顧欣然，代敏麗，王遐坤，仲思銀，李 兵，衛(wèi) 靜，2＊

（1. 蘇州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州 215123；2. 福建農(nóng)林大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，福建 福州 350002）

雙翅目寄蠅（Tachinidae）作為自然界中僅次于膜翅目寄生蜂的第二大類群寄生性昆蟲(chóng)，在害蟲(chóng)種群控制和維持生態(tài)平衡方面具有重要的作用，目前全世界已記載的寄蠅有1477屬8592種[1，2]。寄蠅是農(nóng)林牧業(yè)害蟲(chóng)生物防治的重要天敵資源，被廣泛應(yīng)用于害蟲(chóng)如松毛蟲(chóng)、粘蟲(chóng)等的生物防治[3，4]。同時(shí)，部分寄蠅也是危害經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)家蠶（Bombyx mori）和柞蠶（Antheraea pernyi）的主要害蟲(chóng)[5，6]。

家蠶是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，也是國(guó)際無(wú)脊椎動(dòng)物協(xié)會(huì)確定的鱗翅目模式昆蟲(chóng)[7]。生產(chǎn)上對(duì)家蠶和柞蠶危害最大的是追寄蠅（寄蠅科、追寄蠅屬）和飾腹寄蠅（寄蠅科、飾腹寄蠅屬）[8]。它們屬于完全變態(tài)昆蟲(chóng)，幼蟲(chóng)期包括3個(gè)齡期，雌蠅將尚未完成胚胎發(fā)育的卵產(chǎn)于寄主體表或食料植物上，幼蟲(chóng)在寄主體表或消化道內(nèi)孵化后鉆入寄主體腔內(nèi)，3 齡幼蟲(chóng)末期鉆出寄主化蛹[9]。目前蠶業(yè)生產(chǎn)上防治寄蠅主要利用“滅蠶蠅”對(duì)家蠶進(jìn)行添食或體外噴施，而寄蠅已對(duì)該藥物產(chǎn)生了抗性，防治效果逐漸下降，有研究表明在長(zhǎng)期廣泛使用“滅蠶蠅”的地區(qū)的蠅蛆抗藥性可達(dá)極少使用該藥地區(qū)的3.32 倍[10]。目前關(guān)于追寄蠅的了解多在其生物生態(tài)學(xué)特性與寄生規(guī)律上[5，11，12]，研究多集中在生物防治方面，而對(duì)追寄蠅寄生后家蠶的生長(zhǎng)發(fā)育和二者互作的分子機(jī)制研究較少，這大大制約了蠶業(yè)生產(chǎn)中追寄蠅防控技術(shù)和藥物的開(kāi)發(fā)。

已有研究表明，家蠶追寄蠅偏向于寄生末齡家蠶幼蟲(chóng)，寄生率達(dá)48%，因而其對(duì)大蠶期（末齡期家蠶）危害較大[13]。寄生不僅可激活家蠶的免疫反應(yīng)[14～16]，也會(huì)導(dǎo)致家蠶出現(xiàn)早熟現(xiàn)象，使家蠶繭質(zhì)變劣且死亡率較高[17]，而家蠶追寄蠅寄生的引起家蠶早熟的機(jī)制尚不清楚。我們前期研究發(fā)現(xiàn)一種非專化性雙翅目寄蠅—日本追寄蠅（Exorista japonica）的寄生可引起家蠶上蔟提前，但出現(xiàn)化蛹障礙，這一現(xiàn)象產(chǎn)生的原因主要是寄生導(dǎo)致寄主激素和糖代謝異常所致[18]。家蠶的變態(tài)發(fā)育主要受由蛻皮激素20-羥基蛻皮酮（20-hydroxyecdysone，20E）啟動(dòng)[19]。20E 及其前體蛻皮酮（ecdysone）主要是以食物中的膽固醇或植物固醇類物質(zhì)為原料在昆蟲(chóng)前胸腺及外周組織合成，經(jīng)由“Halloween”基因（Sro、Spo、Phm、Dib、Sad、Shade）編碼的蛋白酶的催化。20E 通過(guò)與其受體EcR/USP 形成復(fù)合體，啟動(dòng)下游轉(zhuǎn)錄因子如E75、Hr3和Ftz-f1等的表達(dá)。其中Ftzf1的精準(zhǔn)表達(dá)時(shí)間是保證昆蟲(chóng)正常蛻皮和變態(tài)所必須的。20E 對(duì)Ftz-f1 存在負(fù)調(diào)控作用，F(xiàn)tz-f1 是在20E消失后進(jìn)行表達(dá)[20]。本試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)了追寄蠅寄生家蠶的齡期經(jīng)過(guò)，并初步探索了寄生對(duì)家蠶20E 合成和信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制，通過(guò)本研究可以更好地了解追寄蠅對(duì)寄主生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控，為后續(xù)深入研究其調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試家蠶和追寄蠅品種

