代安娜 張麗媛 閔廣柳 于潤(rùn)眾

(1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)信息與電氣工程學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

燕麥(AvenasativaL.)是禾本科燕麥屬作物，主要分為帶稃型和裸粒型，具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、飼用價(jià)值和藥用價(jià)值[1-2]。目前有關(guān)燕麥發(fā)酵品質(zhì)、代謝產(chǎn)物，以及功能性成分對(duì)腸道菌群和糖脂代謝的影響等已有相關(guān)研究，肖燕子等[3]利用高效液相色譜法測(cè)定呼倫貝爾不同品種燕麥的發(fā)酵品質(zhì)(丁酸、丙酸、乙酸和乳酸含量)，但未對(duì)糖類、氨基酸等代謝物進(jìn)行檢測(cè)；Boczkowska等[4]利用傅里葉紅外光譜對(duì)波蘭不同產(chǎn)地燕麥樣品的代謝指紋圖譜進(jìn)行了分析，但未對(duì)代謝物的含量及差異代謝物進(jìn)行分析；Loskutov等[5]使用氣液相色譜—質(zhì)譜研究了野生和栽培燕麥的化合物組成和總相對(duì)含量，發(fā)現(xiàn)栽培品種中化合物的含量波動(dòng)幅度比野生品種小(在某些情況下顯著)，但未利用代謝組學(xué)技術(shù)分析差異化合物；王如月等[6]利用燕麥β-葡聚糖和β-葡寡糖發(fā)酵人來(lái)源糞便，利用氣相色譜儀分析發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中乙酸和丙酸含量增加；付媛等[7]研究裸燕麥球蛋白源多肽對(duì)衰老小鼠體內(nèi)的抗氧化作用機(jī)制，利用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)小鼠腦組織進(jìn)行代謝組學(xué)分析；李英浩等[8]研究了干旱脅迫下腐植酸對(duì)燕麥葉片非結(jié)構(gòu)性碳水化合物(NSC)代謝的影響，發(fā)現(xiàn)腐植酸可以通過(guò)調(diào)控燕麥葉片NSC的代謝來(lái)響應(yīng)干旱脅迫。不同的代謝產(chǎn)物對(duì)機(jī)體代謝途徑的影響也不是單一的，與傳統(tǒng)的化學(xué)分離模式相比，代謝組學(xué)技術(shù)可以對(duì)代謝物進(jìn)行定量分析，尤其是發(fā)現(xiàn)種間或種內(nèi)的代謝物相對(duì)含量的差異，以及進(jìn)一步通過(guò)非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)代謝機(jī)制進(jìn)行分析，應(yīng)用在食品的產(chǎn)地溯源，摻假鑒別和安全風(fēng)險(xiǎn)檢測(cè)等方面[9-12]。課題組[13-14]前期也對(duì)不同品種的綠豆代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分離鑒定，以及對(duì)來(lái)自3個(gè)產(chǎn)地同一品種的大豆進(jìn)行了差異代謝產(chǎn)物及差異代謝機(jī)制分析。

研究擬將GC-MS聯(lián)合代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用到兩個(gè)不同產(chǎn)地裸燕麥的代謝產(chǎn)物分析中，對(duì)比分析樣品間的差異代謝產(chǎn)物，并對(duì)差異代謝產(chǎn)物的代謝機(jī)制進(jìn)行探索，以期為選擇符合營(yíng)養(yǎng)或品質(zhì)要求的燕麥品種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

河北張家口裸燕麥(HZ)和黑龍江齊齊哈爾裸燕麥(HQ)：市售；

2-氯-L-苯丙氨酸：上海麥克林生化科技有限公司；

吡啶(≥99.9%)：色譜級(jí)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

N，O-雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)：上海麥克林生化科技有限公司；

甲醇：色譜級(jí)，美國(guó)Fisher技術(shù)公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(三重四級(jí)桿)：TQ8040型，配備EI離子源及AOC-5000型自動(dòng)進(jìn)樣，日本島津技術(shù)有限公司；

色譜柱：Rxi-5Sil型，日本島津技術(shù)有限公司；

離心機(jī)：CR3i multifunction型，美國(guó)Fisher技術(shù)公司；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DGG-9140A型，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

