王小喬，許曉輝，張虹艷，馮 翀, 2，吳福祥，潘秀麗，李 赟，李晨曦

(1.蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院，甘肅 蘭州 730050；2.蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050)

真菌毒素是真菌的次生代謝產(chǎn)物，是全球食品和飼料中最常見的污染物之一[1].黃曲霉毒素是由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的一類真菌毒素，黃曲霉毒素分為M1、B1、B2、G1、G2等幾類，此類物質(zhì)對人和動物健康有著極強的危害[2].如果人類飲食中含有真菌毒素[3]，會嚴(yán)重?fù)p害中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟和腎臟，甚至發(fā)生腦損傷和死亡.牛奶及其奶制品中黃曲霉毒素來源一般是由于動物攝入被黃曲霉毒素污染的飼料，經(jīng)體內(nèi)代謝所產(chǎn)生[4]，或者生產(chǎn)加工過程中儀器清洗、包裝不當(dāng)?shù)?，暴露在空氣中發(fā)生有機物霉變[5-6].嬰幼兒奶粉質(zhì)量安全一直是全社會關(guān)注的焦點，食用被黃曲霉毒素污染的嬰幼兒奶粉對嬰幼兒的身體健康會造成危害.因此，開發(fā)一種快速、便捷、精確的檢測方法來篩查嬰幼兒奶粉中黃曲霉毒素是非常有必要的.

黃曲霉毒素的含量測定方法主要有高效液相色譜法[7-8]、酶聯(lián)免疫法[9]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10-11]等.因高效液相色譜法和酶聯(lián)免疫法檢出限高，不利于微量復(fù)雜樣品的檢測，特別是在含量極低的條件下難以檢測，而采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法卻能夠解決這些問題.黃曲霉毒素的法定限量值很低，復(fù)雜樣品基質(zhì)會降低其檢測靈敏度，因此需要減小基質(zhì)效應(yīng)以增強檢測靈敏度.檢測黃曲霉毒素時，最常用的去除雜質(zhì)的方法是免疫親和法.但是此方法所使用的凈化柱價格高、使用程序復(fù)雜、費時費力，不利于快速、高效篩查黃曲霉毒素[12-13].常規(guī)QuEChERS法(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged and Safe)是樣品萃取后經(jīng)C18或PSA凈化，其在分析脂肪含量高的樣品時，不能有效去除脂質(zhì)，導(dǎo)致檢測管路堵塞，出現(xiàn)色譜柱柱壓升高、色譜圖異常、重復(fù)性和精密度差等問題.而增強型脂質(zhì)去除技術(shù)是一種能夠選擇性去除復(fù)雜基質(zhì)中脂質(zhì)的獨特吸附劑，結(jié)合體積排阻和疏水相互作用，可以提升凈化效果.

為了監(jiān)控嬰幼兒奶粉中黃曲霉毒素的風(fēng)險因子，本文采用增強型脂質(zhì)去除分散式固相萃取管(enhanced matrix removal lipid-dispersed solid phase extraction，EMR-Lipid dSPE)的QuEChERS法凈化樣品，建立了一種超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜同時測定嬰幼兒奶粉中5種黃曲霉毒素的快速篩查方法.本研究所開發(fā)建立的方法前處理簡單、方便快捷，能夠快速篩查嬰幼兒奶粉中黃曲霉毒素的含量，為嬰幼兒奶粉的風(fēng)險因子監(jiān)控提供技術(shù)服務(wù).

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 6460A三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀(美國安捷倫)；分析天平(梅特勒-托利多)；渦旋混合器(美國Scientific)；5810 R離心機(德國艾本德)；SBL-10DT超聲清洗器(寧波新芝).

乙腈(HPLC級，德國Merck公司)；EMR-Lipid dSPE 凈化管(美國安捷倫)；甲酸、乙酸銨(HPLC級，東京化成工業(yè)株式會社)； 硫酸鈉、氯化鈉、乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)、檸檬酸、磷酸氫二鈉(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；水(屈臣氏).

對照品：黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合對照品溶液，批號SSBG004，純度：100.0%，來源FERMENTEK；黃曲霉毒素M1對照品溶液,批號18377-004，純度：100.0%，來源Bepure.

