應(yīng)用高分辨質(zhì)譜法的馬鈴薯種植土壤嘧菌酯殘留快速篩查方法

高 磊，王美仙，郭威艷

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)烏蘭察布市農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督管理中心，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 012000；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)烏蘭察布市農(nóng)牧業(yè)綜合執(zhí)法支隊(duì)，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 012000)

0 引言

人口數(shù)量的急速上升，對(duì)于食物的需求量也逐漸增大，市場(chǎng)對(duì)于各類農(nóng)產(chǎn)品的需求逐年上升，在保證農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量提升時(shí)一般需要使用不同成分的農(nóng)藥抑制病蟲危害。目前我國(guó)市面上常使用的農(nóng)藥數(shù)量約有1 600種，年用量超過200萬(wàn)t，是目前世界上農(nóng)藥使用數(shù)量最龐大的國(guó)家，但是大量使用農(nóng)藥很容易使其殘留在農(nóng)作物中，并且大量噴灑農(nóng)藥還會(huì)對(duì)土壤和水源造成嚴(yán)重污染，長(zhǎng)期食用殘留農(nóng)藥的農(nóng)作物也會(huì)嚴(yán)重危害人們的身體健康[1]。嘧菌酯是一種有機(jī)化合物，純品是一種呈現(xiàn)出淺棕色色澤的棕色結(jié)晶固體，沸點(diǎn)高于500 ℃，在水解過程中呈現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài)，是近年來(lái)由國(guó)外引入的新型農(nóng)藥，在眾多農(nóng)作物種植中已經(jīng)廣泛使用，屬于甲氧基丙烯酸酯型殺菌農(nóng)藥，對(duì)農(nóng)作物生產(chǎn)過程中經(jīng)常出現(xiàn)的霜霉病、白粉病都具有良好的控制效果[2-4]。該農(nóng)藥不但能夠噴灑在土壤中還可以直接在種子階段實(shí)現(xiàn)病蟲害處理，對(duì)于根莖類作物、蔬菜、谷物等作物均有良好的處理效果。但是由于嘧菌酯具有特殊性，如果嘧菌酯與有機(jī)類農(nóng)藥混合使用會(huì)由于強(qiáng)烈的粘著性與滲透性導(dǎo)致作物出現(xiàn)藥害情況。嘧菌酯農(nóng)藥具有諸多特點(diǎn)：僅需少量用藥就能消滅多種病蟲危害，能夠有效降低農(nóng)藥使用成本；能夠提升作物的抗病性能，保證作物提前上市，為種植戶帶來(lái)最優(yōu)成本；使用嘧菌酯農(nóng)藥即使在天氣不佳的情況下依舊保證作物生長(zhǎng)；使作物的收獲期拉長(zhǎng)，提升作物整體產(chǎn)量；有效期較長(zhǎng)，每次藥效能夠持續(xù)15 d以上；毒性較低，無(wú)公害性能較強(qiáng)。盡管嘧菌酯已經(jīng)屬于性能較好的農(nóng)藥，但是大量殘留在土壤中仍然會(huì)造成較為嚴(yán)重的環(huán)境污染和作物危害，需要探索嘧菌酯殘留快速篩查方法[5]。

對(duì)于農(nóng)藥中各類物質(zhì)的殘留測(cè)定學(xué)術(shù)界通常使用質(zhì)譜技術(shù)。近年來(lái)，隨著質(zhì)譜技術(shù)的進(jìn)步，高分辨質(zhì)譜技術(shù)逐漸發(fā)展并完善起來(lái)。高分辨質(zhì)譜法能夠獲得通量較高的非靶向定量分析與定性篩查，不會(huì)受到被篩查樣品種類與數(shù)量的限制[6-8]。定性篩查嘧菌酯殘留時(shí)能夠通過匹配高分辨數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的結(jié)果，不用依賴篩查對(duì)照組，同時(shí)能夠準(zhǔn)確回溯數(shù)據(jù)內(nèi)容，做到有據(jù)可查。

