固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定3種中藥材中18種多環(huán)芳烴

李文斌，池艷艷，程 菲

(天津迪科馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，天津 300499)

多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是指含有兩個(gè)或多個(gè)苯環(huán)以線(xiàn)性、角狀或簇狀方式排列在一起的一類(lèi)化合物[1].PAHs是一種在環(huán)境中普遍存在的持久性有機(jī)污染物，由于其高脂溶性，很容易通過(guò)胃腸道被吸收，長(zhǎng)期接觸會(huì)引起免疫系統(tǒng)功能下降，具有強(qiáng)烈的致癌、致畸、致突變作用[2-3].中藥在其種植生長(zhǎng)過(guò)程中，會(huì)吸收來(lái)自空氣、土壤和水中的PAHs并在體內(nèi)富集積累，另外在中藥的加工過(guò)程中，通過(guò)炒、烘、焙、烤等工藝也會(huì)引入PAHs從而危害人體健康[2,4].早在1979年，美國(guó)環(huán)保署(US EPA)就已經(jīng)將16種PAHs列為優(yōu)先控制污染物[5]，韓國(guó)在2008年發(fā)布的《草藥中苯并芘的規(guī)格檢驗(yàn)方法提案》(G/TBT /N/KOR/197)中規(guī)定了生地黃和熟地黃兩種草藥中苯并[a]芘的最大容許量為5 μg/kg[2].歐盟2015/1933號(hào)法規(guī)規(guī)定了干草藥中苯并[a]芘最大含量10.0 μg/kg，并以苯并[a]芘、苯并[a]蒽、苯并[b]熒蒽和屈4種PAHs的總量規(guī)定了干草藥中PAHs最大使用限量為50.0 μg/kg[2].德國(guó)新的認(rèn)證技術(shù)文件ZEK01.4-08將管控的16種PAHs提高到了18種[6].隨著國(guó)際上對(duì)PAHs日益關(guān)注，為了規(guī)范中藥的種植生產(chǎn)過(guò)程、保障人體健康、促進(jìn)中藥打開(kāi)國(guó)際貿(mào)易市場(chǎng)，建立一種簡(jiǎn)便、快速測(cè)定中藥材中PAHs的方法具有重要意義.

PAHs的分析方法主要包括液相色譜法(LC)[7-8]、氣相色譜質(zhì)譜法(GC-MS)[6,9-10]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[11-13].早期PAHs檢測(cè)常用液相串聯(lián)熒光或者紫外檢測(cè)器，具有較高的靈敏度，由于液相色譜主要通過(guò)保留時(shí)間定性，針對(duì)復(fù)雜的樣品基質(zhì)容易出現(xiàn)假陽(yáng)性的問(wèn)題.相比之下GC-MS/MS定性能力強(qiáng)，檢出限低，適合復(fù)雜基質(zhì)PAHs的分析，但同時(shí)也存在價(jià)格高昂不易推廣的問(wèn)題，與前兩者相比GC-MS法在具備高的靈敏度和抗干擾能力的同時(shí)，價(jià)格適宜，是目前應(yīng)用比較廣泛的檢測(cè)PAHs手段也是本文使用的檢測(cè)方法.

中藥材中PAHs的檢測(cè)屬于痕量分析，其基質(zhì)復(fù)雜，含有色素、糖類(lèi)化合物、萜內(nèi)脂、有機(jī)酸、甾類(lèi)、揮發(fā)油等多種成分.國(guó)內(nèi)目前通用的食品中PAHs檢測(cè)方案GB 5009.265—2016對(duì)于中藥類(lèi)復(fù)雜基質(zhì)的檢測(cè)并不完全適合.已有文獻(xiàn)報(bào)道的針對(duì)中藥PAHs前處理方法主要有固相萃取法[4,14-15]、液液萃取法[16]、凝膠滲透色譜(GPC)結(jié)合SPE法[13]、固相微萃取法[17]、濁點(diǎn)萃取法[18].其中固相萃取法樣品用量少，凈化結(jié)果明顯、回收率高，集樣品純化和富集于一身、填料可選擇性強(qiáng)，特別適合痕量成分分析，具有明顯的技術(shù)優(yōu)勢(shì)[19]，目前已廣泛應(yīng)用于環(huán)境、制藥、食品等領(lǐng)域.本研究考察了雞血藤、牡蠣、琥珀、百合、丹參、陳皮、厚樸、金銀花、銀杏葉、魚(yú)腥草、平貝母、白豆蔻、枸杞等多種基質(zhì)，根據(jù)前處理的難易程度及樣品的潔凈情況，最終選擇了難、中、易三種樣品，即簡(jiǎn)單基質(zhì)平貝母，稍復(fù)雜基質(zhì)厚樸，復(fù)雜基質(zhì)丹參作為論述對(duì)象.本文采用正己烷振蕩提取，通過(guò)Florisil柱和Proelut-PAH多環(huán)芳烴專(zhuān)用萃取柱聯(lián)合使用對(duì)提取液進(jìn)行凈化，GC-MS檢測(cè)，建立了丹參、平貝母和厚樸3種中藥材中18種PAHs的分析方法.該方法操作簡(jiǎn)單、凈化效率高、分析速度快，適用于類(lèi)似基質(zhì)中藥材中PAHs的檢測(cè).