氮吹儀：MTN-2800D型，天津奧特塞恩斯儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本前處理 樣品經(jīng)粉碎研磨均勻后，過(guò)100目篩，按四分法進(jìn)一步取樣，分別稱取50 mg粉末于2 mL的EP管中，加入800 μL甲醇和10 μL內(nèi)標(biāo)(2-氯苯丙氨酸)，快速混勻1 min后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取200 μL上清液，轉(zhuǎn)入進(jìn)樣小瓶中用氮吹儀吹干，備用[13]。

1.2.2 衍生化處理 取30 μL甲氧銨鹽酸吡啶溶液加入到濃縮后的樣品中(即吹干后的小瓶)，快速混勻至完全溶解，37 ℃恒溫箱放置1.5 h后取出，加入30 μL三氟乙酰胺(BSTFA)，70 ℃烘箱中放置1 h。

1.2.3 GC-MS分析

(1)GC參數(shù)：柱溫80 ℃，進(jìn)樣口溫度240 ℃，分流進(jìn)樣，恒定線速度控制流量，載氣為氦氣，柱流量1.20 mL/min，線速度40.4 cm/s，分流率15，程序升溫：0～2 min，80 ℃；10 ℃/min 升到320 ℃，保持6 min，運(yùn)行32 min。

(2)MS參數(shù)：離子源溫度230 ℃，接口溫度300 ℃，溶劑切割時(shí)間2 min，采集模式Q3 Scan，掃描范圍為45～550 (m/z)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件對(duì)GC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并將獲得的燕麥代謝物數(shù)據(jù)與NIST 14數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較以獲得結(jié)構(gòu)信息并分類，研究燕麥樣品的差異代謝產(chǎn)物。

2 結(jié)果與討論

2.1 代謝產(chǎn)物的分離與鑒定

由圖1和圖2可知，樣品中各組分分離良好，基線穩(wěn)定。兩個(gè)不同地區(qū)裸燕麥的總離子流圖大致相似，但是在25.0～27.0 min時(shí)間段存在不同。

1.氨基戊酸 2.異丁酸 3.L-纈氨酸 4.DL-乳酸 5.L-丙氨酸 6.甘氨酸 7.甘油 8.異亮氨酸 9.L-脯氨酸 10.琥珀酸 11.富馬酸 12.L-絲氨酸 13.L-蘇氨酸 14.蘋果酸 15.L-蘇糖醇 16.3-氨基-2-哌啶酮 17.L-天冬氨酸 18.順-4-氨基環(huán)己烷羧酸 19.左旋-谷氨酸 20.木糖醇 21.磷酸 22.丙酸 23.左旋-谷酰胺 24.β-D-呋喃果糖 25.肉豆蔻酸 26.D-葡萄糖 27.肌醇 28.D-葡萄糖酸 29.棕櫚酸 30.亞油酸 31.油酸 32.反油酸 33.硬脂酸 34.花生酸 35.蔗糖 36.甘露二糖 37.纖維二糖 38.2-亞油酰甘油圖1 HZ裸燕麥總離子圖譜Figure 1 Total ion atlas of HZ naked oats

1.氨基戊酸 2.L-纈氨酸 3.DL-乳酸 4.L-丙氨酸 5.甘油 6.L-脯氨酸 7.琥珀酸 8.富馬酸 9.L-絲氨酸 10.L-蘇氨酸 11.蘋果酸 12.L-蘇糖醇 13.3-氨基-2-哌啶酮 14.L-天冬氨酸 15.順-4-氨基環(huán)己烷羧酸 16.左旋-谷氨酸 17.羊毛硫氨酸 18.木糖醇 19.十八烯酸單甘油酯 20.磷酸 21.丙酸 22.左旋-谷酰胺 23.萘普生 24.β-D-呋喃果糖 25.D-呋喃果糖 26.D-松醇 27.半乳糖酸 28.吡喃半乳糖 29.L-塔羅糖 30.D-葡萄糖醇 31.β-D-呋喃半乳糖 32.棕櫚酸 33.亞油酸 34.反油酸 35.油酸 36.硬脂酸 37.9-十六碳烯酸 38.D-葡萄糖醛酸 39.17-十八炔酸 40.13烯烏蘇酸 41.蔗糖 42.1-單棕櫚酸甘油 43.單硬脂酸甘油酯 44.β-乳糖 45.谷甾醇圖2 HQ裸燕麥總離子圖譜Figure 2 Total ion atlas of HQ naked oats

