郭玉媛 金鐵巖 張智勇

(延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133002)

病理狀態(tài)下，當細胞沒有足夠能力清除活性氧或平衡其存在時就會引起氧化應激。機體在氧化應激狀態(tài)下會產(chǎn)生并積累大量的自由基，過量的自由基會對細胞膜脂質(zhì)、細胞蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子產(chǎn)生破壞作用，最終導致機體的氧化損傷并促進各類慢性疾病的病理學發(fā)生[1-2]。同時，由食品中存在或與食品相關(guān)的有害微生物的失衡而引起的食品腐敗變質(zhì)和安全問題也一直備受關(guān)注[3-4]。在食品工業(yè)中通常會選擇加入抗氧化劑及防腐劑(抗菌劑)以達到保證食品品質(zhì)的目的。但是化學合成的抗氧化劑及防腐劑的加入對機體始終存在安全隱患，因此，從天然原料中制備出安全、高效的天然抗氧化劑以及抗菌劑成為食品及相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點[5-7]。

青楷槭(AcertegmentosumMaxim，AT)是槭樹科槭屬落葉喬木，原產(chǎn)于中國東北、韓國以及俄羅斯等[8-9]。青楷槭在韓國民間傳統(tǒng)醫(yī)學上常被用于治療眼病和肝臟類疾?。辉谥袊Ｓ闷錁淦づ菟?，具有護肝、醒酒以及消炎化毒等功效[10]。研究發(fā)現(xiàn)，青楷槭樹皮中含有豐富的多酚以及黃酮類物質(zhì)[11-12]，具有清除自由基[13]、抗炎[14-15]和降解酒精[16]等活性。此外，韓國食品藥品安全部(MFDS)已經(jīng)批準青楷槭提取物可作為無急性毒性的食品原料[17]。但目前有關(guān)青楷槭的研究大多局限于樹種的培育以及生態(tài)環(huán)境方面，關(guān)于其提取物抗氧化性的報道較少，而有關(guān)其抗菌性(食源性菌)的研究尚未見報道。

研究擬以青楷槭樹皮為原料，制備70%乙醇提取物(ATEE)和100 ℃熱水提取物(ATWE)，測定青楷槭樹皮的營養(yǎng)成分和兩種提取物的活性成分(總酚、總黃酮、紅景天苷和酪醇)含量，并評估其體外抗氧化活性和抗菌活性，以期為拓寬青楷槭功能性食品領(lǐng)域及其進一步的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

青楷槭(AT)：吉林省琿春市密江鎮(zhèn)；

變形鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌：延邊大學藥學院微生物實驗室；

沒食子酸、蘆丁、紅景天苷、酪醇、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)標準品：色譜純，上海源葉生物科技有限公司；

2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)標準品：超純，上海源葉生物科技有限公司；

丁基羥基茴香醚(BHA)：BR級，上海源葉生物科技有限公司；

抗壞血酸(VC)：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

甲醇、乙腈：色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

分析天平：FA1104型，上海精密科學儀器有限公司；

電熱鼓風干燥箱：101型，泰斯特儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：N-1001型，上海愛朗儀器有限公司；

液相色譜儀：Primaide型，日本日立高科技公司；

紫外分光光度計：U-3900型，日本日立高科技公司；

離心機：TDZ5-WS型，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；

酶標儀：SH-1000型，廣州濟恒生物科技有限公司；

超聲波清洗器：SB-5200DT型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

恒溫培養(yǎng)箱：BPX-272型，上海博迅實驗儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 預處理 取青楷槭樹皮，自然晾干，粉碎，過80目篩，收集備用。

1.2.2 提取物制備 稱取適量的青楷槭樹皮粉末，以料液比1∶10 (g/mL)加入體積分數(shù)為70%的乙醇溶液，室溫下浸提24 h，過濾，重復3次，收集提取液。另取適量的青楷槭樹皮粉末，以料液比1∶10 (g/mL)，100 ℃下煮沸1 h，冷卻至室溫后過濾，重復3次，收集提取液。將提取液進行旋轉(zhuǎn)濃縮，冷凍干燥，得到ATEE和ATWE。-20 ℃貯藏以備使用。