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

GC-MS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜儀(日本島津公司)；HSC-24B氮吹儀(天津恒奧科技發(fā)展有限公司)；DM-PAH多環(huán)芳烴專(zhuān)用色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，迪馬科技)；ProElut Florisil弗羅里硅土柱(500 mg/6 mL，迪馬科技)；ProElut PAH多環(huán)芳烴專(zhuān)用萃取柱(700 mg/6 mL，迪馬科技).

18種PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度1 000 μg/mL，溶劑為甲苯,農(nóng)殘級(jí)，純度大于99.9%，迪馬科技，包含萘(Naphthalene)、苊烯(Acenaphthylene)、苊(Acenaphthene)、芴(Fluorene)、菲(Phenanthrene)、蒽(Anthracene)、熒蒽(Fluoranthene)、芘(Pyrene)、屈(Chrysene)、苯并[a]蒽(Benzo [a] anthracene)、苯并[b]熒蒽(Benzo [b] fluoranthene)、苯并[k]熒蒽(Benzo [k] fluoranthene)、苯并[j]熒蒽(Benzo [j] fluoranthene)、苯并[a]芘(Benzo [a] pyrene)、苯并[e]芘(Benzo [e] pyrene)、茚并[1,2,3-c,d]芘(Indeno [1,2,3-c，d] pyrene)、二苯蒽(Dibenzo [a, h] anthracene)、苯并[g,h,i]苝(Benzo [g, h, i] perylene).正己烷、二氯甲烷、乙腈均為色譜純(迪馬科技)，無(wú)水Na2SO4(天津福晨化學(xué)試劑有限公司).所使用溶劑需進(jìn)行溶劑空白檢測(cè)，所有玻璃器皿洗凈后，用正己烷充分潤(rùn)洗，干燥備用.丹參、平貝母、厚樸均購(gòu)自天津市某藥店.

1.2 樣品前處理

取中藥材粉碎成粉末，過(guò)三號(hào)篩(粒徑：355 μm)，取約5 g，精密稱(chēng)定，置50 mL離心管中，加入5 g無(wú)水硫酸鈉、20 mL正己烷，渦旋混合15 min，6 000 r/min離心2 min，吸取5 mL上清液待凈化.取Florisil柱，依次加入6 mL二氯甲烷、5 mL正己烷活化，加入待凈化液，控制流速0.5 mL/min，收集流出液1，以6 mL二氯甲烷-正己烷(體積比為1∶9)洗脫，控制流速0.5 mL/min，收集流出液2，合并流出液1、2，40 °C水浴氮吹至近干，以2 mL正己烷復(fù)溶，過(guò)PAH多環(huán)芳烴專(zhuān)用萃取柱(6 mL二氯甲烷、5 mL正己烷活化)，3 mL正己烷淋洗，20 mL二氯甲烷洗脫，收集洗脫液在40 °C水浴氮吹至近干，加入正己烷定容到1 mL，混勻，供GC-MS分析.

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確量取適量18種PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以正己烷配制成50、2.5、0.5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液，4 ℃冷藏保存.稱(chēng)取6份實(shí)際樣品，經(jīng)過(guò)1.2樣品前處理，作為樣品基質(zhì)溶液，加入適量標(biāo)準(zhǔn)中間液，配制成質(zhì)量濃度為5、10、20、50、100、200 μg/L的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液.

