頭頸鱗癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）是世界第六大惡性腫瘤，2018 年，頭頸鱗癌新增89 萬(wàn)病例，死亡造成45 萬(wàn)人死亡

。大多數(shù)頭頸鱗癌病例發(fā)生在口腔、咽和喉的上皮黏膜，嚴(yán)重限制了患者的咀嚼能力、言語(yǔ)、美容甚至危及生命

。頭頸鱗癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)因素有很多，包括吸煙、飲酒、咀嚼檳榔、人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV）病毒、口腔衛(wèi)生狀況差等

。其他風(fēng)險(xiǎn)因素還包括遺傳因素、環(huán)境污染、免疫抑制等

。早期頭頸鱗癌主要是采取手術(shù)或放射治療，而對(duì)于中晚期疾病，臨床上建議多學(xué)科治療，不僅是為了提高生存率，也是為了提高患者的生活質(zhì)量

。盡管如此，腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤復(fù)發(fā)和腫瘤耐藥仍然是導(dǎo)致頭頸鱗癌5 年生存率差（低于60%）的主要原因

。篩選并驗(yàn)證腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和耐藥相關(guān)的靶點(diǎn)，并基于此開發(fā)新的治療策略，對(duì)延長(zhǎng)晚期頭頸鱗癌患者的生存時(shí)間有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，非編碼RNA（non-coding RNA）調(diào)控腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，部分非編碼RNA 與腫瘤的轉(zhuǎn)移、局部復(fù)發(fā)和臨床預(yù)后密切相關(guān)

。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）作為非編碼RNA 的一種，參與細(xì)胞生理病理的過(guò)程

，在包括腫瘤在內(nèi)的疾病發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用

。因此，闡明LncRNA 生物學(xué)功能，有助于進(jìn)一步揭示口腔鱗癌分子發(fā)病機(jī)制，為口腔鱗癌早期診斷、預(yù)后判斷以及治療提供有效靶點(diǎn)。DUXAP9 是一種新發(fā)現(xiàn)的假基因來(lái)源的lncRNA

，屬于DUXA同源盒基因家族。同源盒基因編碼DNA 結(jié)合蛋白，其中許多蛋白被認(rèn)為與早期胚胎發(fā)育有關(guān)

。同源盒基因編碼60～63 個(gè)氨基酸的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，稱為同源結(jié)構(gòu)域

。早期研究表明，DUXAP9 在肝細(xì)胞癌中異常高表達(dá)，其表達(dá)水平與患者的預(yù)后不良密切相關(guān)

。此外，研究還發(fā)現(xiàn)DUXAP9 能促進(jìn)腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖

。目前DUXAP9 在頭頸鱗癌中功能和作用機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探討DUXAP9 在頭頸鱗癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)，評(píng)估DUXAP9 對(duì)頭頸鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和裸鼠皮下成瘤能力的影響，進(jìn)一步探討DUXAP9 可能的分子作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本、動(dòng)物、細(xì)胞及試劑

30 例新鮮頭頸鱗癌及癌旁正常組織樣本，均取自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面頭頸腫瘤科住院患者。本研究獲得上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（滬九院科倫審：［2016］144 號(hào)），所有參與者在入組前均簽署知情同意書，并對(duì)應(yīng)有完整的病理和臨床資料。所使用的人源頭頸鱗癌細(xì)胞系，包括WSU-HN4、WSU-HN6 和WSU-HN30（以下分別稱為HN4、HN6 和HN30）均來(lái)自于美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院，由美國(guó)馬里蘭大學(xué)牙學(xué)院友情饋贈(zèng)；人源HNSCC 細(xì)胞系CAL27 購(gòu)買于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（American type culture collection，ATCC）；人正常鱗狀上皮（normal oral keratinocytes，NOK）細(xì)胞取自臨床拔牙后患者的正常牙齦黏膜組織進(jìn)行原代培養(yǎng)。SPF 級(jí)裸鼠（7 周）購(gòu)自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部。