1.2.3 青楷槭樹皮的基本成分測定

(1)水分含量：參照GB 5009.3—2016。

(2)粗灰分含量：參照GB 5009.4—2016。

(3)粗蛋白質(zhì)含量：參照GB 5009.5—2016。

(4)粗脂肪含量：參照GB 5009.6—2016。

(5)總膳食纖維含量：參照GB 5009.88—2014。

(6)碳水化合物含量：扣除水分、粗灰分、粗蛋白和粗脂肪后的含量。

1.2.4 青楷槭樹皮的礦物質(zhì)含量測定

(1)鉀、鈉含量：參照GB 5009.91—2017。

(2)鈣含量：參照GB 5009.92—2016。

(3)鎂含量：參照GB 5009.241—2017。

(4)鐵、銅、鋁等微量元素含量：參照GB 5009.268—2016。

1.2.5 提取物總酚含量測定 根據(jù)文獻[18]。

1.2.6 提取物總黃酮含量測定 根據(jù)文獻[19]修改如下：將制備的ATEE與ATWE配置成適當濃度的溶液，吸取4 mL至試管，分別加入0.5 mL 5%亞硝酸鈉溶液和10%硝酸鋁溶液，充分混合后靜置5 min。加入4 mL 4%氫氧化鈉溶液，定容至10 mL，充分混勻靜置5 min，測定510 nm處吸光度，用蒸餾水代替樣品作對照。

1.2.7 提取物紅景天苷和酪醇含量測定 采用HPLC法。選用安捷倫C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，流動相為乙腈—水(V乙腈∶V水為2∶8)，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長275 nm，進樣量10 μL。

1.2.8 DPPH自由基清除能力 根據(jù)文獻[20]，按式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

D——自由基清除率，%；

A1——試驗組的吸光值；

A2——樣品對照組的吸光值；

A0——空白對照組的吸光值。

1.2.9 ABTS陽離子自由基清除能力 根據(jù)文獻[21]修改如下：分別吸取1 mL不同濃度(2.5～1 000.0 μg/mL)的ATEE和ATWE溶液，加入4 mL ABTS工作液，充分混合后靜置6 min，測定734 nm處吸光度。使用1 mL無水乙醇代替樣品作為空白組。按式(2)計算ABTS陽離子自由基清除率。

(2)

式中：

A——ABTS陽離子自由基清除率，%；

A0——空白組吸光值；

A1——試驗組吸光值。

1.2.10 羥自由基清除能力 根據(jù)文獻[18]。按式(1)計算羥自由基清除率。

1.2.11 鐵還原能力測定 根據(jù)文獻[22]。

1.2.12 抗菌性測定 根據(jù)文獻[23]修改如下：將ATEE使用蒸餾水溶解，分別使用石油醚、乙酸乙酯對ATEE萃取3次，剩余的作為水相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到ATEE的石油醚相、乙酸乙酯相以及水相浸膏。將3種浸膏、ATEE和ATWE使用相應體積的DMSO溶解，在無菌96孔板中加入100 μL細菌培養(yǎng)液，初始加入4 μL樣品溶液，采用雙倍連續(xù)稀釋法，并建立空白對照組。使用酶標儀于650 nm 處測定加菌后的96孔板吸光度。將96孔板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育20 h，測定吸光度。使用氯霉素作陽性對照。按式(3)計算抑菌率，抑菌率達到90%[24]的濃度確定為MIC(μg/mL)。

(3)

式中：

Y——抑菌率，%；

A1——試驗組培養(yǎng)前的吸光值；

A0——空白組培養(yǎng)前的吸光值。

1.2.13 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗重復3次，使用SPSS 17.0、Excel 2010進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，結(jié)果以平均數(shù)±標準差表示。多組間數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析(Duncan檢驗)，P<0.05表示差異顯著。使用Origin軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 青楷槭樹皮基本成分含量

由表1可知，青楷槭樹皮中水分、粗脂肪、粗灰分、粗蛋白及碳水化合物含量分別為7.12%，4.67%，5.83%，3.96%，78.42%，碳水化合物含量較豐富，其中總膳食纖維含量為66.08%。與青楷槭葉基本成分相比，除粗蛋白含量相對較低外，青楷槭樹皮水分、粗脂肪、粗灰分、碳水化合物以及膳食纖維含量均高于青楷槭葉中的[25]。

表1 青楷槭樹皮基本成分含量Table 1 Content of proximate compositions in bark of AT %

2.2 青楷槭樹皮礦物質(zhì)含量

由表2可知，青楷槭樹皮中4種常量元素含量為Ca>K>Mg>Na，其中Ca、K、Mg含量較高，分別為13 028.15，3 600.68，937.59 mg/kg。6種微量元素含量順序為Mn>Fe>Zn>Al>Cu>Cr，其中Mn與Fe含量豐富，分別為943.49，601.88 mg/kg。與青楷槭葉[25]中的礦物質(zhì)含量相比，盡管二者各元素含量存在差異，但含量變化趨勢基本一致。綜上，青楷槭可作為Ca、K、Mg、Fe等礦物質(zhì)的良好補充來源。