基于以上優(yōu)點(diǎn)，本文應(yīng)用高分辨質(zhì)譜法快速篩查馬鈴薯種植土壤嘧菌酯殘留，為今后馬鈴薯的增產(chǎn)種植提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

土壤樣本：馬鈴薯種植土壤礦質(zhì)養(yǎng)分充足，肥力較強(qiáng)，夾雜半風(fēng)化母質(zhì)碎塊；呈現(xiàn)紅色質(zhì)地，pH值顯示為弱酸性，富含鐵元素及鋁元素，鹽基高度不飽和，同時(shí)富含有機(jī)物與腐殖質(zhì)，鉀元素與磷元素豐富；屬于壤質(zhì)粘土，土質(zhì)疏松呈現(xiàn)屑粒狀結(jié)構(gòu)。

材料：25%嘧菌酯懸浮劑(河南省安陽(yáng)市振華化工有限公司)；乙腈(山東省淄博市協(xié)創(chuàng)化工有限公司)；丙酮(江蘇省揚(yáng)州市貝爾新環(huán)境科技有限公司)；二氯甲烷(山東省濟(jì)南市坤豐化工有限公司)；無(wú)水硫酸鈉(湖北省武漢市華翔科潔生物技術(shù)有限公司)；弗羅里硅土柱(湖北省武漢市敬信科技有限公司)；石油醚(江蘇省蘇州市森菲達(dá)化工有限公司)；乙酸乙酯-環(huán)乙烷(山東省濟(jì)南市盈鑫化工有限公司)；色譜柱(天津市西納智能科技有限公司)。

儀器：四極桿-飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)(沃特世飛行技術(shù)有限公司)；液相色譜系統(tǒng)(廣東省通用儀器有限公司)；液相色譜儀(北京市京科瑞達(dá)科技有限公司)；三重四極桿質(zhì)譜儀(山東省梁山市鈺豪儀器設(shè)備有限公司)；渦旋混合器(河北省滄州市筑龍工程儀器有限公司)；恒溫水浴鍋(浙江省杭州市舍巖儀器有限公司)。

1.2 方法

高分辨質(zhì)譜法是近年來(lái)檢測(cè)土壤或農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留情況經(jīng)常使用的方法，本文研究中使用的高分辨質(zhì)譜法為飛行時(shí)間質(zhì)譜法，同時(shí)結(jié)合四級(jí)桿串聯(lián)與高效液相色譜法篩查馬鈴薯種植土壤中的嘧菌酯殘留情況[9]。研究在馬鈴薯種植土壤中嘧菌酯隨著時(shí)間推移殘留量消解變化規(guī)律，經(jīng)高分辨質(zhì)譜法分析獲得馬鈴薯種植土壤中嘧菌酯原始沉積量及嘧菌酯殘留時(shí)空變化，同時(shí)計(jì)算馬鈴薯種植土壤中的嘧菌酯殘留半衰期[10]。

1.2.1 土壤樣品準(zhǔn)備

為了方便后續(xù)試驗(yàn)，劃分試驗(yàn)區(qū)域?yàn)槊總€(gè)區(qū)域10 m2，并設(shè)置保護(hù)圍欄。實(shí)施嘧菌酯消解變化規(guī)律試驗(yàn)時(shí)施加2倍嘧菌酯劑量，按照常規(guī)比例充分混合水與2倍嘧菌酯懸浮劑，均勻噴灑在樣本土壤上至土壤充分濕潤(rùn)停止，采樣時(shí)間分別為施藥后的1、2、5、7、15、20、40、60、80、100與120 d。在樣品區(qū)域取1 kg土壤樣品，分別放置在惰性干凈的塑料袋中，并注明標(biāo)簽后攜帶回實(shí)驗(yàn)室。使用自然風(fēng)將土壤樣品風(fēng)干，風(fēng)干過程中使用干凈無(wú)菌的薄紙覆蓋土壤樣品，防止其他干擾因素混入，風(fēng)干完成后簡(jiǎn)單過篩并研磨處理，再次使用惰性塑料包裝袋裝好置于冰箱內(nèi)待提取，冰箱溫度為-21 ℃。