（7）土體孔壓消散主要為水平向。由本次測(cè)試參數(shù)可知，老路基由于孔壓消散較慢，則固結(jié)系數(shù)相對(duì)較大，滲透系數(shù)也較大，說(shuō)明老路基固結(jié)程度較高。

OE Biotech Human WT lncRNA 芯片（Affymetrix公司，美國(guó)），Trizol（15596018，Invitrogen 公司，美國(guó)），Hiscript QRT supermix for qPCR（+gDNA WIPER）（R123-01，Vazyme 公司，中國(guó)），2× SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒（bimake 公司，美國(guó)），Lipofectamine 3000 試劑（Invitrogen 公司，美國(guó)），DUXAP9 Smart Silencer（SS-DUXAP9）、SS-NC（銳博生物有限公司，中國(guó)）；GAPDH、DUXAP9、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、Snail、波形蛋白（Vimentin）的實(shí)時(shí)定量PCR 引物合成（上海生工生物工程有限公司，中國(guó)）。

1.2.2 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中分析DUXAP9 在頭頸鱗癌組織中的表達(dá)水平及其與臨床預(yù)后的關(guān)系 首先進(jìn)行泛癌分析，頭頸鱗癌患者（502 例，工作流類型：HTseq-FPKM）的基因表達(dá)數(shù)據(jù)及相應(yīng)的臨床信息從TCGA 的頭頸鱗癌項(xiàng)目（https：//genomecancer.ucsc.edu/）下載。納入診斷為頭頸鱗癌且隨訪信息完整的患者。之后將level 3 HTseq-FPKM 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為TPM（transcripts per million）格式并進(jìn)行l(wèi)og2 轉(zhuǎn)化，以進(jìn)行進(jìn)一步分析。不可用和未知的臨床特征被認(rèn)為是缺失值。本研究符合TCGA 規(guī)定的出版指南。

國(guó)家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)顯示，截至9月末，石油和化工行業(yè)規(guī)模以上企業(yè)27702家，累計(jì)增加值同比增長(zhǎng)4.9%，增幅比1～8月加快0.1個(gè)百分點(diǎn)，低于同期全國(guó)規(guī)模工業(yè)增加值增幅1.5個(gè)百分點(diǎn)。其中，化學(xué)工業(yè)增加值增長(zhǎng)4.0%，比1～8月加快0.2個(gè)百分點(diǎn)；石油天然氣開采業(yè)增長(zhǎng)4.1%，加快0.4個(gè)百分點(diǎn)；煉油業(yè)增幅6.9%，回落0.2個(gè)百分點(diǎn)。

兔抗人多克隆E-cadherin 抗體、N-cadherin 抗體、Vimentin 抗體、Snail 抗體（Abclonal，中國(guó)），羊抗免lgG 二抗（Abclonal，中國(guó)）。LumiQ 通用型ECL 發(fā)光液（Sharebio，中國(guó)），1 × 無(wú)蛋白快速封閉液（雅酶，中國(guó)）。含0.02% EDTA 的0.25%胰蛋白酶溶液（Gibco，美國(guó)），BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天，中國(guó)）。CCK-8 試劑（Dojindo，Kumamoto，日本），Transwell 小室（Corning，美國(guó)），4%多聚甲醛（Servicebio，中國(guó)），0.1%結(jié)晶紫染液（Solarbio，中國(guó)）。胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（Gibco 公司，美國(guó)），青霉素和鏈霉素（Gibco 公司，美國(guó)）、DMEM 培養(yǎng)基（源培，中國(guó)）。CO

恒溫培養(yǎng)箱（Thermo Fisher，美國(guó)）。微量移液器（Eppendorf，德國(guó)），UV/Vis微板分光光度計(jì)（Multiskan

