荷載JQ1/紫杉醇 PLGA納米粒的制備

劉騫，王沐芳，侯哲，王韶鴻，王慎興，王鵬，劉芷萱，趙靜, 郝吉福*

(1.山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)藥學(xué)院，山東 泰安 271016；2.山東省泰山療養(yǎng)院(山東省泰山醫(yī)院)，山東 泰安 271016)

近年來針對腫瘤開展的免疫治療倍受關(guān)注，但腫瘤細(xì)胞表面的程序性死亡配體1(programmed cell death ligand 1, PD-L1)會與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)上程序性死亡受體1(programmed cell death receptor 1，PD-1)相互結(jié)合，耗竭CTL的功能，產(chǎn)生免疫逃逸，降低其對腫瘤的殺傷作用[1-2]。JQ1作為溴結(jié)構(gòu)域蛋白(bromodomain containing protein 4，BRD4)的有效抑制劑，能夠降低PD-L1在腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)，解除腫瘤細(xì)胞對CTL的免疫抑制[3-5]。紫杉醇(paclitaxel，PTX)作為一線抗腫瘤藥物，其療效在肺癌、乳腺癌等臨床治療中得到證實(shí)。因此，本文提出聯(lián)合應(yīng)用兩種藥物，一方面通過PTX殺傷腫瘤細(xì)胞釋放腫瘤抗原激活抗腫瘤免疫反應(yīng)，另一方面利用JQ1降低腫瘤細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)解除免疫抑制，共同發(fā)揮抗腫瘤的免疫治療。然而，由于JQ1和PTX水溶性差，難以制成注射劑而限制了其應(yīng)用。納米制劑在改善難溶性藥物的溶解性，實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)遞藥和提高生物利用度方面發(fā)揮著重要作用[6-7]。本研究擬以高分子聚合物材料聚乳酸(PLA)-羥基乙酸(PGA)共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA)為載體，將PTX和JQ1荷載于PLGA納米粒中，實(shí)現(xiàn)兩種藥物的共同遞送，以期發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用。

1 儀器和材料

1.1 儀器

JY92-Ⅱ探頭式超聲波粉碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；K30超速離心機(jī)(德國Sigma公司)；Mastersizer 3000激光粒度分析儀(英國馬爾文公司)；VP-10A plus高效液色譜儀(日本島津公司)；FDU-1200臺式冷凍干燥機(jī)(日本東京理化株式會社)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.2 藥品和試劑

1.3 動物

雄性SD大鼠，體重(230 g±20 g)，購于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司，合格證號SCXY(魯)20140007。

2 方法和結(jié)果

2.1 荷載PTX/JQ1的PLGA納米粒的制備

采用超聲乳化溶劑蒸發(fā)法制備荷載PTX/JQ1的PLGA納米粒[8-9]。精密稱取10 mg PTX、5 mg JQ1與 200 mg PLGA，將三者溶于4.5 mL乙酸乙酯中，形成有機(jī)相(作為油相); 精密量取含有2.5 mg/mL的PVA水溶液20.0 mL作為水相，將油相與水相混合后，置于探頭式超聲波粉碎儀中，維持功率400 W條件下進(jìn)行超聲3 min，使形成外觀均勻的乳濁液。將該乳濁液置于磁力攪拌器中不斷攪拌，以除去有機(jī)溶劑。隨后將所得到的納米混懸劑進(jìn)行超速離心15 min(12 000 r/min)，棄去含有游離藥物的上清液后將沉淀物用蒸餾水分散，洗滌兩次，同法離心收集沉淀，制備成荷載PTX/JQ1 的PLGA納米粒，經(jīng)冷凍干燥后備用。

2.2 PLGA納米粒的粒徑測定及形貌觀察

取0.5 mL所制備的荷載PTX/JQ1 的PLGA納米?；鞈乙?，采用激光粒度分析儀測定粒度和多分散指數(shù)(polydispersion index, PDI)；另將所制備的PLGA納米粒適度稀釋，滴加在覆蓋有碳膜的銅網(wǎng)上，干燥后以2%磷鎢鉬酸進(jìn)行負(fù)染制樣，采用透射電鏡觀察其外觀形貌。所測定的PLGA納米粒粒徑結(jié)果如圖1(a)所示，其粒徑呈單峰正態(tài)分布，平均粒徑大小為210 nm左右，PDI為0.153(<0.3)，提示分散性良好，粒徑大小較為均勻。由透射電鏡結(jié)果圖1(b)可以看出，所制備的PLGA納米粒外觀呈圓整、規(guī)則的球狀結(jié)構(gòu)，表面無黏連。

