雍楊瑩，于浪柳，李春燕，張藍(lán)天，董夢圓，薛大偉，方云霞，張曉勤

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311121)

大麥(HordeumvulgareL.)是種植面積僅次于水稻、玉米和小麥的重要禾谷類作物，具有飼用、釀造、食用等多種用途[1].淀粉是大麥籽粒的主要成分之一，根據(jù)淀粉構(gòu)型的不同，可分為直鏈淀粉和支鏈淀粉.籽粒直鏈淀粉和支鏈淀粉的比例以及總淀粉含量是決定大麥品質(zhì)及特性的重要因素之一，直接影響大麥的食用、飼用和工業(yè)加工價(jià)值[2].總淀粉含量的增加提高了大麥作為飼料的經(jīng)濟(jì)價(jià)值.高直鏈淀粉的品種利于提高大麥浸出率，啤用品質(zhì)更好[3].低直鏈淀粉高支鏈淀粉的糯性大麥，以更優(yōu)的口感越來越多地出現(xiàn)在食品加工業(yè)中；經(jīng)過化學(xué)修飾的支鏈淀粉透明性和穩(wěn)定性得到提高，因此糯性大麥在醫(yī)藥、紡織、航空及鉆探等工業(yè)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[4].

目前，關(guān)于禾谷類作物淀粉含量遺傳分析研究主要集中在小麥[5]、水稻[6]和玉米[7]上，而有關(guān)大麥籽粒淀粉含量性狀的遺傳研究相對較遲，尚不夠深入，控制大麥淀粉含量相關(guān)的QTL報(bào)道相對較少.Borém等[8]發(fā)現(xiàn)控制大麥淀粉粒大小、粒徑之比及淀粉總含量的QTL位于染色體2H、4H和5H上；Islamovic等[9]用連續(xù)栽培3年的RIL群體材料進(jìn)行QTL定位分析，將控制直鏈淀粉含量的QTL位點(diǎn)定位到1H、5H和7H上；朱德馨[10]用188份DH系群體為材料，對大麥籽粒總淀粉含量進(jìn)行QTL連鎖定位分析，共檢測到7個(gè)QTLs，分別位于1H和4H上；范祥云等[11-12]利用DH群體構(gòu)建的遺傳圖譜進(jìn)行QTL分析，分別在3H、4H和7H上鑒定到3個(gè)與直鏈淀粉相關(guān)的QTL，而在染色體3、4、5和7H上鑒定到4個(gè)與支鏈淀粉含量相關(guān)的QTL.

本研究以大麥品種Golden Promise (GP)和H602雜交構(gòu)建的重組自交系(recombinant inbred lines, RILs)為研究材料，在2018—2019和2019—2020兩個(gè)生長季，利用碘比色法測定自交系群體134個(gè)株系及親本材料的直鏈淀粉和支鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并進(jìn)行控制淀粉含量性狀的QTL初步定位，以期獲取大麥籽粒淀粉相關(guān)的遺傳規(guī)律，為高淀粉含量大麥品種選育和優(yōu)質(zhì)性狀基因的克隆提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為優(yōu)質(zhì)啤用大麥品種GP和野生大麥H602雜交構(gòu)建的134個(gè)重組自交系.于2018—2019和2019—2020兩個(gè)生長季，分別在杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)地種植親本及134個(gè)RILs.收獲當(dāng)年大麥種子作為試驗(yàn)材料，取待測大麥籽粒，烘干至恒重，用打粉機(jī)打成粉末備用.

1.2 直鏈淀粉和支鏈淀粉含量測定

采用直鏈、支鏈淀粉測定試劑盒(碘比色法)(蘇州格銳思生物科技有限公司)測定籽粒中的直鏈、支鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)，操作步驟根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行.直鏈淀粉與酸性提取液形成的碘-淀粉絡(luò)合物在620 nm下有吸收峰，可計(jì)算出樣品直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)；支鏈淀粉與碘形成的絡(luò)合物通過雙波長(540、740 nm)比色法測定，得到支鏈淀粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù).

利用試劑盒中提供的標(biāo)樣，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.待測樣品在相同條件下測定其吸光度值，借助標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù).吸光度值利用分光光度計(jì)(UV-2600，SHIMADZU)測定.

1.3 QTL定位

運(yùn)用Excel 2010及IBM SPSS 20.0軟件對試驗(yàn)所得群體數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布、性狀間的相關(guān)性等分析.RILs群體的高密度遺傳圖譜為實(shí)驗(yàn)室前期通過簡化基因組測序方法構(gòu)建[13].基于該遺傳圖譜，利用qgene 4.3.10軟件[14]復(fù)合區(qū)間作圖法(composite interval mapping, CIM)進(jìn)行QTL分析.采用排列組合1 000次的方法確定LOD閾值.QTL位點(diǎn)的判斷閾值取LOD≥2(P=0.05).