Sky Spectrophotometer，Thermo Scientific，美國(guó)），酶標(biāo)儀（Multiskan

Sky High，ThermoFisher，美國(guó)），高速離心機(jī)（CT15RE，Hitachi，日本），倒置相差顯微鏡（GFM-600，上海光密儀器有限公司，中國(guó)），高速臺(tái)式離心機(jī)（Multifuge X1 X1R，ThermoFisher，美國(guó)），羅氏480 熒光定量PCR 儀（Roche，美國(guó)），化學(xué)發(fā)光成像儀（ImageQuant LAS 4000 mini，General Electric Company，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 頭頸鱗癌組織差異表達(dá)的lncRNA 的篩選 使用OE Biotech Human WT lncRNA 芯片篩選5 對(duì)頭頸鱗癌組織及其配對(duì)的癌旁正常組織中差異表達(dá)的lncRNA。篩選標(biāo)準(zhǔn)為L(zhǎng)og2 Fold Change ＞1.5，且

＜0.05，篩選Kaplan Meier 預(yù)后分析存在顯著直接相關(guān)性（HR 大于1.4，且

＜0.001）的lncRNA。

本工程建筑平面長(zhǎng)寬約為333m×105m，為超長(zhǎng)結(jié)構(gòu)，為解決大體積混凝土澆筑易產(chǎn)生的溫差、混凝土收縮以及塔樓與裙房的不均勻沉降等問(wèn)題，將地上各單體進(jìn)行分縫處理，地下室部分聯(lián)成一體設(shè)置后澆帶處理。根據(jù)地質(zhì)報(bào)告提供的土質(zhì)狀況，東、西翼塔樓基礎(chǔ)采用樁筏，樁基采用直徑800mm的泥漿護(hù)壁鉆孔灌注樁基礎(chǔ)；裙房部分采用整體筏板，柱下加下柱墩解決筏板沖切問(wèn)題。通過(guò)上述基礎(chǔ)設(shè)置，可有效防止整體建筑的不均勻沉降，并控制柱間的沉降差，使之滿足相關(guān)規(guī)范的要求。

統(tǒng)計(jì)分析采用R（3.6.3）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Kaplan-Meier 方法分析DUXAP9 表達(dá)與總生存期（overall survival，OS）相關(guān)的臨床病理特征。用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)比較DUXAP9 在腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)。將樣本分為高表達(dá)組和低表達(dá)組（中位數(shù)DUXAP9 表達(dá)水平作為截?cái)嘀担?。接下?lái)，使用SurvivalROC R 軟件包繪制ROC 曲線，測(cè)試DUXAP9 作為診斷標(biāo)志物的性能。使用ggplot2 R包用于DUXAP9 和Snail 的表達(dá)相關(guān)性分析和可視化。

由于滑坡深部位移監(jiān)測(cè)難度較大、精度較低及地表GPS監(jiān)測(cè)技術(shù)的成熟，且考慮到地表監(jiān)測(cè)點(diǎn)和滑帶巖土體位移時(shí)序具有基本相同的規(guī)律特征，研究人員主要基于地表GPS位移監(jiān)測(cè)信息進(jìn)行滑坡位移預(yù)測(cè)及災(zāi)害預(yù)報(bào)[1-3]。目前，已有眾多的滑坡位移預(yù)測(cè)模型被提出，極大了推動(dòng)了滑坡位移預(yù)測(cè)及災(zāi)害預(yù)測(cè)預(yù)警研究。這些位移預(yù)測(cè)方法主要可分為4類：

護(hù)理后,觀察組焦慮、抑郁情緒改善較對(duì)照組明顯,評(píng)分均較對(duì)照組低,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1:

“是這樣。昨天我和靜秋，都喝得有點(diǎn)多。飯后本想打個(gè)車送靜秋回家，可是等了很久，也沒有出租車。陪她走了一會(huì)兒，雨又下起來(lái)，越下越大。那時(shí)我們正好走到山水大酒店，就進(jìn)去避了一會(huì)兒雨。雨總是不停，靜秋喝得太多，吐了一地，又睡著了，我和服務(wù)生都喊不醒她。沒辦法只好開了個(gè)房間，讓她在那里休息一會(huì)兒。把她安頓好，我馬不停蹄……”

