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      阿托伐他汀對慢性子宮內(nèi)膜炎大鼠的治療作用及其機制研究

      2022-04-08 01:49:34王嘉偉趙蘊肖秦蓉燕覃韋麗李艷慧覃愛平
      中國臨床新醫(yī)學 2022年3期
      關鍵詞:阿托低劑量內(nèi)膜

      謝 昕, 王嘉偉, 趙蘊肖, 秦蓉燕, 覃韋麗, 李艷慧, 鄧 榮, 覃愛平

      慢性子宮內(nèi)膜炎(chronic endometritis,CE)是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一種持續(xù)性炎性疾病,多數(shù)患者臨床癥狀輕微,部分患者可表現(xiàn)為盆腔疼痛、異常子宮出血、白帶增多等癥狀,容易被醫(yī)師忽視[1]。近年來,許多研究發(fā)現(xiàn)CE與異常子宮出血、子宮內(nèi)膜增生、宮腔粘連等疾病的發(fā)生、發(fā)展相關[2-4]。目前,CE的主要治療方法是口服抗生素,但由于其病程較長,長時間使用抗生素會增加患者發(fā)生耐藥性的風險,引起病情反復發(fā)作[5]。阿托伐他汀是羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑,是降低血清膽固醇水平和預防心血管疾病的常用藥物之一[6]。近年來有研究證實阿托伐他汀還具有抗炎、抗氧化應激等功能[7]。但關于阿托伐他汀對CE的治療效果的研究尚少見報道,本研究旨在探討阿托伐他汀對CE的治療作用以及其可能機制,為CE治療提供新思路。

      1 材料與方法

      1.1實驗動物和分組 選擇無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠32只,體質(zhì)量180~220 g,均購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心。將其隨機分為假手術(shù)組、模型組、阿托伐他汀低劑量組(10 mg/kg)和阿托伐他汀高劑量組(20 mg/kg),每組8只。本研究獲得廣西醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準(編號:202107002)。

      1.2藥物和試劑 阿托伐他汀鈣片購自輝瑞制藥公司。免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色試劑盒購自北京中衫金橋公司。Trizol購自北京索萊寶公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Monad公司。白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)抗體購自英國Abcam公司?;|(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)抗體購自正能生物公司。

      1.3大鼠CE模型建造方法[8-9]大鼠適應性喂養(yǎng)1周后進行造模。予3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠,作長約1 cm的腹部正中切口,開腹后暴露雙側(cè)子宮,選用4號針頭于子宮分叉處進入宮腔內(nèi),朝卵巢方向緩慢推注0.05 ml苯酚膠漿(液化苯酚5 ml,西黃耆膠1 g,甘油4 ml,加蒸餾水配至20 ml),針頭停留10 s再緩慢拔出,以防止苯酚膠漿滲漏。模型組、阿托伐他汀低劑量組和高劑量組均按上述方法建造CE模型。假手術(shù)組僅行開腹手術(shù)及子宮暴露,不注射苯酚膠漿造模。

      1.4藥物干預 完成造模后所有大鼠正常喂養(yǎng)1周,第8天開始灌胃給藥:阿托伐他汀低劑量組予10 mg/kg阿托伐他汀,阿托伐他汀高劑量組予20 mg/kg阿托伐他汀,模型組和假手術(shù)組予等體積生理鹽水灌胃。大鼠灌胃給藥容積均為1 ml/100 g,1次/d,連續(xù)干預14 d。

      1.5大鼠子宮病理學檢測 連續(xù)給藥14 d后,以過量麻醉法(3%戊巴比妥鈉,90 mg/kg)處死大鼠。取大鼠子宮組織,4%多聚甲醛固定液固定24 h,脫水后包埋于石蠟中。切片厚度為5 μm,經(jīng)HE染色后于顯微鏡下觀察。觀察內(nèi)容包括[9]:(1)子宮內(nèi)膜上皮細胞增生情況;(2)上皮細胞變性、壞死情況;(3)子宮內(nèi)膜炎癥細胞浸潤情況;(4)子宮內(nèi)膜充血、水腫情況。并按照病變發(fā)生的嚴重程度分為正常、輕度、中度和重度,分別以0、1、2、3分進行評分[9]。