1.2 試驗方法

1.2.1 Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液

磷酸氫二鈉7.1 g、檸檬酸8.4 g、乙二胺四乙酸二鈉19.5 g，加水650 mL，溶解，即得.

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：精密量取質(zhì)量濃度分別為0.51、0.50、0.51、0.48 μg/mL的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液 1.00 mL和質(zhì)量濃度為0.50 μg/mL的黃曲霉毒素M1對照品溶液1.00 mL，置于10.00 mL容量瓶中，使用乙腈定容至刻度，搖勻，得到質(zhì)量濃度分別為51、50、51、48、50 ng/mL的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液.分別精密量取上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液2.00 mL至5 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液.

1.2.3 樣品溶液制備

提?。簻?zhǔn)確稱取1 g嬰幼兒奶粉，于50 mL離心管中，加入1粒陶瓷均質(zhì)子和 Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液3 mL，充分渦旋，精密加入乙腈10.00 mL，渦旋1 min，在300 W功率下超聲10 min后，加入萃取鹽包(4 g 硫酸鈉，1 g 氯化鈉)，充分渦旋1 min，4 000 r/min速度下離心10 min，取上清液待凈化.

凈化：精密吸取上述待凈化液2.00 mL置于EMR-Lipid dSPE凈化管中，渦旋1 min，4 000 r/min速度下離心10 min，取上清液，使用0.22 μm濾膜過濾后上液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定.

1.2.4 陰性樣品溶液的制備

取空白基質(zhì)樣品，按照“1.2.3”樣品溶液制備方法制成空白樣品溶液，即為陰性樣品溶液.

1.2.5 色譜條件

色譜柱：ACQUITY BEH C18柱(1.7 μm, 2.1 mm×100 mm)；流速：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；自動進(jìn)樣室溫度： 4 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；流動相：A為0.1%甲酸-2 mmol/L乙酸銨的水溶液，B為0.1%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脫程序如表1所列.

表1 流動相梯度洗脫程序

1.2.6 質(zhì)譜條件

電噴霧電離模式：正離子模式；氣流溫度：325 ℃；載氣流速：10 L/min；霧化器壓力：0.345 MPa；鞘氣流速：11 L/min；鞘氣溫度：350 ℃；毛細(xì)管電壓： 4 000 V；各個化合物主要質(zhì)譜參數(shù)如表2所列.

表2 主要質(zhì)譜參數(shù)

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用安捷倫液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀數(shù)據(jù)處理軟件MassHunter進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇

常用的提取溶劑有甲醇、乙腈、乙酸乙酯等.考慮到乙腈的鹽析效果較好，有利于后續(xù)的QuEChERS方式凈化樣品，且5種黃曲霉毒素在乙腈中的溶解性相比在甲醇和乙酸乙酯中好，因此選擇以乙腈為提取溶劑.因奶粉樣品為干燥粉末，因此在加入有機提取溶劑前先加入3 mL緩沖鹽溶液活化復(fù)原，而該緩沖鹽溶液能夠溶解樣品中水溶性雜質(zhì)，加入萃取鹽包后，在低溫高速狀態(tài)下離心使水相溶液和有機相提取液有效分層，雜質(zhì)被溶解到水相溶液中，去除雜質(zhì)效果良好.

2.1.2 凈化方法的選擇

嬰幼兒奶粉主要富含蛋白質(zhì)、脂類和磷脂，傳統(tǒng)的免疫親和柱凈化過程步驟繁瑣，且價格昂貴，操作費時費力.而增強型脂質(zhì)去除分散式固相萃取管，能夠同時去除脂肪和磷脂等雜質(zhì)，省去了活化、洗脫等步驟，簡化了操作過程，降低了成本，縮短了凈化時間.因此，本試驗以乙腈為提取溶劑，選擇QuEChER鹽包鹽析沉淀蛋白進(jìn)行粗提取后，采用增強型脂質(zhì)去除分散式固相萃取管凈化粗提取液.