1.2.5 qRT-PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染SS-DUXAP9 的CAL27 和HN6 細(xì)胞中DUXAP9 相對(duì)表達(dá)量 對(duì)CAL27 細(xì)胞和HN6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染SS-NC（亂序siRNA 和ASO 對(duì)照）或SS-DUXAP9，24 h 后提取總RNA 后進(jìn)行qRTPCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DUXAP9 的表達(dá)，用GAPDH 基因作為對(duì)比的內(nèi)參基因。

使用R（3.6.3）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析見1.2.2。采用單因素方差分析或Student

檢驗(yàn)分析各組間差異的顯著性。

＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.3 qRT-PCR 檢測(cè)頭頸鱗癌組織樣本和細(xì)胞系中DUXAP9 表達(dá) 根據(jù)Trizol 操作說(shuō)明書對(duì)20 例組織樣本的勻漿和HN4、HN6、HN30、CAL27、NOK細(xì)胞分別進(jìn)行總RNA 抽提；根據(jù)Hiscript QRT supermix for qPCR（+gDNA WIPER）操作說(shuō)明書進(jìn)行RNA 逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。2 × SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析。引物列表如表1 所示。

②Transwell 遷移實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染SS-NC 或SSDUXAP9 24 h 后的CAL27 細(xì)胞和HN6 細(xì)胞，4 × 10

個(gè)細(xì)胞用200 μL 無(wú)血清培養(yǎng)基重懸接種于24 孔板的8 μm 孔隙率的Transwell 小室上室，下室加入600 μL 的DMEM+20%胎牛血清。24～36 h 后，穿過(guò)小室的細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min。顯微鏡拍攝Transwell 上室底部細(xì)胞，Image J 軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)。

③CCK-8 實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染SS-NC 或SS-DUXAP9 24 h 后的CAL27 細(xì)胞和HN6 細(xì)胞以1 000 個(gè)/孔的密度接種到96 孔板中，重復(fù)3 個(gè)副孔。將10 μL CCK-8 試劑添加到90 μL 培養(yǎng)基中。隨后將細(xì)胞在37 ℃下培養(yǎng)2 h，并使用UV/Vis 微板分光光度計(jì)在450 nm 和600 nm 處測(cè)量吸光度。

1.2.8 裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn) SPF 級(jí)裸鼠（7 周）購(gòu)自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部。在實(shí)驗(yàn)前，這些動(dòng)物被飼養(yǎng)在（22 ± 1）℃和（50 ± 5）%濕度的SPF 標(biāo)準(zhǔn)籠子中。

將轉(zhuǎn)染SS-NC 或SS-DUXAP9 72 h 后的CAL27細(xì)胞和HN6 細(xì)胞進(jìn)行蛋白抽提，制膠上樣電泳，免疫印跡（濕轉(zhuǎn)），封閉40 min，加入E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Snail 和GAPDH 抗體一抗，4 ℃過(guò)夜孵育。TBST 洗膜3 次，10 min/次。加入二抗孵育1 h。TBST 洗膜3 次，10 min/次。ECL 試劑盒顯色，化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，保存圖片分析。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 沉默DUXAP9 的Smart Silencer（SS-DUXAP9）由銳博生物有限公司設(shè)計(jì)和合成。siRNA#1：GATAGAATAGTGACAATAA；siRNA#2：GACCCATCACAAAGTTTAA；siRNA#3：GAGATATGTAGTAAAGCAA；ASO#1：GCTGTACACAAATACTGAAC；ASO#2：TACAATCTAAGTGGTTGGAC；ASO#3：AAATATGCACTTCCCACAAC。按照制造商的說(shuō)明，使用Lipofectamine 3000 試劑對(duì)CAL27 細(xì)胞和HN6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染相應(yīng)的siRNA 和ASO。

1.2.7 qRT-PCR、Western blot 檢測(cè)EMT 相關(guān)基因、蛋白表達(dá) 將轉(zhuǎn)染SS-NC 或SS-DUXAP9 48 h 后的CAL27 細(xì)胞和HN6 細(xì)胞進(jìn)行總RNA 的提取，進(jìn)行qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)GAPDH、DUXAP9、E-cadherin、N-cadherin、Snail 和Vimentin 的RNA 表達(dá)水平，操作同1.2.5。