1.4 GC-MS條件

1.4.1 色譜條件

DM-PAH色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為高純氦氣，流速2.0 mL/min；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣口溫度：320 ℃；升溫程序：初始溫度65 ℃，保持0.5 min，以15 °C/min升溫至220 °C，保持1 min，再以4 °C /min升溫至330 °C，保持5 min.

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：EI源，離子源溫度：230 ℃，接口溫度：280 ℃，溶劑延遲時(shí)間：5 min，掃描方式：選擇離子模式(SIM).18種PAHs的質(zhì)譜參數(shù)如表1所列.

表1 18種PAHs質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，分析PAHs時(shí)通常使用DM-5MS柱[12]或PAH柱[4,6].本文考察DM-5MS(30 m×0.25 mm×0.35 μm)和DM-PAH(30 m×0.25 mm×0.25 μm)兩種色譜柱的分離效果.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組同分異構(gòu)體苯并芘和苯并[e]芘以及苯并[k]熒蒽和苯并[j]熒蒽在DM-5MS上無(wú)法基線(xiàn)分離，使用DM-PAH柱經(jīng)過(guò)優(yōu)化升溫程序，除了茚并[1,2,3-c,d]芘和二苯蒽在色譜圖中存在的部分峰重疊現(xiàn)象，可通過(guò)它們的定性、定量離子的不同來(lái)區(qū)分，其它16種PAHs在40 min內(nèi)完全分離，標(biāo)準(zhǔn)譜圖如圖1所示，可見(jiàn)各組分具有良好的分析結(jié)果.

圖1 18種PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖(SIM)

2.2 固相萃取條件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

樣品的提取是樣品前處理的重要環(huán)節(jié)，合適的提取溶劑及提取方法會(huì)直接影響后期的回收率及凈化效果.多環(huán)芳烴類(lèi)化合物不易溶于水，易溶于多種有機(jī)溶劑，故而不選擇水作為提取溶劑.考慮到中藥樣品成分復(fù)雜的特點(diǎn)，選取強(qiáng)極性、弱極性的乙腈、正己烷兩種溶劑對(duì)樣品進(jìn)行提取，并考察其提取效率.當(dāng)乙腈提取樣品時(shí)，PAHs類(lèi)化合物回收率整體偏低，且譜圖中部分化合物會(huì)有明顯干擾.另外，對(duì)于顏色較深的丹參樣品，乙腈提取后，提取液顏色明顯較深，進(jìn)一步說(shuō)明使用乙腈時(shí)，雜質(zhì)更多的被提取出來(lái).采用正己烷進(jìn)行提取，回收率提升比較顯著，而且譜圖比較干凈，推斷是正己烷對(duì)于非極性的PAHs溶解性更強(qiáng)，同時(shí)中藥樣品中極性干擾物質(zhì)正己烷不易提取出來(lái)，基于提取更多的目標(biāo)化合物且提取出更少雜質(zhì)的提取原則，選用正己烷作為提取溶劑.使用不同溶劑提取的回收率結(jié)果對(duì)比如圖2所示.

圖2 不同提取溶劑對(duì)18種PAHs回收率影響 (n=3)

2.2.2 固相萃取柱的選擇

目前，常用的樣品前處理凈化方法有分散固相萃取(QueChERS)、固相萃取(SPE)等.QueChERS是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種樣品前處理技術(shù)，具有快速、便捷等特點(diǎn).但是該法存在一定的局限性，由于方法沒(méi)有淋洗過(guò)程而是通過(guò)單一的吸附雜質(zhì)機(jī)理進(jìn)行凈化，所以對(duì)于復(fù)雜化合物的前處理還存在凈化效果不理想的問(wèn)題.而中藥樣品成分復(fù)雜，通常有糖類(lèi)、氨基酸、蛋白質(zhì)、油脂、蠟、酶、色素、維生素、有機(jī)酸、鞣質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽、揮發(fā)油、生物堿、甙類(lèi)等干擾檢測(cè)成分，通過(guò)填料組合吸附雜質(zhì)的凈化模式(QueChERS)不易去除.SPE作為經(jīng)典樣品前處理技術(shù)，在凈化復(fù)雜樣品基質(zhì)面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì).

