磷酸化位點(diǎn)、信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析

利用在線軟件ProtScale預(yù)測(cè)BvPHO1和BvPT1;4編碼蛋白的親疏水性見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，BvPHO1蛋白在第385位親水性最強(qiáng)，在第532位疏水性最強(qiáng)；BvPT1;4蛋白在第515位親水性最強(qiáng)，在第472位疏水性最強(qiáng)。BvPHO1和BvPT1;4蛋白氨基酸的分值分別為負(fù)值和正值，則推斷BvPHO1和BvPT1;4分別為親水和疏水蛋白，與所預(yù)測(cè)的理化性質(zhì)結(jié)果一致。甜菜BvPHO1蛋白中共87個(gè)氨基酸磷酸化位點(diǎn)，其中有55個(gè)絲氨酸，23個(gè)蘇氨酸和9個(gè)酪氨酸。甜菜BvPT1;4蛋白含有25個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，23個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和6個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，共54個(gè)磷酸化位點(diǎn)見(jiàn)圖3。兩者均發(fā)生在絲氨酸，蘇氨酸和酪氨酸上，且磷酸化位點(diǎn)個(gè)數(shù)都是絲氨酸最多。推測(cè)BvPHO1和BvPT1;4蛋白可通過(guò)其磷酸化修飾調(diào)控其活性，與甜菜PT的功能相關(guān)。BvPHO1和BvPT1;4蛋白均不存在信號(hào)肽，可推測(cè)不是分泌蛋白。甜菜PT蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果，BvPHO1和BvPT1;4在質(zhì)膜、葉綠體和細(xì)胞核中均可能存在。其中BvPHO1在質(zhì)膜中存在的概率為71.4%，在細(xì)胞核中存在的概率為14.3%；BvPT1;4在細(xì)胞核中存在的概率為71.4%，在葉綠體中存在的概率為21.4%。

圖2 BvPHO1和 BvPT1;4蛋白親/疏水性預(yù)測(cè)

圖3 BvPHO1和 BvPT1;4蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

2.5 甜菜PT基因編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

甜菜PHT蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析表明：甜菜BvPHO1蛋白具有高度保守的SPX和EXS 超家族結(jié)構(gòu)域，BvPT1;4蛋白的保守結(jié)構(gòu)域?yàn)?A0109，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域?yàn)榱姿猁}轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的必要結(jié)構(gòu)，發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能。通過(guò)對(duì)甜菜PHT蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，得知甜菜BvPHO1和BvPT1;4蛋白分別有7、11個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，均為跨膜蛋白(圖4)。對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，在蛋白BvPHO1和BvPT1;4中，α-螺旋結(jié)構(gòu)共計(jì)分別為445、258個(gè)氨基酸,占比分別為55.83%、49.05%；延伸主鏈結(jié)構(gòu)最少，分別為64、82個(gè)氨基酸，僅占8.03%、15.59%；無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)共計(jì)分別為264、168個(gè)氨基酸,分別占33.12%、31.94%。甜菜BvPHO1、BvPT1;4蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)均以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主，其與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致(圖5)。

圖4 BvPHO1和 BvPT1;4蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

圖5 BvPHO1和 BvPT1;4蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.6 甜菜PT基因編碼蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

為研究甜菜BvPHO1和BvPT1;4與其它物種磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的進(jìn)化關(guān)系，利用NCBI的BlastP工具分析甜菜BvPHO1和BvPT1;4蛋白與其相似度較高的序列進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化[15]。進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明，甜菜BvPHO1蛋白與藜麥(Chenopodium quinoa)、菠菜(Spinacia oleracea)、芝麻(Sesamum indicum)、小果咖啡(Coffea arabica)的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白親緣關(guān)系最近。BvPT1;4蛋白與藜麥(Chenopodium quinoa)、菠菜(Spinacia oleracea)、杜鵑(Rhododendron simsii)、圓葉杜鵑(Rhododendron williamsianum)的高親和磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白親緣關(guān)系較近。

3 討 論

通過(guò)克隆甜菜BvPHO1和BvPT1;4基因并且對(duì)該基因及其編碼的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)BvPHO1蛋白含有PHO1家族蛋白中高度保守的SPX(SYG1/PHO81/XPR1)-EXS結(jié)構(gòu)域，此類(lèi)結(jié)構(gòu)域已經(jīng)在擬南芥和水稻的液泡Pi轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中被發(fā)現(xiàn)，以維持Pi穩(wěn)態(tài)。BvPT1;4蛋白含有526個(gè)氨基酸殘基，蛋白分子質(zhì)量為58.1 ku，等電點(diǎn) 8.76，是一個(gè)定位在質(zhì)膜上疏水性、無(wú)信號(hào)肽的非分泌性蛋白，含有高親和力磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白典型的 11個(gè)跨膜域和一個(gè)大親水環(huán)的跨膜結(jié)構(gòu)。甜菜作為世界上最重要的糖料作物之一，且在我國(guó)北方農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)重要地位，同時(shí)也是最具競(jìng)爭(zhēng)力和潛力的經(jīng)濟(jì)作物。正由于土壤中有效磷含量有限，高效利用磷的甜菜品種對(duì)于甜菜的大規(guī)模生產(chǎn)和新品種的選育與開(kāi)發(fā)具有重要意義。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)克隆甜菜BvPHO1和BvPT1;4基因并且對(duì)該基因及其編碼的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，BvPHO1蛋白含有SPX(SYG1/PHO81/XPR1)-EXS結(jié)構(gòu)域，對(duì)維持植物體內(nèi)Pi穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。BvP71;4蛋白具有高親和力，可有效利用土壤中的磷元素。研究結(jié)果為進(jìn)一步探索甜菜PT基因深層次的功能研究提供方向，也為培養(yǎng)甜菜的改良品種提供了候選基因，具有一定的學(xué)術(shù)價(jià)值。