姚月華 唐 寧 應(yīng)熙銳 應(yīng)朝陽 程永強(qiáng)

(1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院植物源功能食品北京市重點實驗室，北京 100083；2. 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；3. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，福建 福州 350000)

紅萍，又名滿江紅(Azolla)，是一種與魚腥藻共生的水生蕨類植物，葉片細(xì)小，漂浮于水面[1]。其繁殖迅速，產(chǎn)量極高，廣泛分布在中國華南及西南地區(qū)的池塘、水田等地，作為一種傳統(tǒng)綠肥，被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖[2]、稻田增產(chǎn)[3]、生態(tài)保護(hù)[4]等領(lǐng)域。此外，紅萍中含有豐富的生物活性物質(zhì)，如多糖、氨基酸、酚類、蒽酮類、微量元素等，其提取物具有抗氧化[5]、抑菌[6]、護(hù)肝[7]等功能。

多糖是由單糖通過糖苷鍵連接而成的生物活性大分子，由同一種單糖組成的為均一多糖，由兩個及以上單糖組成的為雜多糖[8]。Ramzani等[9]從小葉滿江紅中提取的陰離子多糖可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌促炎介質(zhì)和細(xì)胞因子，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。Zhao等[10]從鱗毛蕨中提取出一種水溶性多糖，該多糖能夠清除DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子。此外，蕨類植物來源的多糖還具有理想的流變特性，如黑樹蕨多糖提取物表現(xiàn)出剪切增稠及延伸黏度等特征，被應(yīng)用于增稠劑、藥物載體等加工領(lǐng)域[11]。

目前，有關(guān)紅萍功能成分的研究主要集中在蛋白質(zhì)、微量元素等方面，而有關(guān)紅萍多糖的研究尚未見報道。文章擬以墨西哥滿江紅為原料，通過熱水浸提，醇沉后得到紅萍多糖，對其結(jié)構(gòu)特征、流變特性進(jìn)行研究，同時探究其體外抗氧化活性，以期為紅萍多糖應(yīng)用于功能性食品、生物醫(yī)學(xué)和制藥等行業(yè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

紅萍：墨西哥滿江紅，福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所；

無水乙醇、丙酮、牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250、單糖標(biāo)準(zhǔn)品(葡萄糖、半乳糖醛酸、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖醛酸、核糖、阿拉伯糖、巖藻糖)：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

水溶性維生素E(Trolox)、3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮(PMP)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)：分析純，北京索萊寶生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

真空干燥箱：DZF6020A型，北京科偉永興儀器有限公司；

醫(yī)用離心機(jī)：TGL-185M型，長沙平凡儀器儀表有限公司；

高效液相色譜儀：1260 infinity型，德國Agilent Technologies公司；

凝膠滲透色譜儀：HLC 8420型，日本Hitachi公司；

紅外光譜儀：SPECTRUM 100型，美國PkinElmer公司；

紫外可見分光光度計：T6新世紀(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

掃描電子顯微鏡：SU 8010型，日本 Hitachi 公司；

流變儀：SPECTRUM 100型，美國 PkinElmer 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 紅萍多糖的提取 參照江和棟等[12]的方法并修改：

紅萍干粉→粉碎過40目篩→無水乙醇85 ℃回流除雜→熱水浸提[料液比1∶30 (g/mL)，時間2.5 h，溫度92 ℃]→旋蒸濃縮→醇沉(4倍體積無水乙醇)→4 ℃冰箱靜置24 h→離心取沉淀→丙酮除雜→烘干→紅萍多糖

1.2.2 化學(xué)成分測定

(1)總糖含量：采用硫酸苯酚法[13]。

(2)蛋白質(zhì)含量：采用考馬斯亮藍(lán)法[14]。

(3)糖醛酸含量：采用硫酸—咔唑法[15]。

(4)脂質(zhì)含量：利用脂肪測定儀進(jìn)行測定。

1.2.3 單糖組成 參照王麗波等[16]的方法并修改。稱量15 mg樣品，加入8 mL濃度為2 mol/L的三氟乙酸(TFA)，以氮氣封管，121 ℃水解 6 h。分別取單糖標(biāo)準(zhǔn)液和多糖水解液各100 μL，加入300 μL濃度為0.6 mol/L 的NaOH溶液，混勻，加入等體積 PMP-甲醇溶液，70 ℃水浴2 h。冷卻，加入 0.3 mol/L HCl調(diào)pH至6～7。經(jīng)0.22 μm水系微孔膜過濾，進(jìn)樣。色譜條件：色譜柱為 Agilent Hi-Plex 柱 (300 mm×7.7 mm，8 μm)，示差檢測器(IR)，流動相為超純水，流量0.6 mL/min，溫度70 ℃，進(jìn)樣量25 μL。