本試驗(yàn)最初選用PAH多環(huán)芳烴專(zhuān)用萃取柱進(jìn)行凈化，PAH多環(huán)芳烴專(zhuān)用萃取柱為復(fù)合柱產(chǎn)品，內(nèi)含弱陰離子填料及分子印跡材料，可通過(guò)離子交換作用力、氫鍵作用力吸附樣品中有機(jī)酸、碳水化合物、色素、氨基酸等雜質(zhì)，同時(shí)還具有分子印跡材料對(duì)目標(biāo)化合物PAHs進(jìn)行選擇性吸附作用，采用正己烷上樣、淋洗，二氯甲烷洗脫，對(duì)于簡(jiǎn)單基質(zhì)平貝母，稍復(fù)雜基質(zhì)厚樸樣品可達(dá)到良好的回收率和凈化效果.但是對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)丹參，苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、苯并[j]熒蒽、苯并[a]芘、苯并[e]芘幾個(gè)化合物出峰位置有明顯干擾，同時(shí)基線(xiàn)偏高.考慮到樣品基質(zhì)特性，丹參中含有大量丹參酮、丹參酸等干擾物質(zhì)，可與極性吸附材料表面羥基形成氫鍵相互作用力，故而采用Florisil柱預(yù)凈化的方式，即樣品提取液先進(jìn)行Florisil柱通過(guò)保留干擾物模式初步凈化，然后再使用PAH多環(huán)芳烴專(zhuān)用萃取柱通過(guò)保留目標(biāo)化合物模式再凈化，由圖3可知，除雜效果明顯，化合物可準(zhǔn)確定量.

圖3 不同萃取柱凈化丹參樣品譜圖對(duì)比

2.2.3 流速的選擇

固相萃取凈化過(guò)程中，流速是影響試驗(yàn)結(jié)果的重要因素之一.通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)行Florisil柱預(yù)凈化時(shí)，流速對(duì)回收率影響較大，常規(guī)流速約為1 mL/min，但回收結(jié)果偏低，多數(shù)化合物回收率低于80%，降低流速至約為0.5 mL/min時(shí)，回收率明顯提升，均高于80%，不同流速結(jié)果如圖4所示，最終選擇0.5 mL/min為Florisil柱預(yù)凈化時(shí)流速.

圖4 Florisil柱流速對(duì)18種PAHs回收率影響 (n=3)

2.2.4 洗脫溶劑選擇

選用丹參加標(biāo)樣品進(jìn)行提取，提取液以Florisil柱預(yù)凈化，分別選用正己烷、1%二氯甲烷正己烷、5%二氯甲烷正己烷、10%二氯甲烷正己烷、20%二氯甲烷正己烷進(jìn)行洗脫，流程同1.2.結(jié)果如圖5所示，當(dāng)采用10%、20%二氯甲烷正己烷時(shí)，18種PAHs回收率符合要求，以洗脫結(jié)果回收率高、洗脫液極性盡可能低為原則，在達(dá)到回收率要求的同時(shí)盡可能的減少洗脫下來(lái)雜質(zhì)，最終選擇10%二氯甲烷作為洗脫溶劑.

圖5 洗脫溶劑對(duì)18種PAHs回收率影響 (n=3)

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect, ME)是指樣品中的一種或幾種非待測(cè)組分對(duì)待測(cè)物濃度或質(zhì)量測(cè)定準(zhǔn)確度的影響，包括基質(zhì)抑制和基質(zhì)增強(qiáng)兩種效應(yīng).中藥樣品基質(zhì)復(fù)雜，進(jìn)行樣品分析時(shí)容易受到基質(zhì)干擾從而影響分析結(jié)果.本文采用中藥實(shí)際樣品，經(jīng)過(guò)1.2凈化過(guò)程前處理得到基質(zhì)溶液加入定量標(biāo)準(zhǔn)品與純?nèi)軇┲屑尤胂嗤瑵舛葮?biāo)準(zhǔn)品的方式評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)(ME)的影響，計(jì)算公式如下：ME=(扣除本底后基質(zhì)溶液中目標(biāo)物的峰面積/溶劑中相應(yīng)目標(biāo)物的峰面積-1)×100%，當(dāng)ME大于0時(shí)為基質(zhì)增強(qiáng)，ME小于0時(shí)為基質(zhì)抑制.ME的絕對(duì)值低于20%認(rèn)為不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng).試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，不同樣品基質(zhì)效應(yīng)明顯不同，多數(shù)化合物高于20%，因此，本試驗(yàn)采用樣品基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確性.