供試家蠶品種為“菁松×皓月”，由東臺(tái)市天潤(rùn)蠶種有限公司提供，飼養(yǎng)溫度25 ℃±1 ℃、相對(duì)濕度75%±5%，12 h 黑暗12 h 光照交替。供試追寄蠅品種為家蠶追寄蠅，由江蘇如皋市蠶桑技術(shù)指導(dǎo)站提供，置于養(yǎng)蟲(chóng)籠（45 cm×30 cm×30 cm）中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度25 ℃±1 ℃、相對(duì)濕度85%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料收集

取5齡1 d的家蠶置于飼有羽化3 d的追寄蠅培養(yǎng)箱中，供追寄蠅產(chǎn)卵，家蠶與追寄蠅的數(shù)量比為1∶30。3 h 后取出，在放大鏡下觀察家蠶體壁，選取出體表僅有1粒卵的家蠶繼續(xù)飼養(yǎng)。同時(shí)取未被追寄蠅寄生的家蠶作為對(duì)照組。對(duì)照組和寄生組均設(shè)置3組重復(fù)，每次重復(fù)各20頭蠶。記錄家蠶從5齡起蠶（day 1 of 5th instar，L5D1）發(fā)育至預(yù)蛹期第2 d（day 2 of prepupa stage，PP2）的時(shí)間。同時(shí)解剖并收集寄生后1 d～6 d（家蠶處于5 齡3 d-吐絲期第1 d）（L5D3-day 1 of spinning stage，L5D3-SP1）及對(duì)照組家蠶的血清、脂肪體和前胸腺，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3個(gè)組織樣品重復(fù)，每個(gè)組織樣品來(lái)源于5 頭家蠶組織的混合。

1.2.2 RNA提取及cDNA的合成

采用液氮研磨家蠶前胸腺和脂肪體，利用TRIzol（Takara）法提取RNA，加入DNase去除基因組DNA 的污染。利用超微量分光光度計(jì)NanoDrop 2000 檢測(cè)RNA 的濃度和純度。取1 μg 的總RNA，采用M-MLV RTase試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第1條鏈（Takara）。

1.2.3 目的基因的轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)

以cDNA 為模板，Rp49 為內(nèi)參基因測(cè)定20E 合成 基 因（BmSro，BmSpo，BmPhm，BmDib，BmSad，BmShd）和下游基因（BmUSP，BmEcRA，BmE75，BmBrc，BmHr3，BmE93）mRNA 的表達(dá)。采用SYBR Premix Ex Taq?（Takara）試劑盒在ABI Viia 7 Realtime PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系為20 μL：cDNA模板1 μL，2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL，50×ROX Ref?erence Dye 0.4 μL，10 mM 上下游引物各0.5 μL，ddH2O 7.8 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃變性1 min；95 ℃5 s，55 ℃10 s，72 ℃10 s，共45 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。采用2?ΔCT的方法分析基因的轉(zhuǎn)錄水平。每個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平為3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值。引物序列見(jiàn)表1。

表1 qPCR引物序列Table 1 qPCR Primer Sequence

1.2.4 20E 滴度的檢測(cè)

根據(jù)20E 酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（三價(jià)公司）說(shuō)明，利用試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，取10 μL血清溶解于試劑盒中的ELISA buffer，樣品最終稀釋度為5 倍。將樣品加于酶標(biāo)板底部并混勻，37 ℃反應(yīng)30 min，洗板后加入酶標(biāo)試劑，37 ℃反應(yīng)30 min，洗板后加入顯色液顯色10 min，加入終止液，15 min內(nèi)讀取OD值并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算20E滴度。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

利用K-S 檢驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分布的一致性，利用T檢驗(yàn)對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，其中*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。利用SPSS 19.0（SPSS，Chicago，IL，USA）對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。利用GraphPad Prism 7繪圖軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠶追寄蠅寄生對(duì)5齡家蠶齡期的影響