1.2.2 樣品的提取

嘧菌酯是一種有機(jī)化合物，在殘留情況篩查過程中需要考慮嘧菌酯的極性，同時(shí)篩查過程中也要考慮嘧菌酯及溶液性質(zhì)、基質(zhì)的特點(diǎn)，從而選取較為恰當(dāng)?shù)奶崛∪軇11-12]。已有研究中，由于丙酮具有良好的滲透力，經(jīng)常作為農(nóng)藥中各類物質(zhì)的提取溶劑，因此選取該試劑輔助篩查。具體過程：將丙酮適當(dāng)酸化，有利于從馬鈴薯種植土壤中提取出嘧菌酯成分，優(yōu)化提取效率。

為保證精準(zhǔn)提取馬鈴薯種植土壤中的嘧菌酯，并且確保具有較高的回收率，將丙酮溶液與占液體總質(zhì)量0.1%的冰醋酸混合，確保嘧菌酯回收率范圍為60%～100%[13]。不同地域的馬鈴薯種植土壤中的基質(zhì)存在差異，部分基質(zhì)對(duì)于嘧菌酯回收率較高，然而土壤中基質(zhì)的硫化物、生物堿等物質(zhì)較高將會(huì)嚴(yán)重影響嘧菌酯的回收率。為實(shí)現(xiàn)嘧菌酯的高效回收，對(duì)于土壤樣品可能存在的干燥情況，加水濕潤(rùn)處理[14]。

簡(jiǎn)單研磨處理土壤并稱取25 g土壤樣本，置于容量500 mL的三角瓶中，在三角瓶中添加25 mL去離子水，充分浸泡土壤，浸泡時(shí)間設(shè)置為20 min。浸泡完成后在三角瓶中添加75 mL丙酮，利用振蕩儀充分振蕩，振蕩時(shí)間設(shè)置為35 min。完成振蕩后抽濾溶液，使用35 mL丙酮沖洗兩次液體殘?jiān)?，沖洗完成后合并溶液。取一個(gè)容量為300 mL的平底燒瓶，將溶液轉(zhuǎn)移至該平底燒瓶中，恒溫水浴鍋溫度設(shè)置為45 ℃，將溶液置于水浴鍋中實(shí)行減壓濃縮至25 mL方可停止，取一支容量為500 mL的分液漏斗，向漏斗轉(zhuǎn)移溶液，與氯化鈉水溶液(100 mL，5%濃度)混合，萃取時(shí)引入二氯甲烷液，使用硫酸鈉收集二氯甲烷層，水浴鍋溫度調(diào)至40 ℃，減壓濃縮，使得溶液接近干燥，使用氮?dú)鈱牍腆w吹干處理后靜置。

1.2.3 樣品的凈化

取經(jīng)過脫活的弗羅里硅土柱3 g，使用約1 cm無(wú)水硫酸鈉施加在弗羅里硅土柱兩端，再使用石油醚25 mL對(duì)弗羅里硅土柱預(yù)淋。取提取的土壤樣本，用乙酸乙酯-環(huán)乙烷3.5 mL實(shí)現(xiàn)溶解，溶解完成后上柱，使用純水與純甲醇混合液洗脫土壤中嘧菌酯，收集流出的液體。減壓狀態(tài)下設(shè)定恒溫水浴鍋溫度為45 ℃，將溶液濃縮接近干燥，使用氮?dú)獯蹈桑ㄈ莨腆w時(shí)使用乙酸乙酯，靜置等待后續(xù)測(cè)定。