表2 青楷槭樹皮礦物質(zhì)含量Table 2 Content of minerals in bark of AT mg/kg

2.3 提取物酚類物質(zhì)含量

由表3可知，ATEE的總酚、總黃酮含量分別為315.66，79.26 mg/g，ATWE的總酚、總黃酮含量分別為188.34，34.89 mg/g。ATEE和ATWE的總酚含量均高于總黃酮。ATEE的總酚、總黃酮含量均高于ATWE的，與Lee等[13]的結(jié)果一致，但與Choi等[16]的結(jié)果相反，且差異顯著(P<0.05)，說明不同的產(chǎn)地、處理方式以及提取方法等會影響提取物中酚類物質(zhì)含量。同時，ATEE中紅景天苷與酪醇含量均高于ATWE的，與Hwang等[26]的結(jié)論一致，證明紅景天苷是青楷槭的主要成分。紅景天苷是名貴藥材紅景天中主要的有效成分，其能在清除自由基、抗衰老、抗肥胖和保肝等方面發(fā)揮重要作用，具有廣闊的市場前景與經(jīng)濟價值[15,26-28]。但是人工培育出高含量紅景天苷的紅景天至今仍存在困難，難以滿足市場需求[29]，因此，青楷槭是否可以作為新的紅景天苷提取來源值得后續(xù)研究。

表3 ATEE與ATWE的酚類化合物含量Table 3 Phenolic compounds contents of ATEE and ATWE

2.4 DPPH自由基清除能力

由圖1可知，試驗濃度范圍(2.5～1 000.0 μg/mL)內(nèi)，維生素C、BHA、ATEE和ATWE的DPPH自由基清除率隨樣品質(zhì)量濃度的增大而增大，當質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL 時，其清除率分別為96.59%，90.14%，95.11%，93.80%，IC50分別為8.34，9.22，6.64，14.33 μg/mL。相同質(zhì)量濃度下，ATEE的DPPH自由基清除率始終高于ATWE，且差異顯著(P<0.05)。低質(zhì)量濃度(2.5～25.0 μg/mL)下，ATEE的DPPH自由基清除率均高于維生素C和BHA的，較高質(zhì)量濃度(50～1 000 μg/mL)下，ATEE的DPPH自由清除率高于BHA的，雖低于維生素C的但相差不大?？傮w上，DPPH自由基清除能力為ATEE>維生素C>BHA>ATWE。

2.5 ABTS陽離子自由基清除能力

由圖2可知，試驗濃度范圍(2.5～1 000.0 μg/mL)內(nèi)，維生素C、BHA、ATEE和ATWE的ABTS陽離子自由基清除率隨樣品質(zhì)量濃度的增大而增大，當質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時，其清除率分別為93.79%，94.01%，94.23%，94.24%。較低質(zhì)量濃度(2.5～50.0 μg/mL)下，兩種樣品之間以及與陽性對照之間存在顯著差異(P<0.05)，其中ATEE的ABTS陽離子自由基清除率始終高于ATWE和維生素C的，但低于BHA的，ATWE在低質(zhì)量濃度(2.5，5.0 μg/mL)下的清除率高于維生素C的。較高質(zhì)量濃度(50～1 000 μg/mL)下，除ATWE的ABTS陽離子自由基清除率在100 μg/mL時較低于ATEE和對照組外，兩種樣品和對照組之間無顯著差異，維生素C、BHA、ATEE和ATWE的IC50分別為19.64，5.74，10.58，23.44 μg/mL?？傮w上，ABTS陽離子自由基清除能力為BHA>ATEE>維生素C>ATWE。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖1 ATEE與ATWE的DPPH自由基清除能力Figure 1 DPPH radical scavenging activity of ATEE and ATWE

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖2 ATEE與ATWE的ABTS陽離子自由基清除能力Figure 2 ABTS radical scavenging activity of ATEE and ATWE