追寄蠅在家蠶體表產(chǎn)卵的2.5 d～3 d后，卵下方或者周邊出現(xiàn)寄生黑點(diǎn)，表明孵化的幼蟲(chóng)成功侵入家蠶體內(nèi)（圖1A）。幼蟲(chóng)在蠶體內(nèi)發(fā)育至3齡，成熟的3齡幼蟲(chóng)在家蠶預(yù)蛹后期鉆出。未寄生的對(duì)照組家蠶從5 齡起蠶（L5D1）發(fā)育至預(yù)蛹期第2 d（PP1）歷經(jīng)10.8 d，寄生組為10.1 d（圖1B）。

圖1 追寄蠅寄生家蠶的齡期統(tǒng)計(jì)Fig. 1 The Effect of E. sorbillans Parasitization on the Development of the Host B. mori.

2.2 家蠶追寄蠅寄生對(duì)5齡家蠶血清中20E滴度的影響

利用酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)追寄蠅寄生后1 d、3 d和5 d 的家蠶和未寄生的對(duì)照家蠶血清中的20E 滴度。結(jié)果顯示：在對(duì)照組和寄生組家蠶血清中，20E的滴度均隨著家蠶齡期的增長(zhǎng)而增加。在寄生后第1 d，對(duì)照組和寄生組家蠶體內(nèi)20E滴度無(wú)顯著差異。在寄生后第3 d 和第5 d，寄生組家蠶體內(nèi)的20E 滴度均顯著高于對(duì)照組，分別是對(duì)照組的1.23和1.50倍（圖2）。

圖2 追寄蠅寄生家蠶體內(nèi)20E滴度的檢測(cè)Fig. 2 Detection of 20E Titers in B. mori Parasitized by E. sorbillans

2.3 追寄蠅寄生對(duì)5齡家蠶前胸腺中20E合成酶基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)追寄蠅寄生家蠶的前胸腺中20E 合成酶基因（BmSro，BmSpo，BmPhm，BmDib，BmSad，BmShd）的表達(dá)變化。結(jié)果如圖3 所示，在寄生1 d時(shí)，寄生組家蠶BmSro，BmSpo，BmPhm，BmDib和BmSad的轉(zhuǎn)錄水平顯著低于對(duì)照組，而B(niǎo)mShd的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（圖3A）。家蠶BmSro，BmPhm，BmSad和BmShd的轉(zhuǎn)錄水平在寄生后第3 d 顯著高于對(duì)照組，分別是對(duì)照組的1.41，1.23，2.91 和1.24 倍，而B(niǎo)mSpo和BmDib的轉(zhuǎn)錄與對(duì)照組相比無(wú)顯著變化（圖3B）。在追寄蠅寄生后的第5 d，BmSro，BmSpo，BmPhm和BmSad的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對(duì)照組，BmDib和BmShd的轉(zhuǎn)錄無(wú)顯著變化（圖3C）。因此，追寄蠅可調(diào)控家蠶前胸腺20E合成酶基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控家蠶體內(nèi)20E的合成。

圖3 追寄蠅寄生對(duì)家蠶20E合成酶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分析Fig. 3 Analysis of the Transcriptional Regulation of 20E Biosynthetic Genes in B. mori Parasitized by E.sorbillans.

2.4 追寄蠅寄生對(duì)5齡家蠶脂肪體中20E下游基因轉(zhuǎn)錄的影響

接下來(lái)，我們利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)追寄蠅寄生對(duì)家蠶20E 信號(hào)通路上的重要響應(yīng)基因（BmUSP，BmEcR- A，BmFtz- f1，BmE75，BmBrC，BmHr3，BmE93）表達(dá)水平的影響。結(jié)果如圖4所示，在寄生1 d 和3 d，BmE75，BmHr3，BmBrC，BmE93和BmFtz-f1持續(xù)上調(diào)表達(dá)，是對(duì)照組的1.38～9.36 倍（圖4 A，B）。在寄生后第5 d，BmEcR-A和BmE93的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對(duì)照組；而B(niǎo)mHr3，BmBrC和BmFtz-f1的表達(dá)受到抑制，轉(zhuǎn)錄水平分別是對(duì)照組的0.08，0.10 和0.24 倍（圖4C）。這些結(jié)果表明，追寄蠅寄生調(diào)控寄主家蠶20E下游應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄。

圖4 追寄蠅寄生對(duì)家蠶20E信號(hào)通路基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分析Fig. 4 Analysis of the Transcriptional Regulation of 20E Signaling Pathway Genes in B. mori by the Parasitism of E. sorbillans.