      1.6IL-1β和MMP-9 mRNA表達水平的檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)法檢測子宮組織IL-1β和MMP-9 mRNA表達水平。按照Trizol使用說明書提取組織總RNA,應用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行RT-qPCR,操作嚴格按照試劑盒說明書進行。引物由生工生物公司合成,序列見表1。以β-actin為內(nèi)參,根據(jù)2-ΔΔCt法計算目標基因的相對表達量。

      表1 引物序列

      1.7IL-1β和MMP-9蛋白表達水平檢測 采用免疫組化法檢測子宮組織IL-1β和MMP-9蛋白的表達水平。將切片置入60 ℃烤箱中,烤片1 h,脫蠟、水化后浸入檸檬酸鈉緩沖液經(jīng)高壓加熱修復抗原,冷卻后以磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)進行沖洗。滴加3% H2O2孵育15 min,PBS洗片。在距離組織3 mm處,使用免疫組化筆畫圈,滴加正常山羊血清室溫封閉15 min。甩干封閉液,滴加一抗液,將玻片置于濕盒中以防止干片,4 ℃孵育過夜。復溫后用PBS沖洗,滴加生物素標記的二抗液,濕盒室溫孵育15 min后以PBS進行沖洗。滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素,濕盒內(nèi)室溫孵育15 min。PBS洗片,滴加DAB顯色液孵育2 min,自來水沖洗,蘇木精復染,中性樹膠封片后在顯微鏡下觀察。以細胞染色強度、陽性細胞百分比作為半定量評分標準進行結(jié)果判讀[10]。細胞染色強度評分:無明顯著色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。陽性細胞百分比評分:<5%為0分,5%~25%為1分,26%~50%為2分,>50%為3分。將兩項評分相加得出最終評分結(jié)果,0~2分記為陰性;≥3分記為陽性。

      2 結(jié)果

      2.1四組大鼠子宮組織病理改變情況比較 與假手術(shù)組相比,模型組大鼠子宮內(nèi)膜上皮細胞出現(xiàn)增生、變性、壞死改變,且內(nèi)膜有不同程度的水腫和充血病變,并伴有中性粒細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞不同程度的浸潤,提示CE模型制備成功。與模型組比較,阿托伐他汀高劑量組大鼠子宮內(nèi)膜上皮細胞增生、變性壞死、炎細胞浸潤情況得到顯著改善。見圖1,表2。

      ?假手術(shù)組;?模型組;?阿托伐他汀低劑量組;?阿托伐他汀高劑量組

      表2 四組大鼠子宮組織病理改變情況比較(n)

      2.2四組大鼠子宮組織IL-1β和MMP-9 mRNA表達水平比較 與假手術(shù)組相比,模型組大鼠子宮組織IL-1β和MMP-9 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,阿托伐他汀低劑量組和阿托伐他汀高劑量組大鼠子宮組織IL-1β和MMP-9 mRNA表達水平顯著降低(P<0.05),但阿托伐他汀高劑量組與阿托伐他汀低劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

      表3 四組大鼠子宮組織IL-1β和MMP-9 mRNA

      2.3四組大鼠子宮組織IL-1β和MMP-9蛋白陽性表達情況比較 IL-1β和MMP-9主要表達于子宮內(nèi)膜組織中腔上皮及腺上皮細胞的細胞質(zhì)和細胞膜。與假手術(shù)組比較,模型組大鼠子宮組織的IL-1β和MMP-9蛋白的陽性表達率更高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組比較,阿托伐他汀低劑量組、阿托伐他汀高劑量組大鼠子宮組織IL-1β和MMP-9蛋白陽性表達率降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),但阿托伐他汀高劑量組與阿托伐他汀低劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2,表4。

      ?假手術(shù)組;?模型組;?阿托伐他汀低劑量組;?阿托伐他汀高劑量組

      表4 四組大鼠子宮組織IL-1β和MMP-9蛋白陽性表達情況比較[n(%)]

