窄葉藍(lán)盆花種子生活力檢驗(yàn)方法比較*

呂麗娟，張曉明，穆贏通，樊東昌，王俊杰

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院，呼和浩特 010018)

蒙藥材藍(lán)盆花是川續(xù)斷科藍(lán)盆花屬，華北藍(lán)盆花(ScabiosatschiliensisGrunning.)和窄葉藍(lán)盆花(ScabiosacomosaFisch. ex Roem. et Schult.)的干燥花序，蒙藥名為套森-套日麻，性味澀、甘、鈍、膩、燥、重、涼；具有清熱、清“協(xié)日”瀉火的功效，臨床常用基礎(chǔ)藥物來治療多種疾病，主要用于治肺熱、肝熱、咽喉熱等疾病[1-3]。通常所用藥源采自野生植株。由于環(huán)境破壞導(dǎo)致資源緊缺，近幾年開始采用種子繁殖人工種植途徑。但市場上藍(lán)盆花種子(瘦果)胚發(fā)育不良，質(zhì)量參差不齊，嚴(yán)重限制了藍(lán)盆花的大規(guī)模種植。針對以上問題需制定藍(lán)盆花種子質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)，確保種子質(zhì)量是種植藍(lán)盆花的關(guān)鍵問題之一。種子生活力是種子質(zhì)量檢測的重要指標(biāo)之一[4]，目前測定生活力的常見方法有TTC法、紅墨水法、BTB法和紙上熒光法等。其中，TTC法是目前國際上常用的方法，大部分植物都采用此方法，如油桐[5]、黃芪[6]、滇重樓[7]；熒光法主要用于含有熒光物質(zhì)的種子，如白菜、甘藍(lán)[8]；鎖陽[9]、山豆根[10]常采用溴麝香草酚藍(lán)(BTB)法；紅墨水法測定種子生活力采用較少。本試驗(yàn)采用4種方法對窄葉藍(lán)盆花種子生活力進(jìn)行測定，以期找到藍(lán)盆花種子生活力測定的最佳方法，并對最佳方法進(jìn)行優(yōu)化，為藍(lán)盆花種子質(zhì)量分級提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料采自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟正鑲藍(lán)旗、呼倫貝爾市陳巴爾虎旗、呼和浩特市武川縣人工種植收獲的窄葉藍(lán)盆花種子，收獲后在4℃低溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1發(fā)芽率測定

在清選好的窄葉藍(lán)盆花凈種子中，隨機(jī)各挑選300粒，每重復(fù)100粒，3次重復(fù)，用75%對的酒精消毒45 s，用清水3次沖洗，放置于2層定性濾紙的培養(yǎng)皿中，25℃恒溫培養(yǎng)，每天進(jìn)行觀察記錄，保持濕潤。每天觀察時(shí)要開蓋放置20 min左右透氣，對發(fā)霉的且沒有腐爛的種子用蒸餾水沖洗后繼續(xù)進(jìn)行發(fā)芽，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)，觀察連續(xù)5 d無發(fā)芽種子即發(fā)芽停止。

發(fā)芽率計(jì)算方法為：發(fā)芽率(%)=發(fā)芽種子數(shù)/供勢種子數(shù)×100%。

1.2.2種子生活力測定

溴麝香草酚藍(lán)(BTB)法[10]:將完整無損的種子在25℃下浸泡2 h后去皮，煮沸失活種子做對照，適當(dāng)距離放入冷卻好的凝膠培養(yǎng)皿內(nèi)，放入25℃的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，放置pH為5.5～9.0的精密試紙，觀察pH試紙上出現(xiàn)黃色暈圈的為有活力種子，反之為無活力種子，統(tǒng)計(jì)記錄。

紙上熒光法[11]：將完整無損的種子在25℃下浸泡2 h后去皮，放在濕濾紙上放置2 h風(fēng)干濾紙，于紫外熒光燈下照射種子發(fā)光情況，發(fā)光為無生活力種子，反之為無活力種子，統(tǒng)計(jì)記錄，將發(fā)光與不發(fā)光種子放入25℃溫箱進(jìn)行發(fā)芽驗(yàn)證。

紅墨水法[11]：將普通紅墨水按1∶9的比例稀釋作為染色劑，將25℃下浸泡2 h后的種子剝皮，加入配好的紅墨水中置于30℃恒溫染色20 min，沖洗觀察，將煮沸失去活力的種子作對照，種胚不著色或是微著色為有活力種子，反之無活力。