2.4 檢出限、定量限與線(xiàn)性范圍

選取丹參、厚樸、平貝母樣品基質(zhì)，采用1.3方法配制不同濃度基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，以目標(biāo)物定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)(y),對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn).各樣品中18種PAHs在5～200 μg/L的質(zhì)量濃度內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)均大于0.998.以信噪比為3計(jì)算，檢出限(LODs)為0.6～1.2 μg/kg.以信噪比為10計(jì)算，定量限(LOQs)為2.0～4.0 μg/kg.18種PAHs在各樣品中標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、相關(guān)系數(shù)、檢出限以及定量限如表2所列.

表2 18種PAHs標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、相關(guān)系數(shù)、檢出限以及定量限

續(xù)表2

2.5 方法的回收率與精密度

取中藥材粉碎成粉末，過(guò)三號(hào)篩(粒徑：355 μm)，取約5 g，精密稱(chēng)定，分別以4.0、8.0、40.0 μg/kg添加水平添加18種PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2方法進(jìn)行處理，每個(gè)樣品平行測(cè)定6次，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果如表3所列.由表3可見(jiàn)，丹參的回收率在81.5%～106.3%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.5%～7.8%.平貝母的加標(biāo)回收率在87.1%～108.3%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.1%～8.4%.厚樸的加標(biāo)回收率在82.4%～107.9%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.8%～6.9%.

表3 18種PAHs在丹參、平貝母和厚樸中加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

續(xù)表3

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

按照上述檢測(cè)方法對(duì)市售的丹參、平貝母和厚樸樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表4所列.由表4結(jié)果可見(jiàn)，三種藥材中分別檢出不同程度的PAHs，其中丹參樣品中有少量芴、熒蒽和芘檢出，平貝母樣品中只有少量苊檢出.厚樸樣品中苊烯、芘、苯并[a]蒽、屈、二苯并[a, h]蒽均有檢出，PAHs總檢出量為293.38 μg/kg，遠(yuǎn)高于丹參和平貝母的15.24和3.55 μg/kg.

表4 丹參、平貝母和厚樸中18種PAHs殘留量結(jié)果

3 結(jié)論

本研究建立了固相萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定丹參、平貝母和厚樸等3種中藥材中18種PAHs的檢測(cè)方法，對(duì)提取溶劑、固相萃取柱、流速、洗脫溶劑等條件進(jìn)行優(yōu)化.在丹參、平貝母、厚樸樣品中，以不同濃度添加水平進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差符合方法學(xué)要求.18種PAHs在5～200 μg/L的質(zhì)量濃度內(nèi)線(xiàn)性良好，檢出限在0.6～1.2 μg/kg之間，定量限在2.0～4.0 μg/kg之間.

該方法凈化效率高，準(zhǔn)確度、靈敏度良好，可為類(lèi)似基質(zhì)中藥材中PAHs安全評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制提供參考.通過(guò)實(shí)際樣品檢測(cè)，3種藥材中PAHs均有不同程度檢出，應(yīng)引起有關(guān)部門(mén)重視，采取相應(yīng)措施，系統(tǒng)代碼(簡(jiǎn)稱(chēng)“GS1統(tǒng)一編碼”)，與省財(cái)政資產(chǎn)云系統(tǒng)互聯(lián)互通，使省大儀平臺(tái)能獲取使用省財(cái)政資產(chǎn)云系統(tǒng)的所有單位的科研儀器底數(shù)情況.截止目前，省大儀平臺(tái)已集聚14 596臺(tái)可共享的30萬(wàn)元(含)以上大型科研儀器，原值達(dá)137.95億元.其中，國(guó)產(chǎn)科研儀器有3 628臺(tái)，原值達(dá)34.74億元，占比分別為24.86%、25.18%，如圖2所示.

以確保中藥材的安全性.重視中藥材的質(zhì)量管控，對(duì)于保障人體健康、促進(jìn)中藥現(xiàn)代化、走向國(guó)際貿(mào)易市場(chǎng)具有重要意義.