1.2.4 分子量測定 參照郭南生等[17]的方法并略修改。配置3.0 mg/mL的樣品溶液，離心，過0.22 μm濾膜，進(jìn)樣后記錄保留時間，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得到樣品的相對分子質(zhì)量。

1.2.5 結(jié)構(gòu)特征

(1)掃描電鏡(SEM)：取少量干燥后的紅萍多糖，真空鍍金，觀察樣品的表面形態(tài)。

(2)原子力顯微鏡(AFM)：配置0.1 μg/mL的紅萍多糖溶液，取少量滴在云母片上，晾干，觀察。

(3)傅里葉紅外光譜(FT-IR)：稱取2 mg紅萍多糖，與200 mg干燥的KBr混合研磨，掃描波長400～4 000 cm-1。

(4)剛果紅試驗：將1 mg/mL樣品溶液與等體積剛果紅溶液(100 μmol/L)混合，緩慢加入1 mol/L氫氧化鈉溶液。利用紫外全波長掃描儀對混合液的最大吸收波長進(jìn)行測定。相同體積的蒸餾水作為空白對照。

1.2.6 流變特性測定 分別配置5，10，15，20，25，30 mg/mL 的紅萍多糖溶液進(jìn)行靜態(tài)剪切測試。測定溫度25 ℃；模具為錐形板(直徑40 mm，間隙0.5 mm)。吸取1.0 mL多糖溶液，記錄1～100 s-1范圍內(nèi)多糖溶液黏度隨剪切速率的變化數(shù)值。吸取20 mg/mL紅萍多糖溶液進(jìn)行動態(tài)振蕩試驗。25 ℃下，記錄1～100 rad/s范圍內(nèi)儲能模量(G′)和損耗模量(G″)的變化。

1.2.7 抗氧化活性測定

(1)DPPH自由基清除力：吸取2 mL不同質(zhì)量濃度的多糖溶液于試管，加入2 mL濃度為2 mmol/L的DPPH甲醇溶液，混勻，避光反應(yīng)30 min。測定517 nm處吸光度，同時測定DPPH甲醇溶液吸光度，利用Trolox作陽性對照。按式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

R1——自由基清除率，%；

A0——空白組吸光度；

Ai——樣品反應(yīng)液吸光度。

(2)ABTS自由基清除力：配置7 mmol/L ABTS原液，取5.0 mL與等體積2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液混合，遮光保存12 h，得ABTS溶液。反應(yīng)前去離子水稀釋，測定732 nm處吸光度值為0.70±0.02。向紅萍溶液中加入2.0 mL ABTS+工作液，渦旋混勻，避光反應(yīng)30 min，測定732 nm處吸光度。以等體積去離子水作為空白對照，Trolox為陽性對照。按式(1)計算ABTS自由基清除率。

(3)羥自由基清除力：將1.0 mL磷酸緩沖溶液與0.2 mL 番紅(520 μg/mL)、1.0 mL乙二胺四乙酸鈉鐵(Ⅱ)溶液混合，加入1.0 mL紅萍多糖溶液，混勻，加入0.8 mL 過氧化氫(6%)溶液，37 ℃水浴30 min，測定515 nm 處吸光度，以等體積去離子水替代樣品為空白組，以等體積去離子水替代樣品和過氧化氫為對照組。按式(2)計算羥自由基清除率。

(2)

式中：

R2——羥自由基清除率，%；

A0——空白組吸光度；

Ai——樣品反應(yīng)液吸光度；

A對照——對照組吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗重復(fù)3次，采用Excel 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅萍多糖化學(xué)組成

試驗表明，采用熱水浸提法所得紅萍多糖提取率為11.12%，高于大多數(shù)水生藻類多糖(1.5%～7.0%)[18]。由表1可知，紅萍粗多糖中總糖含量為67.80%，高于甘草粗多糖(37.10%)[19]，低于果實類粗多糖(88.20%)[20]，可能與植物葉子中含有較多的蛋白質(zhì)、淀粉、木質(zhì)素等雜質(zhì)有關(guān)；糖醛酸含量為21.14%，表明樣品為酸性糖。此外，紅萍粗多糖中灰分含量為20.15%(K 10.40%,Ca 0.42%,Mg 0.46%)，蛋白質(zhì)含量為5.65%，脂肪含量為0.82%。