氯化三苯基四氮唑(TTC)法[11-12]：煮沸失活種子作對照，配置0.5% TTC溶液，將25℃下浸泡2 h后種子去皮，倒入TTC溶液置于30℃的恒溫箱內(nèi)避光放置1 h，統(tǒng)計(jì)種子顏色。種胚被染成鮮紅色或紅色為有活力的種子，反之為無活力種子。計(jì)算方法為：生活力(%)=有活力種子數(shù)/供勢種子數(shù)×100%。

1.2.3TTC法最適條件參數(shù)確定

采用5因素4水平正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)，將窄葉藍(lán)盆花種子在不同溫度下，用清水浸泡30 min、60 min、90 min，120 min去皮放入提前清洗好的培養(yǎng)皿中，加不同濃度TTC于培養(yǎng)皿內(nèi)，浸沒種子，將培養(yǎng)皿置于不同溫度的恒溫箱內(nèi)避光染色，3次重復(fù)，染色30 min、60 min、90 min、120 min時(shí)，統(tǒng)計(jì)種子顏色。

表1 正交實(shí)驗(yàn)生活力測定因素水平

1.2.4數(shù)據(jù)處理

采用DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 四種方法測定種子生活力結(jié)果與發(fā)芽率關(guān)系分析

2.1.1紅墨水法

采用紅墨水法對3個(gè)地區(qū)窄葉藍(lán)盆花種子生活力進(jìn)行測定，結(jié)果表明種子生活力與發(fā)芽率差異不顯著(表2)。

2.1.2紙上熒光法

紙上熒光法測得3個(gè)地區(qū)窄葉藍(lán)盆花種子生活力值為4種方法中最高，種子生活力與發(fā)芽率差異顯著(表2)，發(fā)光與不發(fā)光的種子均有部分種子發(fā)芽。

2.1.3BTB法

BTB法測得的3個(gè)地區(qū)窄葉藍(lán)盆花種子生活力均與發(fā)芽率無顯著差異(表2)，種子周圍出現(xiàn)黃色光圈不易分辨(圖1)。

表2 不同方法測定種子生活力比較

2.1.4TTC法

TTC法測得的3個(gè)地區(qū)窄葉藍(lán)盆花種子生活力與發(fā)芽率無顯著差異，而且種子染色情況易辨別(圖1)。

IY :A1.紅墨水法有生活力種子；A2.紅墨水法無生活力種子；B.紙上熒光法有生活力活和無生活力種子；C1.TTC法有生活力種子；C2.TTC法無生活力種子；D.BTB有生活力活和無生活力種子。

2.1.5不同方法生活力比較

結(jié)果表明4種方法測定窄葉藍(lán)盆花種子生活力中，紅墨水法與紙上熒光法差異顯著，紅墨水法測得的種子生活力低于發(fā)芽率，紙上熒光法發(fā)光與不發(fā)光種子均有部分種子發(fā)芽，兩種方法都不適合測定窄葉藍(lán)盆花種子生活力。BTB法與TTC法測得的種子生活力差異不顯著(P<0.05)，都略高于發(fā)芽率。

2.2 TTC法最佳條件篩選分析

BTB法與TTC法都可用于對窄葉藍(lán)盆花種子生活力進(jìn)行測定，但BTB法相較于TTC法操作繁瑣且黃色光圈不易觀察，因此測定窄葉藍(lán)盆花種子生活力最適方法為TTC法。

采用5因素4水平的正交實(shí)驗(yàn)對TTC法進(jìn)行優(yōu)化，得出結(jié)果(表3)。窄葉藍(lán)盆花種子生活力最低組合為組合1在25℃下浸種30 min，用濃度為0.1%的TTC在25℃恒溫箱中染色避光30 min和組合8在40℃下浸種60 min，用濃度為0.5%的TTC在30℃恒溫箱中染色避光30 min的種子不染色或染有少量淺粉色；生活力最高組合為組合11，在35℃下浸種60 min，用濃度為0.1%的TTC在30℃恒溫箱中染色避光120 min，種子染成鮮紅色或紅色。對所得的正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行極差分析，得出表3，根據(jù)所得極差R值得大小，5個(gè)因素對種子生活力的影響大小為：TTC濃度>染色時(shí)間>浸種時(shí)間>浸種溫度>染色溫度，TTC濃度對種子生活力的測定值影響最大，染色時(shí)間與浸種時(shí)間次之，浸種溫度與染色溫度對種子生活力的測定值影響較小。