圖1 荷載PTX/JQ1 的PLGA納米粒粒徑及透射電鏡圖

2.3 荷載PTX/JQ1的PLGA納米粒的包封率及載藥量測定

所測得的PTX的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=26 956C-5 078(r=0.999 9)，表明PTX在0.5～25.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；JQ1的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=37 982C-13 470(r=0.999 2)，表明 JQ1在1.25～25.00 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。由標(biāo)準(zhǔn)曲線及所測得的峰面積分別計(jì)算PTX和JQ1在凍干粉中的含量，作為PLGA納米粒中被包載的藥物量M包載。另根據(jù)處方中所投藥量M總量及所用PLGA的重量MPLGA，分別按公式(1)計(jì)算包封率(entrapment efficiency，pEE)與載藥量(drug loading，qDL)。

(1)

經(jīng)式(1)計(jì)算，可知PLGA納米粒中PTX的包封率及載藥量分別為(70.77±5.65)%，(6.43±0.51)%，(n=3)；JQ1的包封率及載藥量分別為(57.3±4.31)%，(5.21±0.27)%，(n=3)。

2.4 荷載PTX/JQ1的PLGA納米粒大鼠體內(nèi)藥動學(xué)分析

2.4.1 給藥方法及血樣處理

取體重230 g左右的SD大鼠6只，給藥前一晚撤去飼料，禁食 12 h 以上，保持自由飲水。尾靜脈注射所制備的荷載PTX/JQ1的PLGA納米粒混懸液，給藥劑量為4 mg/kg，分別在給藥后0.08、0.25、0.5、1、2、4、6、8 h于眼內(nèi)眥處取血約0.3 mL，置肝素化離心管中，3 000 r/min離心 10 min，分取血漿。精密吸取血漿100 μL，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，精密加入色譜純乙腈300 μL，渦旋混合3 min，12 000 r/min高速離心10 min，吸取上清液20 μL，采用高效液相色譜(HPLC)法測定PTX和JQ1的含量。

2.4.2 血漿樣品中PTX和JQ1含量測定方法

高效液相色譜條件同2.3項(xiàng)下PTX和JQ1測定方法。分別取實(shí)驗(yàn)大鼠的空白及含藥血漿各 100 μL，按2.4.1項(xiàng)下血漿樣品處理方法進(jìn)行處理后，進(jìn)行方法專屬性考察。結(jié)果表明血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾PTX和JQ1的測定，PTX和JQ1色譜峰的保留時間分別為6.5 min及14.5 min，結(jié)果見圖2。

圖2 血漿樣品中PTX和JQ1的HPLC譜圖

2.4.3 藥時曲線與數(shù)據(jù)處理

將所測血漿樣品的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算不同時間點(diǎn)的血藥濃度，繪制藥時曲線，結(jié)果見圖3。將所測得的藥時數(shù)據(jù)經(jīng)DAS(drug and statistics)藥動學(xué)軟件進(jìn)行隔室模型擬合處理，以擬合度、AIC(Akaike′s information criterion)確定合適的模型。擬合的藥時曲線方程為：

圖3 大鼠尾靜脈注射PLGA納米粒后PTX與JQ1血藥濃度-時間曲線(n=6)

CPTX=7.26e-4.85t+0.87e-0.13t,

(2)

CJQ1=2.04e-4.07t+0.96e-0.29t。

(3)

測得PTX與JQ1主要的藥動學(xué)參數(shù)如下：分布相半衰期(t1/2α)為0.142 8、0.169 9 h，消除相半衰期(t1/2β)為5.27、2.37 h，血藥濃度曲線下面積(AUC)為8.155、3.793(μg·h)/mL，清除率(CL)為122.612、131.795 mL/(h·kg)，表觀分布體積(V)為766.07、396.25 mL/kg。

2.5 對B16黑色素瘤細(xì)胞PD-L1的影響

2.5.1 細(xì)胞接種

取對數(shù)生長期的B16細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，收集細(xì)胞，以體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后以1×104個/孔的數(shù)目接種到無菌24孔板中，每孔添加1 mL含血清培養(yǎng)基，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，至單層細(xì)胞覆蓋率到達(dá)70%～80% 時，進(jìn)行加藥共培養(yǎng)。