2 結(jié)果與分析

2.1 RIL群體淀粉含量各性狀的相關(guān)性分析

2018—2019生長季和2019—2020生長季，大麥親本及RIL群體后代134個(gè)株系籽粒的直鏈淀粉、支鏈淀粉和總淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)相關(guān)系數(shù)列于表1.總體來看，每個(gè)生長季內(nèi)直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、支鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)與總淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間均呈正相關(guān)(P<0.01)，兩個(gè)生長季間的支鏈淀粉和總淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間也呈正相關(guān)(P<0.01).

表1 RIL群體直鏈淀粉、支鏈淀粉和總淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的相關(guān)性分析Tab.1 Correlations between amylose, amylopectin and total starch mass fraction in RILs

2.2 直鏈淀粉和支鏈淀粉含量的遺傳變異

如表2所示，不同年份間親本和RIL群體后代的表型結(jié)果存在差異，說明環(huán)境差異對直鏈淀粉含量和支鏈淀粉含量具有一定的影響.淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)在RIL群體中出現(xiàn)了超親分離，說明該性狀存在一定的遺傳變異.從性狀分布的偏度和峰度來看，其絕對值<1，表明RIL群體的淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)符合正態(tài)分布，呈單峰分布曲線(圖1)，具有典型的數(shù)量性狀特征，表明大麥RIL群體籽粒淀粉含量的遺傳受多基因控制.

表2 親本和RIL群體后代的大麥籽粒淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tab.2 Grain starch mass fraction in parents and RIL population of barley

圖1 大麥籽粒淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)在RIL群體中的頻率分布Fig.1 The frequency distributions of starch mass fraction in barley

2.3 大麥籽粒淀粉含量的QTLs分析

采用CIM法，判斷閾值LOD≥2.0為QTL，對兩個(gè)生長季大麥RIL群體籽粒淀粉含量進(jìn)行QTL定位，共檢測到8個(gè)QTL(表3).其中，與直鏈淀粉含量相關(guān)QTL有2個(gè)，均位于染色體7H上；與支鏈淀粉含量相關(guān)QTL和與總淀粉含量相關(guān)QTL均有3個(gè)，位于染色體2H和7H上.如圖2所示，位于染色體7H上區(qū)間距離0～2.2 cM (centimorgan，cM)處，檢測到共同存在3種淀粉含量相關(guān)的QTL;位于染色體7H上區(qū)間距離24.8～26.9 cM處，檢測到共同存在與支鏈淀粉含量和總淀粉含量相關(guān)的QTL;位于染色體2H上區(qū)間距離40.1～41.3 cM處，檢測到共同存在與支鏈淀粉含量和總淀粉含量相關(guān)的QTL.

表3 大麥籽粒淀粉含量的QTL分析Tab.3 QTL analysis for grain starch content in barley

注：染色體上的每條黑線表示一個(gè)標(biāo)記.

2.3.1 直鏈淀粉含量QTL分析

2018—2019生長季群體中共檢測到2個(gè)與直鏈淀粉含量相關(guān)的微效QTL位點(diǎn)，命名為qAC7-1和qAC7-2，均位于染色體7H上，區(qū)間距離分別為0～2.2 cM和20.5～21.5 cM，其加性效應(yīng)均為正值，表明增加直鏈淀粉含量的等位基因來自親本GP，貢獻(xiàn)率分別為8.52%和7.83%.2019—2020生長季群體中未檢測到與直鏈淀粉含量相關(guān)的QTL.

2.3.2 支鏈淀粉含量QTL分析

2018—2019生長季群體中共檢測到2個(gè)與支鏈淀粉含量相關(guān)的主效QTL位點(diǎn)，命名為qAPC7-1和qAPC7-2，均位于染色體7H上，區(qū)間距離分別為0～2.2 cM和24.8～26.9 cM，其加性效應(yīng)均為正值，表明增加支鏈淀粉含量的等位基因來自母本GP，貢獻(xiàn)率分別為15.53%和16.40%.2019—2020生長季群體中檢測到與支鏈淀粉含量相關(guān)的主效QTL位點(diǎn)qAPC2-1，位于染色體2H上，區(qū)間距離為40.1～41.3 cM，其加性效應(yīng)為負(fù)值-0.077，表明增加支鏈淀粉含量的等位基因來自父本H602，貢獻(xiàn)率為12.71%.

2.3.3 總淀粉含量QTL分析

2018—2019生長季群體中共檢測到2個(gè)與總淀粉含量相關(guān)的主效QTL位點(diǎn)，命名為qT7-1和qT7-2，均位于染色體7H上，區(qū)間距離分別為0～2.2 cM和24.8～26.9 cM，其加性效應(yīng)均為正值，表明增加總淀粉含量的等位基因來自母本GP，貢獻(xiàn)率分別為24.05%和24.02%.2019—2020生長季群體中檢測到與總淀粉含量相關(guān)的主效QTL位點(diǎn)qT2-1，位于染色體2H上，區(qū)間距離為40.1～41.3 cM，其加性效應(yīng)為負(fù)值-0.078，表明增加總淀粉含量的等位基因來自父本H602，貢獻(xiàn)率為12.79%.