通過(guò)與NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)進(jìn)行對(duì)比分析，兩個(gè)產(chǎn)地裸燕麥共檢測(cè)出了56種代謝產(chǎn)物(HZ有38種，HQ有45種)，分為有機(jī)酸、脂肪酸、糖及其衍生物、氨基酸和中間產(chǎn)物。有機(jī)酸包括D-葡萄糖酸、蘋果酸、氨基戊酸、異丁酸、丙酸、富馬酸、琥珀酸、DL-乳酸；脂肪酸有棕櫚酸、油酸、反油酸、亞油酸、硬脂酸、9-十六碳烯酸、17-十八炔酸、13-烯烏蘇酸、花生酸、肉豆蔻酸；糖及其衍生物有木糖醇、β-D-呋喃果糖、D-呋喃果糖、D-葡萄糖、吡喃半乳糖、L-塔羅糖、D-葡萄糖醇、β-D-呋喃半乳糖、蔗糖、甘露二糖、纖維二糖、β-乳糖、L-蘇糖醇、谷甾醇；氨基酸有L-纈氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-異亮氨酸、L-丙氨酸、L-蘇氨酸、左旋-谷氨酸、L-天冬氨酸；中間產(chǎn)物包括磷酸、甘油、3-氨基-2-哌啶酮、順-4-氨基環(huán)己烷羧酸、羊毛硫氨酸、十八烯酸單甘油酯、左旋-谷酰胺、萘普生、D-松醇、肌醇、1-單棕櫚酸甘油、D-葡萄糖醛酸、單硬脂酸甘油酯、半乳糖酸和2-亞油酰甘油。

2.2 相同代謝產(chǎn)物分析

由表1可知，兩個(gè)地區(qū)的裸燕麥共有27個(gè)相同代謝產(chǎn)物，其中相對(duì)含量最高的是亞油酸，均在10%以上，其次是油酸(HZ 7.21%，HQ 0.49%)、反油酸(HZ 0.29%，HQ 7.11%)、氨基戊酸(HZ 5.91%，HQ 4.64%)、丙酸(HZ 4.97%，HQ 5.27%)、棕櫚酸(HZ 4.97%，HQ 4.54%)、甘油(HZ 7.45%，HQ 3.63%)、蔗糖(HZ 2.63%，HQ 18.62%)、硬脂酸(HZ 1.32%，HQ 0.99%)，而其他相同化合物的相對(duì)含量均在1%以下。

表1 兩樣品相同代謝產(chǎn)物的相對(duì)含量Table 1 The same metabolites relative content

燕麥本身具有耐寒性，所以脂肪酸的含量會(huì)偏高，種類也相對(duì)較多。而其他相對(duì)含量較低的代謝產(chǎn)物均為中間代謝產(chǎn)物，主要為氨基酸和有機(jī)酸，說(shuō)明燕麥中三羧酸循環(huán)較強(qiáng)，三羧酸循環(huán)又與糖類代謝、脂肪酸代謝、能量代謝相關(guān)，所以其相關(guān)代謝途徑也會(huì)加強(qiáng)，從而產(chǎn)生對(duì)人體有益的作用[15-17]。人體中氨基酸的代謝主要包括兩個(gè)方面：① 用于合成機(jī)體自身所特有的蛋白質(zhì)、多肽及其他含氮物質(zhì)；② 通過(guò)脫氨作用、轉(zhuǎn)氨作用、聯(lián)合脫氨或脫羧作用，分解成了α-酮酸、胺類及二氧化碳。由氨基酸分解生成的α-酮酸被轉(zhuǎn)化為糖和脂類，或者再合成某些非必需氨基酸，也可以通過(guò)三羧酸循環(huán)被氧化成二氧化碳和水，以釋放能量。有機(jī)酸參與合成酚類、氨基酸、酯類和芳香物質(zhì)，以及光合作用和呼吸作用[18]。而HZ和HQ代謝產(chǎn)物含量不同可能是因?yàn)榄h(huán)境、產(chǎn)地及自身性質(zhì)，亞油酸在HZ和HQ中含量均較高，可能是因?yàn)樽陨聿伙柡椭舅岷扛撸⑶移渲饕舅峋褪莵営退?，所以含量高；而反油酸、蔗糖、甘油在HQ中含量高，在HZ中含量卻很少，可能是因?yàn)檠帑準(zhǔn)窍怖錄鲎魑?，齊齊哈爾晝夜溫差大，雨量大，輻射充足，雨熱同季，四季特點(diǎn)十分明顯，另外齊齊哈爾土壤資源豐富，土地肥沃，而河北雨季、干季相當(dāng)分明，并且正值雨季時(shí)，太陽(yáng)輻射量會(huì)相應(yīng)減少，所以在HQ中儲(chǔ)能含量高。