小鼠分對(duì)照組（注射轉(zhuǎn)染SS-NC 的CAL27 細(xì)胞皮下成瘤組）和實(shí)驗(yàn)組（注射轉(zhuǎn)染SS-DUXAP9 的CAL27 細(xì)胞皮下成瘤組），每組5 只小鼠。將1 ×10

個(gè)CAL27 細(xì)胞接種于5 只小鼠左右背側(cè)皮下，注射100 μL 無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基含1 × 10

個(gè)預(yù)處理的CAL27 細(xì)胞。每4 d 用卡尺測(cè)量腫瘤大小。腫瘤體積的測(cè)量方法如下：腫瘤體積＝長(zhǎng)× 寬×寬/2。動(dòng)物處死后，采集腫瘤標(biāo)本，測(cè)量重量。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的操作和處理得到上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：SH9H-2019-A56-1）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

1.2.6 細(xì)胞劃痕、Transwell 遷移、CCK-8 實(shí)驗(yàn)①細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 比較轉(zhuǎn)染SS-NC（對(duì)照組）或SSDUXAP9（實(shí)驗(yàn)組）的CAL27細(xì)胞和HN6細(xì)胞在培養(yǎng)0 h和24 h細(xì)胞遷移能力的差異，以驗(yàn)證DUXAP9的沉默是否會(huì)對(duì)CAL27 和HN6 細(xì)胞的遷移能力有影響，標(biāo)記并測(cè)量三個(gè)視野，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

建筑物體形系數(shù)是指建筑物接觸室外大氣的外表面積與其所包圍的體積的比值[4]。建筑物體形宜規(guī)則，減少凹凸，可適當(dāng)增加房屋的進(jìn)深，減少其外表面積，通過(guò)這些措施可減少體形系數(shù)。體積小、體形復(fù)雜的建筑，以及平房和低層建筑物，體形系數(shù)較大，對(duì)節(jié)能不利；而體積大、體形簡(jiǎn)單的建筑物，以及多層和高層建筑，體形系數(shù)較小，對(duì)節(jié)能較為有利。在其他條件相同的條件下，進(jìn)深大的建筑比進(jìn)深小的好，外表整齊的建筑比凹凸變化多的好，長(zhǎng)的比短的好，高的比矮的好，但建筑師在進(jìn)行建筑創(chuàng)作時(shí)要結(jié)合功能綜合考慮。一般來(lái)講，體形系數(shù)不大于0.30，體形系數(shù)越小節(jié)能效果越好。

2 結(jié) 果

2.1 DUXAP9 在頭頸鱗癌組織樣本和細(xì)胞系中高表達(dá)

對(duì)5 對(duì)頭頸鱗癌患者組織樣本和配對(duì)的癌旁組織樣本進(jìn)行l(wèi)ncRNA 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析后發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，DUXAP9 在頭頸鱗癌中異常高表達(dá)（圖1a、1b）。進(jìn)一步為了評(píng)估DUXAP9 在多種癌癥中的水平，首先通過(guò)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行泛癌分析（包括腫瘤組織和癌旁組織），發(fā)現(xiàn)DUXAP9 在大多數(shù)惡性腫瘤類型中表達(dá)上調(diào)，包括頭頸鱗癌，DUXAP9 在TCGA 正常標(biāo)本與TCGA 腫瘤標(biāo)本中的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖1c）。接下來(lái)，生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，與DUXAP9 低表達(dá)患者相比，DUXAP9 高表達(dá)的患者生存率差（圖1d）。此外，利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)頭頸鱗癌數(shù)據(jù)進(jìn)行ROC 分析顯示，以DUXAP9 的表達(dá)量可作為標(biāo)準(zhǔn)區(qū)分腫瘤及正常組織，其AUC 值可達(dá)0.884，DUXAP9 可以作為頭頸鱗癌患者早期診斷的生物標(biāo)志物（圖1e）。進(jìn)一步為評(píng)估DUXAP9 在頭頸鱗癌中的表達(dá)水平，在頭頸鱗癌組織樣本（圖1f）和細(xì)胞系（圖1g）中檢測(cè)DUXAP9 的表達(dá)水平，qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)表明DUXAP9 在頭頸鱗癌組織標(biāo)本和細(xì)胞系中異常高表達(dá)。