2.2 色譜質(zhì)譜條件優(yōu)化

2.2.1 色譜條件的優(yōu)化

本試驗研究的黃曲霉毒素化合物為中等極性，因此選擇了適合大部分化合物分離的通用型色譜柱.由于采取電噴霧正離子模式檢測待測組分，在酸性環(huán)境下有利于待測組分的離子化，故采用在流動相中加入甲酸酸化.為了防止出現(xiàn)色譜峰拖尾、不對稱等現(xiàn)象，選擇在流動相的水相中加入適量的乙酸銨.經(jīng)試驗優(yōu)化，最終選擇含0.1%甲酸的乙腈溶液-0.1%甲酸-2 mmol/L乙酸銨的水溶液作為流動相.

2.2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別配制0.5 ng/mL待測物的單標(biāo)溶液，在正離子模式下，依次進(jìn)行一級和二級質(zhì)譜掃描.在一級質(zhì)譜中找到每個化合物的母離子，在子離子掃描中找出響應(yīng)值較大的子離子，選擇穩(wěn)定性好、響應(yīng)值高的子離子為定量離子，同時優(yōu)化出各待測物的最佳碎裂電壓和碰撞能量.由于被分析物種類不多，因此采用MRM采集模式，也能夠保證每個峰的采集點數(shù)，確保被檢測物的靈敏度和選擇性達(dá)到要求.優(yōu)化后的MRM圖如圖1～2所示.

圖1 黃曲霉毒素M1、B1、B2、G1、G2總離子流圖

圖2 黃曲霉毒素M1、B1、B2、G1、G2的MRM

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

取空白基質(zhì)樣品，加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，按“1.2.3”項下樣品溶液制備方法同法處理，制備成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，與同濃度的純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液同時進(jìn)樣分析，計算兩者分析物質(zhì)譜響應(yīng)值比值的百分比(matrix effect, ME).若ME值大于100%，則表示存在基質(zhì)增強效應(yīng).若ME值小于100%，則表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng).若ME值接近100%，則表示基質(zhì)效應(yīng)影響小.結(jié)果顯示，黃曲霉毒素B2的基質(zhì)效應(yīng)不明顯，黃曲霉毒素G1、M1、G2隨著濃度的增加，產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)增強，黃曲霉毒素G2在低濃度下基質(zhì)抑制效應(yīng)明顯(如圖3所示).

圖3 基質(zhì)效應(yīng)

2.4 線性關(guān)系、檢出限及定量限

取混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液適量，使用乙腈稀釋配制一系列的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，外標(biāo)法定量，以黃曲霉毒素的定量離子峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.以大于等于3倍信噪比確定各待測物的檢出限(LOD)，以大于等于10倍信噪比確定各待測物的定量限(LOQ)，結(jié)果如表3所列.由表3可見，5種黃曲霉毒素在0～1.6 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r為0.996 4～0.999 1，檢出限范圍為0.04～0.20 ng/g，定量限范圍為0.58～0.95 ng/g.

表3 5種黃曲霉毒素的線性關(guān)系、檢出限、定量限

2.5 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

在陰性樣品中分別加入質(zhì)量約為1、2、4 ng 三個水平的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，按“1.2.3”進(jìn)行處理，上機測試，每個添加水平平行制備3份試樣，試驗結(jié)果如表4所列.表4結(jié)果顯示，5種黃曲霉毒素的回收率在81.9%～103.2%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviations，RSD)在2.2%～4.5%之間.

表4 5種黃曲霉毒素的回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.6 實際樣品測定

采用本研究建立的方法對市售10批次嬰幼兒奶粉進(jìn)行測定，結(jié)果均未檢出5種黃曲霉毒素，陰性樣品的總離子流圖如圖4所示.

圖4 陰性測試樣品總離子流圖

3 結(jié)論

本文建立了一種基于QuEChERS-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定嬰幼兒奶粉中5種黃曲霉毒素的分析方法.該方法去除基質(zhì)效果良好，操作簡單便捷、靈敏度高、適用性強，通過方法學(xué)驗證，該方法能夠滿足嬰幼兒奶粉中5種黃曲霉毒素的檢測要求，其能夠為嬰幼兒奶粉中黃曲霉毒素的監(jiān)管提供技術(shù)支持.