2.3 差異代謝產(chǎn)物及代謝機(jī)制分析

2.3.1 HZ樣品 HZ有11種差異代謝產(chǎn)物，包括2種有機(jī)酸，2種氨基酸，2種脂肪酸，3種糖類及2種中間產(chǎn)物，其相對(duì)含量如表2所示，2-亞油酰甘油(6.960%)相對(duì)含量最高，另外D-葡萄糖酸(1.160%)也有較高的相對(duì)含量，而其他物質(zhì)均在1%以下。其中葡萄糖、甘露二糖、纖維二糖、肌醇和D-葡萄糖酸參與糖代謝，甘氨酸和L-異亮氨酸參與氨基酸代謝，肉豆蔻酸和花生酸參與脂肪酸代謝。異丁酸代謝途徑未知，可能為中間代謝產(chǎn)物，可能是氨基酸代謝途徑的中間產(chǎn)物，同時(shí)氨基酸代謝途徑占比最大。酸為單不飽和脂肪酸，其結(jié)構(gòu)不夠緊密，熔點(diǎn)低，推測(cè)2-亞油酰甘油是油酸的代謝中間產(chǎn)物。河北雨季、干季分明，生長(zhǎng)季節(jié)氣候爽涼，故肉豆蔻酸、花生酸等儲(chǔ)能代謝產(chǎn)物較多，另外河北屬半干旱地區(qū)，年降水量為330～400 mm，水資源不足，所以進(jìn)行光合作用次數(shù)較多，轉(zhuǎn)化成的糖類也較多，故糖類及其衍生物較多，張家口土壤種類豐富，富含有機(jī)質(zhì)和礦物質(zhì)，故有機(jī)酸和氨基酸含量高，D-葡萄糖酸和異丁酸為一種有機(jī)酸，可促進(jìn)三羧酸循環(huán)，加強(qiáng)代謝途徑，甘氨酸和L-異亮氨酸可合成蛋白質(zhì)。D-葡萄糖酸通過(guò)葡萄糖和UTP反應(yīng)形成尿苷二磷酸葡糖(UDPG)，然后被氧化成UDP-葡糖醛酸，甘氨酸由乙醛酸與谷氨酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨反應(yīng)生成，L-異亮氨酸是由L-天冬氨酸在天冬氨酸激酶作用下合成L-蘇氨酸，L-蘇氨酸在L-蘇氨酸脫水酶作用下發(fā)生脫水反應(yīng)，并進(jìn)一步產(chǎn)生L-異亮氨酸，同時(shí)L-蘇氨酸的含量受L-異亮氨酸反饋抑制[19]。

表2 HZ差異代謝產(chǎn)物相對(duì)含量Table 2 Relative content of HZ differential metabolites

2.3.2 HQ樣品 HQ有18種差異代謝產(chǎn)物，包括3種脂肪酸，7種糖類及8種中間產(chǎn)物，其相對(duì)含量如表3所示，谷甾醇含量最高(1.420%)，其次是D-呋喃果糖和1-單棕櫚酸甘油(0.700%)，其他物質(zhì)含量均在0.6%以下。D-呋喃果糖、吡喃半乳糖、L-塔羅糖、β-D-呋喃半乳糖、β-乳糖、D-葡萄糖醇和谷甾醇參與糖代謝，十八烯酸單甘油酯、9-十六碳烯酸、17-十八炔酸、13-烯烏蘇酸、1-單棕櫚酸甘油和單硬脂酸甘油酯參與脂肪酸代謝。D-松醇參與膽固醇酯代謝循環(huán)，由乙酰輔酶A經(jīng)一系列合成轉(zhuǎn)變而成，半乳糖酸參與丙酮酸代謝途徑，D-葡萄糖醛酸參與葡糖醛酸途徑，同時(shí)脂肪酸代謝途徑占比更大。脂肪酸可為燕麥提供能量，對(duì)植物本身的抗逆性起重要的作用，使其可適應(yīng)寒冷的生長(zhǎng)環(huán)境，也可在燕麥的生長(zhǎng)過(guò)程中增強(qiáng)其抗旱屬性。齊齊哈爾溫度較低，晝夜溫差大，雨熱同季，輻射充足，因此燕麥代謝產(chǎn)物中糖類種類較多，經(jīng)過(guò)光合作用或其他糖之間的相互轉(zhuǎn)化及衍生形成，另外其中間產(chǎn)物可加強(qiáng)代謝，使代謝產(chǎn)物增多。