2.2 沉默DUXAP9 能顯著抑制頭頸鱗癌細(xì)胞的增殖和遷移能力

SS-DUXAP9 能有效地抑制DUXAP9 在CAL27和HN6 細(xì)胞中的表達(dá)水平（圖2a），細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，沉默DUXAP9 能顯著抑制CAL27 細(xì)胞和HN6 細(xì)胞的遷移能力（圖2b），Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)沉默DUXAP9 能顯著抑制CAL27 和HN6 細(xì)胞的遷移能力（圖2c）。同時(shí)，CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明沉默DUXAP9 可以顯著抑制CAL27 和HN6 細(xì)胞的增殖能力（圖2d）。

2.3 沉默DUXAP9 能顯著抑制EMT 相關(guān)基因的表達(dá)

經(jīng)qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在CAL27 和HN6 細(xì)胞中，沉默DUXAP9 基因能顯著增加E-cadherin 的mRNA 表達(dá)水平，降低N-cadherin、Vimentin 和Snail的mRNA 表達(dá)水平（圖3a、3b）；Western blot 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，在CAL27 和HN6 細(xì)胞中，沉默DUXAP9基因也能顯著增加E-cadherin 的蛋白表達(dá)水平，降低N-cadherin、Vimentin 和Snail 蛋白表達(dá)水平（圖3c）。此外，TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)進(jìn)一步提示，在頭頸鱗癌組織樣本中，DUXAP9 與Snail mRNA 的表達(dá)水平呈正相關(guān)性（

＝0.28）（圖3d）。

2.4 沉默DUXAP9 可明顯抑制裸鼠皮下成瘤能力

裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)表明，沉默DUXAP9 可顯著抑制CAL27 移植瘤的生長(zhǎng)；與對(duì)照組相比，沉默組的腫瘤體積和重量顯著減少（圖4）。

3 討 論

越來(lái)越多的證據(jù)表明，lncRNAs 在人類疾病進(jìn)展以及各種癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用

。研究發(fā)現(xiàn)，異常表達(dá)的lncRNAs 參與了頭頸鱗癌細(xì)胞的一些生物學(xué)過(guò)程，如增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移

。有報(bào)道，lncRNA DUXAP9 可以直接與Cbl-b（Cbl proto-oncogene B）結(jié)合，增強(qiáng)表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）信號(hào)通路，促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展

。在腎癌細(xì)胞中，DUXAP9 可以發(fā)生N6 -腺苷甲基化修飾，并與胰島素樣生長(zhǎng)因子2 mRNA 結(jié)合蛋白2（insulin like growth factor 2 mRNA binding protein 2，IGF2BP2）結(jié)合增加其穩(wěn)定性，通過(guò)PI3K/AKT 通路促進(jìn)腎癌細(xì)胞的增殖和遷移能力

。在肝細(xì)胞癌中，DUXAP9直接與Y 染色體性別決定區(qū)（sex-determing region of Y chromosome，SRY）-盒轉(zhuǎn)錄因子9（SRY-box transcription factor 9，SOX9）的3′非翻譯區(qū)（UTR）結(jié)合，增強(qiáng)了SOX9 mRNA 的穩(wěn)定性，增加了SOX9 的表達(dá)，從而促進(jìn)肝細(xì)胞癌的進(jìn)展