3 討論

本研究兩年間的大麥籽粒淀粉含量測定結(jié)果顯示，兩年大麥籽粒群體的直鏈淀粉含量和支鏈淀粉含量及總淀粉含量呈連續(xù)正態(tài)分布特征，表明大麥RIL群體籽粒淀粉含量具有廣泛遺傳變異，且主要由主效基因控制，驗(yàn)證了大麥淀粉含量為典型的數(shù)量性狀，這與前人的研究結(jié)果相一致[15-16].

大麥籽粒淀粉含量不僅受遺傳因素的調(diào)控，也易受到環(huán)境的影響，如施氮水平、種植密度、澆水量等環(huán)境因素[17].不同環(huán)境條件下，基因的表達(dá)與否以及表達(dá)量的多少也會存在一定的差異.2018—2019和2019—2020生長季檢測的大麥籽粒直鏈淀粉含量及支鏈淀粉含量有差異，且2018—2019生長季檢測到的QTL位點(diǎn)均位于染色體7H上，而2019—2020生長季檢測到的QTL位點(diǎn)均位于染色體2H上，未出現(xiàn)兩年相同的QTL位點(diǎn)，說明環(huán)境因素影響大麥籽粒淀粉含量，兩年間種植收獲的大麥之間存在差異.

本研究檢測出的8個(gè)QTL位點(diǎn)中有6個(gè)位于7H上，2個(gè)位于2H上.前人有關(guān)大麥淀粉品質(zhì)性狀的QTL分析研究亦出現(xiàn)與本研究相同的染色體.范祥云等[11-12]利用SNP標(biāo)記對DH群體進(jìn)行QTL鑒定，通過連鎖分析鑒定到多個(gè)QTL，其中7H上17.4 cM和81.8 cM處分別檢測到穩(wěn)定遺傳的直鏈淀粉和支鏈淀粉含量相關(guān)QTL.Islamovic等[9]連續(xù)3年均在7H上鑒定到控制直鏈淀粉含量的QTL位點(diǎn)，該QTL遺傳距離約為15.9 cM.這2個(gè)QTL均與我們檢測到的直鏈淀粉含量QTLqAC7-2位置較為接近，有可能為同一QTL.

Li等[18]通過100份來自41個(gè)國家或地區(qū)的國際大麥核心選擇集材料進(jìn)行直鏈淀粉和支鏈淀粉的GWAS分析，分別鑒定出總淀粉、直鏈淀粉及支鏈淀粉的13、2和10個(gè)QTLs，有5個(gè)QTL同時(shí)影響總淀粉和支鏈淀粉含量.本研究在2018—2019生長季檢測到2個(gè)與總淀粉含量相關(guān)QTL位點(diǎn)qT7-1和qT7-2，位于染色體7H上，貢獻(xiàn)率分別為24.05%和24.02%，增效基因源于母本；2019—2020生長季，在2H上檢測到一個(gè)與總淀粉含量相關(guān)QTL位點(diǎn)qT2-1，其貢獻(xiàn)率為12.79%.同時(shí)，在主效基因qT7-1所在區(qū)間0～2.2 cM內(nèi)還分別檢測到調(diào)控直鏈淀粉和支鏈淀粉含量相關(guān)的QTL位點(diǎn)qAC7-1和qAPC7-1；主效基因qT7-2所在區(qū)間24.8～26.9 cM處檢測到與支鏈淀粉含量相關(guān)的QTL位點(diǎn)qAPC7-1；主效基因qT2-1所在區(qū)間還存在與支鏈淀粉含量相關(guān)的QTL位點(diǎn)qAPC2-1.由于總淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)與支鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和，3個(gè)性狀間的重疊關(guān)系可能表明大麥籽粒中淀粉物質(zhì)因共同的遺傳而具有相關(guān)性，初步推測與總淀粉含量相關(guān)的QTL位點(diǎn)與直鏈淀粉和支鏈淀粉含量相關(guān)的QTL位點(diǎn)為同一個(gè)位點(diǎn)，這幾個(gè)區(qū)間可作為進(jìn)一步精確定位的主要目標(biāo)QTL.

本研究檢測到的主效QTL較少，貢獻(xiàn)率較小，故關(guān)于淀粉含量QTL更精細(xì)的定位有待進(jìn)一步驗(yàn)證.找到淀粉含量更精細(xì)的位點(diǎn)，可以更好地揭示調(diào)控淀粉合成代謝的基因，更有針對性地提高功能大麥的淀粉含量，創(chuàng)制高淀粉含量功能大麥新種質(zhì).