表1 紅萍多糖的化學(xué)組成Table 1 Content of chemical components in polysaccharide from Azolla

2.2 單糖組成

由圖1可知，紅萍多糖為酸性雜多糖，由甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、木糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖、巖藻糖、核糖、鼠李糖10種單糖組成，其相對摩爾質(zhì)量占比分別為28.03%，24.30%，15.36%，13.65%，8.25%，3.16%，3.01%，1.51%，1.50%，1.24%。其中，甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、木糖為紅萍多糖的主要單糖組成，與Ramzani等[9]的結(jié)論存在差異，說明樣品品種及種植地區(qū)可能會對紅萍多糖的理化組成產(chǎn)生影響。

圖1 紅萍多糖與標(biāo)準(zhǔn)樣品的高效液相色譜圖Figure 1 High performance liquid chromatography of Azolla polysaccharide and standard

2.3 分子量大小及分布

由圖2可知，紅萍多糖具有較寬的分子量，表明其分子量分布不均一，且以10.28，15.11 min出現(xiàn)的兩個峰為主，其峰面積占比分別為78.0%，19.3%，重均分子量(Mw)分別為2 338.00，1.60 kDa，數(shù)均分子量(Mn)分別為1 090.00，1.15 kDa，表明紅萍多糖分子量較大。

圖2 紅萍多糖分子量分布圖Figure 2 Molecular weight distribution curves of Azolla polysaccharide and standard

2.4 結(jié)構(gòu)表征

圖3 紅萍多糖紅外光譜圖Figure 3 FT-IR spectra of Azolla polysaccharide

2.4.2 掃描電鏡 由圖4可知，紅萍多糖整體呈不規(guī)則的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)大小不一，不規(guī)則粘連，其表面質(zhì)地均一且較為粗糙，表明多糖鏈連接較為緊密，可能是樣品分子量較大的原因之一。當(dāng)提取方法不同時，多糖會呈不同的表面形貌，分別用熱水提取法和超聲提取法提取麥冬多糖，后者所得多糖的片狀更小，出現(xiàn)顆粒狀[24]。

2.4.3 原子力 由圖5可知，紅萍多糖分子主要以柔性鏈的形式存在，且鏈分布密度較大，表面存在較多的不規(guī)則顆粒，可能與樣品中存在一定的小分子礦物質(zhì)有關(guān)。紅萍多糖表面為尖銳峰狀結(jié)構(gòu)，分布較為緊密，其分子高度為2.1 nm左右，高于單個多糖鏈的平均高度(0.1～1.0 nm)[25]，表明紅萍多糖分子鏈中存在分支結(jié)構(gòu)且互相交織。

2.4.4 三股螺旋結(jié)構(gòu) 由圖6可知，當(dāng)紅萍多糖存在時，隨著氫氧化鈉濃度的增加(0.00～0.15 mol/L)，剛果紅的最大吸收波長(Lmax)發(fā)生移動，當(dāng)NaOH濃度超過1.5 mol/L 時，絡(luò)合物最大吸收波長急劇下降，直至平穩(wěn)，表明紅萍多糖可能具有三股螺旋構(gòu)象，且該構(gòu)象被高濃度NaOH溶液破壞。三螺旋結(jié)構(gòu)的多糖通常比單螺旋和無規(guī)卷曲的多糖具有更強(qiáng)的生物活性[26]。

圖6 紅萍多糖剛果紅反應(yīng)變化曲線Figure 6 Congo red reaction curve of Azolla polysaccharide

2.5 流變學(xué)特性

由圖7可知，紅萍多糖的表觀黏度呈現(xiàn)出對樣品濃度和剪切速率的依賴性。表觀黏度隨樣品濃度的升高而增加，可能是因為高濃度下多糖鏈之間交聯(lián)區(qū)數(shù)量增加、多糖分子中羧基基團(tuán)數(shù)量增加[27]，分子間作用力以及纏結(jié)率增大，增加了流體流動阻力，限制了聚合物鏈的運(yùn)動和拉伸，從而使表觀黏度增大。此外，多糖溶液表觀黏度隨剪切速率的增加而降低，具有典型的剪切稀化行為，表明紅萍多糖溶液為非牛頓流體中的假塑性流體，這一現(xiàn)象可以歸因于剪切這一行為破壞了分子鏈的纏繞，減小了流動阻力[28]。