。本課題組通過(guò)lncRNA 轉(zhuǎn)錄組學(xué)比較5 對(duì)頭頸鱗癌組織標(biāo)本和配對(duì)癌旁組織標(biāo)本的差異表達(dá)lncRNAs，發(fā)現(xiàn)DUXAP9 在頭頸鱗癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)，通過(guò)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析，DUXAP9 上調(diào)表達(dá)與頭頸鱗癌患者預(yù)后差密切相關(guān)；裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)表明，沉默DUXAP9 可顯著抑制CAL27 移植瘤的生長(zhǎng)。

腫瘤的轉(zhuǎn)移是癌癥死亡的主要原因，在癌癥中，EMT（epithelial-mesenchymal transition）通過(guò)增強(qiáng)癌細(xì)胞的遷移能力、侵襲能力和對(duì)凋亡刺激的抵抗能力，賦予癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移特性

，EMT 是由一系列復(fù)雜的生物和生化變化組成

，這些變化導(dǎo)致細(xì)胞失去分化的上皮細(xì)胞樣形態(tài)，而獲得更多的間葉細(xì)胞樣的表型

。Snail 可通過(guò)EMT 在頭頸鱗癌中誘導(dǎo)和維持腫瘤干細(xì)胞樣特性的作用

。研究證明，NBS1 可通過(guò)上調(diào)Snail 來(lái)誘導(dǎo)EMT 的表型和促進(jìn)頭頸鱗癌的遷移侵襲能力

。本研究通過(guò)對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)分析的結(jié)果顯示，在頭頸鱗癌組織樣本中，DUXAP9 與Snail mRNA 的表達(dá)水平呈正相關(guān)性，提示DUXAP9 可能通過(guò)上調(diào)Snail 的表達(dá)來(lái)促進(jìn)EMT 進(jìn)程。

研究表明，高表達(dá)的N-cadherin 和低表達(dá)的Ecadherin 與鱗狀細(xì)胞癌的組織學(xué)分化、侵襲模式和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)

。而上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)是EMT 的標(biāo)志蛋白如N-cadherin、Vimentin 等上調(diào)和E-cadherin 等下調(diào)，這一過(guò)程受到復(fù)雜的信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)的嚴(yán)格調(diào)控

，研究顯示，Snail 可在頭頸鱗癌細(xì)胞和口腔上皮細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)EMT，下調(diào)上皮粘附物如E-cadherin 和β-catenin，和誘導(dǎo)間充質(zhì)標(biāo)記物如N-cadherin 的上調(diào)，進(jìn)而影響腫瘤的增殖轉(zhuǎn)移能力

。AKT 誘導(dǎo)的lncRNA VAL通過(guò)減少trim16 依賴的Vimentin 降解，促進(jìn)腫瘤的EMT 進(jìn)展

。LncRNA HOTAIR 可通過(guò)招募EZH2和H3K27me3 到局部染色質(zhì)中，從而抑制E-cadherin 的表達(dá)來(lái)促進(jìn)OSCC 的惡化

。本研究結(jié)果提示，沉默DUXAP9 能顯著增加E-cadherin 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平，降低N-cadherin、Vimentin和Snail 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平，提示DUXAP9可能通過(guò)調(diào)控EMT 介導(dǎo)的頭頸鱗癌細(xì)胞的遷移。

（3）群雄斗虎。領(lǐng)舞者持釣魚鞭向空中一舉，四名斗虎英雄持刀引領(lǐng)四虎轉(zhuǎn)至場(chǎng)北面，由東到西面朝南按①-④虎一字排開，領(lǐng)舞者一招“撥云見日”，四虎向前撲三撲，四名斗虎英雄在虎前做“三仆刀”，行至場(chǎng)南面。

綜上所述，DUXAP9 可以促進(jìn)頭頸鱗癌的增殖、遷移和裸鼠皮下成瘤能力。

【Author contributions】 Cao W，Ji T conceived and designed the study. Zhou WK，Wang JX conducted the

experiments. Wang YF，Chen M conducted the

experiments. Zhou WK，Liu ZQ wrote the manuscript. Zhang X，Tao XR analyzed the data. All authors have read and approved the final manuscript.

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