表3 HQ差異代謝產(chǎn)物相對(duì)含量Table 3 Relative content of HQ differential metabolites

HQ中檢測(cè)出了羊毛硫氨酸與萘普生。羊毛硫氨酸是含硫氨基酸的一種，其結(jié)構(gòu)和胱氨酸相似，它的存在也高度依賴于胱氨酸的含量。胱氨酸斷開弱二硫鍵產(chǎn)生脫氫丙氨酸，后者同胱氨酸結(jié)合生成羊毛硫氨酸，脫氫丙氨酸可由絲氨酸生成，該燕麥中存在絲氨酸，故在HQ中檢測(cè)出了羊毛硫氨酸。萘普生(Naproxen，NPX)化學(xué)名稱為α-甲基-6-甲氧基-2-萘乙酸，是一種非甾體類抗炎藥物，研究[20-22]表明地表水、地下水及飲用水中均已檢測(cè)到萘普生，這對(duì)生態(tài)環(huán)境的安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。而HQ中檢測(cè)出萘普生，可能是因?yàn)檠帑溤谏L(zhǎng)過(guò)程中受到污染水的灌溉進(jìn)而檢測(cè)出萘普生。

HZ和HQ分別有5種和7種差異代謝物參與糖代謝，而HZ有2種差異代謝物參與氨基酸代謝途徑，HQ有1種差異代謝物參與氨基酸代謝。HZ有3種差異代謝物參與脂肪酸代謝，HQ有6種參與該途徑，此外HQ有1種差異代謝物參與膽固醇酯代謝、1種參與丙酮酸代謝、1種參與葡糖醛酸代謝。由此可以得出HQ的代謝分支途徑要較HZ的多。燕麥代謝產(chǎn)物的不同也可能是因?yàn)橥饨绛h(huán)境的影響因素，如對(duì)環(huán)境影響的感受性、耐受性以及對(duì)環(huán)境的應(yīng)激性代謝等。兩種不同來(lái)源的燕麥中的代謝產(chǎn)物有所不同，說(shuō)明產(chǎn)地對(duì)燕麥代謝產(chǎn)物具有顯著影響，因此差異代謝產(chǎn)物可以用作產(chǎn)地間區(qū)分的依據(jù)。

3 結(jié)論

采用衍生的GC-MS技術(shù)對(duì)不同地區(qū)(河北張家口、黑龍江齊齊哈爾)裸燕麥中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分析。試驗(yàn)結(jié)果表明，在兩個(gè)產(chǎn)地同一品種的裸燕麥中共檢測(cè)出56種代謝產(chǎn)物，河北張家口裸燕麥的代謝產(chǎn)物占38種，其中有11種差異代謝產(chǎn)物，黑龍江齊齊哈爾裸燕麥的代謝產(chǎn)物占45種，其中有18種差異代謝產(chǎn)物。不同產(chǎn)地對(duì)燕麥代謝產(chǎn)物具有顯著影響，可以利用差異代謝產(chǎn)物用作產(chǎn)地間區(qū)分的依據(jù)。試驗(yàn)只分析鑒定了來(lái)自兩個(gè)產(chǎn)地同一品種燕麥的代謝產(chǎn)物和差異代謝產(chǎn)物及代謝機(jī)制，后續(xù)可以進(jìn)一步利用代謝組學(xué)技術(shù)，對(duì)同一產(chǎn)地不同品種的燕麥，或多個(gè)產(chǎn)地不同品種的燕麥或其他未進(jìn)行試驗(yàn)的糧食作物等進(jìn)行代謝組學(xué)分析。