圖7 紅萍多糖的靜態(tài)剪切變化曲線Figure 7 Static shear curves of Azolla polysaccharide solution with different concentration

由圖8可知，當(dāng)角頻率為0.01～100.00 rad/s 時，隨著頻率的增加，G′和G″均上升，對頻率有顯著依賴性。當(dāng)角頻率較低時，G′G″，此時的樣品溶液主要表現(xiàn)為固體彈性性質(zhì)。綜上，紅萍多糖存在一定的黏彈性，具有成為增稠劑和凝膠的潛在性質(zhì)。

圖8 2%紅萍多糖溶液儲能模量與損耗模量變化曲線Figure 8 Storage (G′)and loss (G″)modulus of 2% Azolla polysaccharide solution

2.6 抗氧化活性

2.6.1 DPPH自由基清除力 由圖9(a)可知，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為0.1～1.0 mg/mL時，紅萍多糖對DPPH 自由基的清除能力與多糖質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，且清除率在1 mg/mL 時達(dá)80.15%。紅萍多糖、Trolox對DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度(IC50值)分別為0.32，0.01 mg/mL。紅萍多糖的DPPH自由基清除能力顯著低于Trolox，但強(qiáng)于鱗毛蕨多糖(IC50值為2.04 mg/mL)[10]、蕨菜多糖(IC50值為0.82 mg/mL)[27]等蕨類多糖。

2.6.2 ABTS自由基清除力 由圖9(b)可知，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為0.2～2.0 mg/mL時，紅萍多糖對ABTS自由基的清除能力呈劑量依賴性提高，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL 時，清除率達(dá)91.28%，接近0.1 mg/mL Trolox的清除率。紅萍多糖、Trolox對ABTS自由基半數(shù)抑制濃度(IC50值)分別為1.0，0.04 mg/mL，紅萍多糖對ABTS自由基的清除力低于Trolox，高于槐葉萍多糖(IC50值為3.25 mg/mL)[28]。

2.6.3 羥自由基清除率 由圖9(c)可知，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為0.2～2.0 mg/mL時，羥自由基清除率隨多糖質(zhì)量濃度的增加而提升，但增長速率逐漸趨于平緩，且清除率在2.0 mg/mL時達(dá)最大值62.18%。與其他水生植物多糖相比，2.0 mg/mL的紅萍多糖對羥自由基的清除率低于同濃度下藍(lán)藻多糖(82.33%)[15]，但高于同濃度下裸藻多糖(50.14%)[29]。

圖9 紅萍多糖的抗氧化活性Figure 9 Antioxidant activity of Azolla polysaccharide

分子量、單糖組成、空間構(gòu)象等因素均會影響多糖的抗氧化活性。王帥等[30]發(fā)現(xiàn)，多糖的抗氧化能力與其相對分子量呈正比，分子質(zhì)量較大的多糖空間結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，易形成較多的分支和空腔，有助于自由基的去除。Yang等[31]研究表明，與中性糖相比，酸性多糖具有更強(qiáng)的氧化清除能力，且糖醛酸含量與抗氧化活性呈正相關(guān)。紅萍多糖為分子量較大的酸性雜多糖，空間結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，可能是其具有良好抗氧化活性的重要原因。此外，葡萄糖醛酸作為良好的供氫體，對增強(qiáng)樣品的抗氧化能力具有關(guān)鍵作用。

3 結(jié)論

紅萍多糖是一種酸性雜多糖，主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、木糖、葡萄糖組成。掃描電子顯微鏡下，紅萍多糖整體呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，分子呈鏈狀分布且較為緊密。紅萍多糖存在糖類特征基團(tuán)，具有吡喃環(huán)與三股螺旋結(jié)構(gòu)。樣品溶液具有典型的剪切稀化行為，為非牛頓流體中的假塑性流體；且紅萍多糖溶液存在弱凝膠特征，后續(xù)可應(yīng)用至食品添加劑方面。紅萍多糖對DPPH自由基、ABTS自由基和羥基自由基的半數(shù)抑制濃度(IC50值)分別為0.32，1.00，0.96 mg/mL，具有較好的抗氧化能力，可作為天然抗氧化劑。