表3 TTC法正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過分析J1、J2、J3、J4總結(jié)各因素對窄葉藍(lán)盆花種子生活力影響規(guī)律，挑選出測定窄葉藍(lán)盆花種子生活力的最優(yōu)條件。浸種時(shí)間：隨著浸種時(shí)間變長，種子生活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，J3值達(dá)到最大，90 min為最適浸種時(shí)間；浸種溫度：隨著浸種溫度升高，生活力先升高達(dá)到一定值時(shí)趨于穩(wěn)定，J3達(dá)到最大，之后再升高溫度對生活力影響不顯著，35℃為最適浸種溫度；TTC濃度：隨著TTC濃度的增加，生活力逐漸降低，高濃度TTC抑制種子的種子生活力，TTC濃度為0.1%時(shí)生活力最高；染色溫度：染色的溫度相較于其他因素，對種子生活力影響較小，隨溫度的增加，種子生活力呈先增加后平穩(wěn)，溫度達(dá)到35℃后，再增大溫度，種子生活力差異不顯著；染色時(shí)間：生活力隨著染色時(shí)間的增長而升高，種子顏色由淺到深90 min后被染色種子數(shù)穩(wěn)定不變，顏色最深。綜合上述所確定的較優(yōu)組合為窄葉藍(lán)盆花種子在35℃下浸種90 min，用濃度為0.1%的TTC在35℃溫箱中避光染色90 min。

對正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明(表4)對于5個(gè)因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果都有顯著影響。

表4 TTC法正交實(shí)驗(yàn)方差分析

3 討論與結(jié)論

3.1 窄葉藍(lán)盆花種子生活力的最佳測定方法

種子生活力反映了種子發(fā)芽的潛在能力或種胚具有的生命力，是判斷種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，真實(shí)的發(fā)芽率小于或等于種子的生活力，并且對于種子質(zhì)量分級有重要的作用[4,13-14]。本研究中采用目前最常用的四種生活力測定方法測定窄葉藍(lán)盆花種子生活力，結(jié)果顯示紅墨水法測定結(jié)果為生活力低于發(fā)芽率，沈宇峰等[13]用紅墨水法測定白術(shù)種子生活力也出現(xiàn)了生活力低于發(fā)芽率的情況，因此，此方法不適合測定窄葉藍(lán)盆花及白術(shù)種子生活力；紙上熒光法只適合測定含有熒光物質(zhì)種子的生活力，已有研究表明此法用來測定十字花科類種子生活力，效果最佳；BTB法測定窄葉藍(lán)盆花種子周圍黃色光圈不明顯，不宜判斷，孫榮進(jìn)等[15]利用BTB法測定蔓荊子種子生活力，雖然黃色暈圈比較明顯，但死種子和活種子間差異不顯著，難判斷；TTC法測定的種子生活力接近發(fā)芽率且容易辨別種子有無生活力，為最適測定藍(lán)盆花種子生活力的方法。

3.2 TTC法測定窄葉藍(lán)盆花種子生活力的最佳條件

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)隨著TTC染色時(shí)間的增加，染色效果先好后差，這與雷慧霞等研究的芍藥種子生活力的研究結(jié)果相似[12]。通過設(shè)置了不同的染色處理，發(fā)現(xiàn)浸種時(shí)間、浸種溫度、染色時(shí)間、染色溫度、染色濃度均對藍(lán)盆花種子生活力有顯著影響，但是TTC濃度影響最大，染色時(shí)間次之，這與芍藥種子和獨(dú)活種子結(jié)果不同，芍藥種子生活力影響最大的因素是浸種時(shí)而獨(dú)活種子生活力影響最大的因素是染色溫度[12,16]，而影響白鮮[17]種子生活力最大的因素是浸種溫度，其次是TTC濃度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明窄葉藍(lán)盆花種子生活力采用TTC法測定的最佳條件為：種子在35℃下浸種30 min，用濃度為0.1%的TTC在35℃溫箱中避光染色90 min。