2.6 羥自由基清除能力

由圖3可知，試驗濃度范圍(2.5～1 000.0 μg/mL)內(nèi)，維生素C、ATEE和ATWE的羥自由基清除率隨樣品質(zhì)量濃度的增大而增大，而BHA的羥自由基清除率增加緩慢且清除率均很低，當質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時，其清除率僅為5.99%，說明BHA清除羥自由基的能力較弱。兩種樣品之間，ATEE的羥自由基清除率在相同質(zhì)量濃度下均高于ATWE的，且差異顯著(P<0.05)，較低質(zhì)量濃度(2.5～50.0 μg/mL)下，ATEE表現(xiàn)出更好的清除能力，且高于維生素C和BHA的，但清除率均<10%。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖3 ATEE與ATWE的羥自由基清除能力Figure 3 Hydroxyl radical scavenging activity of ATEE and ATWE

較高質(zhì)量濃度(100～1 000 μg/mL)下，維生素C、ATEE和ATWE的羥自由基清除率增長速率增加，并當質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時，維生素C、ATEE及ATWE對羥自由基的清除率分別為81.64%，55.51%，30.93%。綜合比較，羥自由基清除能力為維生素C>ATEE>ATWE>BHA。

2.7 鐵還原能力

由圖4可知，試驗濃度范圍(2.5～1 000.0 μg/mL)內(nèi)，維生素C、BHA、ATEE和ATWE的鐵還原能力隨樣品質(zhì)量濃度的增大而增大，當樣品質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時，其吸光度值分別為2.109，1.172，1.876，1.427。相同質(zhì)量濃度下，維生素C的鐵還原能力最強，BHA的最弱，ATEE和ATWE的鐵還原能力在低質(zhì)量濃度(2.5～100.0 μg/mL)內(nèi)，除25 μg/mL的外均無顯著差異，在較高質(zhì)量濃度(500，1 000 μg/mL)下，ATEE的鐵還原能力均高于ATWE，且差異顯著(P<0.05)。ATWE與BHA的鐵還原能力在較低質(zhì)量濃度(2.5～25.0 μg/mL)時無顯著差異，但隨著質(zhì)量濃度的增加，在較高質(zhì)量濃度(50～1 000 μg/mL)時，ATWE的鐵還原能力均高于BHA的。綜合比較，鐵還原能力為維生素C>ATEE>ATWE>BHA。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖4 ATEE與ATWE的鐵還原能力Figure 4 Ferric reducing power of ATEE and ATWE

2.8 抗菌性

由表4可知，ATEE、ATWE以及ATEE的石油醚相、乙酸乙酯相和水相對變形鏈球菌均無抗菌活性，但對大腸桿菌均表現(xiàn)出良好的抑菌活性，其MIC值分別為32，32，128，16，16 μg/mL。對于金黃色葡萄球菌，ATEE及其石油醚相、乙酸乙酯相均表現(xiàn)出了抗菌活性，MIC值分別為256，256，128 μg/mL。綜上，青楷槭提取物能夠?qū)Υ竽c桿菌表現(xiàn)出更好的抗菌活性，整體上的抗菌活性為乙酸乙酯相>ATEE>石油醚相>石油醚相>水相>ATWE，其中ATEE及其各級分展示出了比ATWE更好的抗菌活性，乙酸乙酯相相對其他提取物的抗菌活性更好，可能是因為酚類物質(zhì)更集中在乙酸乙酯相中。侯妍[30]在青楷槭乙醇提取物的乙酸乙酯萃取層中分離得到19個化合物，其中幾種成分(酪醇[31]、沒食子酸甲酯[32]、沒食子酸、兒茶素[33]、表兒茶素沒食子酸酯[34]和槲皮素[35]等)具有一定的抑菌能力。

表4 ATEE與ATWE的MIC?Table 4 MIC of ATEE and ATWE μg/mL

3 結(jié)論

測定了青楷槭的營養(yǎng)成分、活性成分，并對其抗氧化和抗菌活性進行評估。結(jié)果表明：70%乙醇提取物和100 ℃ 熱水提取物中含有豐富的酚類物質(zhì)，此外，紅景天苷為青楷槭提取物中的主要成分，含量豐富。70%乙醇提取物(ATEE)和100 ℃熱水提取物(ATWE)均具有良好的自由基清除能力和還原力。其中，70%乙醇提取物表現(xiàn)出更好的抗氧化能力。70%乙醇提取物及其所有級分均表現(xiàn)出了比100 ℃熱水提取物更好的抗菌能力，其中70%乙醇提取物乙酸乙酯相在總體上表現(xiàn)出最優(yōu)的抗菌活性。綜上，青楷槭樹皮提取物具有作為天然抗氧化劑以及天然抗菌劑的良好發(fā)展?jié)摿Α：罄m(xù)可對青楷槭樹皮中活性物質(zhì)進行定性定量分析，并優(yōu)化其提取工藝。