3 討論

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)追寄蠅的寄生行為、寄生規(guī)律和危害狀況調(diào)查有一定成果，但對(duì)其具體寄生機(jī)制的深入研究尚且缺乏。已有研究報(bào)道，追寄蠅寄生3齡～5 齡初期家蠶造成的寄主死亡率接近100%[13]，但追寄蠅對(duì)家蠶影響的調(diào)查尚不全面。本研究中，5齡1 d的家蠶被追寄蠅寄生后，出現(xiàn)提前進(jìn)入預(yù)蛹期的現(xiàn)象，同時(shí)，成熟的追寄蠅3齡幼蟲(chóng)均在家蠶預(yù)蛹期鉆出化蛹。已有研究發(fā)現(xiàn)多種寄生蜂和寄蠅調(diào)控寄主發(fā)育的方式主要有兩種，一種為加快寄主發(fā)育，導(dǎo)致寄主早熟，另一種則導(dǎo)致寄主發(fā)育受阻，使寄主滯留在特定時(shí)期[18，21，22]，表明寄生性昆蟲(chóng)通過(guò)調(diào)節(jié)寄主發(fā)育創(chuàng)造更適合其自身的寄主環(huán)境的現(xiàn)象具有普遍性。

完全變態(tài)昆蟲(chóng)的發(fā)育主要由蛻皮激素20E和保幼激素（juvenile hormone，JH）相互拮抗、協(xié)調(diào)控制，其滴度的改變能夠誘導(dǎo)昆蟲(chóng)進(jìn)入特定的發(fā)育階段，如蛻皮和化蛹[19，23]。前期研究發(fā)現(xiàn)，日本追寄蠅可通過(guò)誘導(dǎo)家蠶體內(nèi)20E 滴度的上升和JH 滴度的下降進(jìn)而加快寄主發(fā)育[18]，而本試驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)家蠶追寄蠅寄生可以通過(guò)誘導(dǎo)家蠶體內(nèi)20E合成以及影響20E 信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控家蠶的齡期經(jīng)過(guò)，推測(cè)家蠶追寄蠅可能也通過(guò)調(diào)控寄主激素代謝進(jìn)而加快其發(fā)育。家蠶體內(nèi)20E滴度在5齡末期之前極低，在5齡末期即徘徊期開(kāi)始急劇上升，在預(yù)蛹期達(dá)到峰值，而在預(yù)蛹后期迅速下降，形成20E脈沖，同時(shí)家蠶完成預(yù)蛹-蛹的轉(zhuǎn)變[24]。而這一過(guò)程的成功完成也需要JH滴度變化來(lái)共同調(diào)控，家蠶在5齡初期時(shí)處于JH 滴度高峰，而在5 齡期末期JH 滴度則快速下降，在5齡末到蛹期的階段，JH 滴度急劇下降到幾乎為0，從而使20E 不受到拮抗而誘導(dǎo)蛹化變態(tài)[24]。因此，家蠶追寄蠅的寄生可能不僅調(diào)控20E 的合成與信號(hào)通路，還對(duì)JH 的合成和信號(hào)傳導(dǎo)有調(diào)控作用，進(jìn)而加快寄主幼蟲(chóng)發(fā)育。

此外，在昆蟲(chóng)中，Hr3 可直接上調(diào)Ftz-f1 的表達(dá)，而E75 可直接結(jié)合Hr3 抑制Ftz-f1 表達(dá)，因此Hr3 可通過(guò)正負(fù)反饋調(diào)控Ftz-f1 表達(dá)控制昆蟲(chóng)的發(fā)育變態(tài)[25]。本研究中發(fā)現(xiàn)，追寄蠅寄生后第5 d，20E 滴度持續(xù)上升，導(dǎo)致Hr3 和Ftz-f1 的轉(zhuǎn)錄均被下調(diào)。20E 的過(guò)量合成可加快寄主的發(fā)育，但同時(shí)會(huì)導(dǎo)致下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，使家蠶無(wú)法完成正常的發(fā)育。