2.5.2 給藥方案

實(shí)驗(yàn)分組共分為六組：①為對照組(記為Untreated)；②為0.5 μg/mL 的JQ1混懸液組(記為JQ1-S 0.5)：稱取2.0 mg JQ1溶解在少量(<0.1 %)DMSO中，用培養(yǎng)基稀釋成濃度為0.5 μg/mL，加入培養(yǎng)孔中與細(xì)胞共培養(yǎng)；③為0.25 μg/mL的JQ1混懸液組(記為JQ1-S 0.25)；④為0.5 μg/mL 的PLGA納米粒組(記為JQ1-P 0.5)：取制備的荷載PTX/JQ1的PLGA納米粒凍干粉分散在培養(yǎng)基中，再稀釋至濃度為0.5 μg/mL，加入培養(yǎng)板中與細(xì)胞共培養(yǎng)；⑤為0.25 μg/mL的PLGA納米粒組(記為JQ1-P 0.25)。細(xì)胞添加含藥培養(yǎng)基后共培養(yǎng)72 h，期間間隔36 h換液一次。

2.5.3 細(xì)胞染色與檢測

將培養(yǎng)72 h后的細(xì)胞棄去上層培養(yǎng)基，洗滌、消化、離心收集細(xì)胞。轉(zhuǎn)移至96孔板中，加入封閉液封閉。隨后加入50 μL配制好的表面抗體CD274-PE，混合均勻，4 ℃避光染色15 min，離心、洗滌除去多余抗體染液，最后加入A430進(jìn)行染色。將染色完成的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果采用FlowJo軟件進(jìn)行處理，分析策略及PD-L1的抑制情況見圖4。

B16細(xì)胞表面存在的PD-L1蛋白也被稱為表面抗原分化簇274(CD274)。由圖4(b)可知對照組CD274表達(dá)量最高，表明腫瘤細(xì)胞表面存在著PD-L1的表達(dá)；但經(jīng)JQ1和PLGA納米粒組處理后，均可降低B16黑色素瘤細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)，然而在同等濃度條件下JQ1與PLGA納米粒組對腫瘤細(xì)胞表面PD-L1的影響沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明將JQ1制備成納米粒后，不影響JQ1的活性，仍能抑制PD-L1的表達(dá)。但在不同濃度下對抑制PD-L1表達(dá)情況存在著量效關(guān)系，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。

圖4 荷載PTX/JQ1的PLGA納米粒對PD-L1抑制情況

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用可生物降解高分子材料PLGA，構(gòu)建了共荷載PTX/JQ1的PLGA納米粒遞送系統(tǒng)，利用PTX的化療作用誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡釋放抗原，結(jié)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑JQ1增強(qiáng)抗腫瘤免疫效應(yīng)，以期改善模型藥物PTX/JQ1難溶性及解決兩者合用共遞送的制劑問題。利用載體材料PLGA溶于有機(jī)溶劑不溶于水的特征，與模型藥物共溶于有機(jī)溶劑后，分散到含有乳化劑的水相中，形成乳濁液，通過蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，使藥物與載體材料溶解度降低析出固體，從而形成骨架型PLGA納米粒遞送系統(tǒng)。前期研究表明通過改變處方中載體材料PLGA及乳化劑的濃度，以及超聲功率、超聲時間等制備工藝可以控制納米粒的粒度大小[10-11]。因此，所制備的PLGA納米粒可以作為兩種藥物共遞送的傳輸載體。

由于所制備PLGA納米粒的平均粒徑為210 nm，符合靜脈注射給藥的要求，納米粒進(jìn)入體循環(huán)后，依靠滲透滯留增強(qiáng)的EPR效應(yīng)到達(dá)腫瘤部位，隨后PLGA納米粒降解釋放藥物發(fā)揮治療作用[12]。在藥動學(xué)研究中，利用DAS藥動學(xué)軟件按照不同隔室進(jìn)行模型擬合，發(fā)現(xiàn)二室模型的 AIC 值最小，提示經(jīng)尾靜脈注射荷載PTX/JQ1的PLGA納米粒后，藥物在大鼠體內(nèi)動力學(xué)特征符合二室模型。

在腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展過程中，腫瘤細(xì)胞表面蛋白PD-L1能與T細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合，產(chǎn)生抑制信號，耗竭T細(xì)胞正常功能，進(jìn)而產(chǎn)生免疫逃逸。而B16細(xì)胞用JQ1處理后，可顯著減少細(xì)胞表面免疫抑制蛋白PD-L1的表達(dá)，提示JQ1可以通過降低PD-L1的表達(dá)解除免疫抑制，恢復(fù)機(jī)體抗腫瘤功能正?；?，進(jìn)而與紫杉醇聯(lián)用，通過殺傷腫瘤細(xì)胞釋放腫瘤抗原，激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，共同發(fā)揮對腫瘤的治療作用[13-14]。針對聯(lián)合療法治療腫瘤的特點(diǎn)，今后尚需完成荷載PTX/JQ1的PLGA納米粒動物體內(nèi)抗腫瘤效果及作用機(jī)制的評價(jià)。