      3 討論

      3.1CE屬于盆腔炎性疾病的一種,易反復發(fā)作,嚴重影響女性生活質(zhì)量。有研究顯示,2.8%~46.0%的不孕患者遭受CE的困擾[11-14]。未經(jīng)治療的CE患者,自然受孕和人工授精的成功率低,甚至可能導致產(chǎn)科并發(fā)癥[15]。目前認為,CE的致病原因主要為微生物感染,內(nèi)膜組織病原體培養(yǎng)可明確CE病原體,治療首選的抗生素為多西環(huán)素,若使用后癥狀未改善時可使用甲硝唑聯(lián)合環(huán)丙沙星治療[16]。有研究報道,25%的CE患者在接受抗生素治療后癥狀并未得到好轉(zhuǎn)[17]。且長期服用抗生素容易產(chǎn)生耐藥性,因此亟需尋找新的CE治療方案。

      3.2他汀類藥物是治療高膽固醇血癥的臨床一線藥物,通過抑制膽固醇合成限速酶減少膽固醇的合成,可顯著降低低密度脂蛋白膽固醇和血清甘油三脂水平[18]。阿托伐他汀是全合成他汀類藥物,具有毒性低、安全性較好的優(yōu)點。Satoh等[19]發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可以通過減少炎癥因子IL-1β和白細胞介素-18(interleukin-18,IL-18)的分泌,在冠狀動脈病變(coronary artery disease,CAD)患者中發(fā)揮抗炎作用。Malekinejad等[20]研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可以降低肺炎模型小鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的表達,并且能夠減輕肺損傷程度和巨噬細胞滲出。Simsek等[21]發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型中,阿托伐他汀可通過其抗炎作用減輕子宮內(nèi)膜異位癥癥狀。而Takebayashi等[22]發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥患者CE的發(fā)生率顯著高于非子宮內(nèi)膜異位癥患者,表明子宮內(nèi)膜異位癥與CE的發(fā)生、發(fā)展具有關聯(lián)性。但關于阿托伐他汀對CE治療的效果研究,國內(nèi)外尚鮮見報道。本研究HE染色結(jié)果顯示,給予高劑量阿托伐他汀治療后,CE大鼠的子宮上皮細胞增生、變性壞死、炎細胞浸潤的病理情況均獲改善,表明阿托伐他汀可有效治療CE。

      3.3有研究顯示,與正常女性比較,IL-1β和MMP-9在CE患者中的表達顯著升高,提示這兩種細胞因子在CE疾病進展中起重要作用[23-26]。IL-1β作為主要的促炎細胞因子,由單核細胞、巨噬細胞等產(chǎn)生,參與調(diào)節(jié)宿主的天然免疫反應[27]。當發(fā)生CE時,IL-1β分泌異常增加,與Ⅰ型白細胞介素1受體結(jié)合后,誘發(fā)一系列炎癥介質(zhì)和相關趨化因子的釋放,可引起子宮內(nèi)膜異常免疫反應、炎癥細胞外滲和遷移[28-29]?;|(zhì)金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinases,MMPs)能影響細胞外基質(zhì)的重塑和細胞遷移,在組織修復、炎癥反應和腫瘤轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要作用,基質(zhì)金屬蛋白酶的組織特異性抑制物(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TIMPs)能特異性地抑制MMPs[30]。在眾多MMPs中,MMP-9被認為是調(diào)節(jié)白細胞和巨噬細胞遷移的主要細胞因子之一,是炎癥反應的重要調(diào)節(jié)劑[31]。研究發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜炎小鼠模型中,干擾素-τ(interferon-tau,IFN-τ)通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor kappa-B,NF-κB)信號通路和MMP-9的表達發(fā)揮抗炎作用[32]。Inagaki等[33]發(fā)現(xiàn),與可育女性相比,反復種植失敗的女性患者MMP-9、IL-1β水平顯著升高,導致子宮內(nèi)膜環(huán)境變化,影響胚胎著床。且Yoshii等[34]在一項回顧性研究中證明,在反復種植失敗女性患者中可以通過降低MMPs表達水平而改善子宮炎癥環(huán)境,從而提高臨床妊娠率。本研究結(jié)果顯示,阿托伐他汀低、高劑量組大鼠子宮組織中IL-1β和MMP-9 mRNA和蛋白表達水平顯著低于CE模型組,表明阿托伐他汀可以降低CE大鼠IL-1β和MMP-9的表達。

      綜上所述,阿托伐他汀對CE大鼠具有治療作用,其機制可能與下調(diào)子宮組織IL-1β和MMP-9表達水平、減輕子宮內(nèi)膜慢性炎癥有關。

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