1.2.4 色譜條件與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

色譜柱：型號(hào)為BDS-C18，規(guī)格為260 mm×4.5 mm×4.5 μm。

流動(dòng)相：使用甲醇與水組合的混合物，二者體積比例為6∶4。

流速設(shè)為0.9 mL/min，色譜柱溫度設(shè)為35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)與進(jìn)樣體積分別為265 nm與11 μm。

使用外標(biāo)分析法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，調(diào)配嘧菌酯母液，濃度設(shè)定為550 mg/L，通過稀釋法制備嘧菌酯標(biāo)準(zhǔn)液，濃度分別為0.02、0.06、0.12、0.48、1.10和5.10 mg/L，進(jìn)樣量設(shè)定為1 μL，由此得出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 質(zhì)譜條件

設(shè)定毛細(xì)管電壓(正負(fù)離子模式)與電噴霧離子源溫度分別為3 200 V與300 ℃；設(shè)定質(zhì)譜正、負(fù)離子模式的掃描范圍分別為110～1 100與400～450 m/z；正、負(fù)離子掃描切換時(shí)間均為1 s；分辨率與掃描頻率分別為70 000與3.6 Hz。

1.2.6 定性篩查

土壤樣品使用高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)中攜帶的篩查軟件構(gòu)建篩查數(shù)據(jù)庫(kù)，用于分析馬鈴薯種植土壤中的嘧菌酯準(zhǔn)確分子量、碎片離子信息及同位素峰型，上述3個(gè)指標(biāo)是篩查土壤中各種農(nóng)藥殘留的重要指標(biāo)，目前眾多研究均表明通過篩查數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)于農(nóng)藥類的藥品篩查測(cè)試時(shí)，定性篩查可行性較高[15]。

1.2.7 濃度差異下嘧菌酯殘留量統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)

為進(jìn)一步驗(yàn)證馬鈴薯種植土壤中嘧菌酯最終殘留情況，將土壤樣本劃分成多個(gè)區(qū)域，間隔7 d分別噴灑濃度為190 g(ai)/hm2的嘧菌酯溶液和濃度為250 g(ai)/hm2的嘧菌酯溶液，一部分土壤樣本施藥3次，一部分土壤施藥4次，分別記錄施藥后距離收獲2、4、6和8 d的嘧菌酯殘留量。

2 結(jié)果分析

2.1 凈化效果驗(yàn)證

在馬鈴薯種植土壤嘧菌酯殘留快速篩查時(shí)使用弗羅里硅土柱實(shí)現(xiàn)樣品的凈化，為獲得嘧菌酯在弗羅里硅土柱上的保留情況，需要先確定石油醚淋洗弗羅里硅土柱的曲線，由此驗(yàn)證凈化處理效果。凈化淋洗曲線變化效果如圖1所示。

圖1 弗羅里硅土柱上的嘧菌酯洗脫曲線Fig.1 Elution curve of azoxystrobin on Florisil column

由圖1可知，從洗脫劑用量達(dá)到14.5 mL開始，土壤溶液的嘧菌酯回收率已經(jīng)超過90%，且自該用量以后即使依然增加洗脫劑用量嘧菌酯回收率不會(huì)發(fā)生明顯變化。由此可以看出，凈化處理階段只需保持洗脫劑用量在14.5 mL時(shí)就可以保持較好的回收效果，洗脫劑用量的增加并不會(huì)對(duì)嘧菌酯回收率造成顯著影響。

2.2 色譜情況

在200～410 nm范圍內(nèi)，樣品掃描時(shí)需要使用紫外分光光度計(jì)，選擇波長(zhǎng)時(shí)需要考慮方法適用性和成分響應(yīng)值等因素，多方驗(yàn)證后確定波長(zhǎng)為255 nm。使用體積比例存在差異的丙酮與水混合物，以及甲醇與水混合物分別開展流動(dòng)相試驗(yàn)，試驗(yàn)開始之前先要確定方法足夠簡(jiǎn)單且分離效果快速有效。如果配比中，丙酮在混合物中的占比分別低于總?cè)芤罕壤?0%，會(huì)導(dǎo)致色譜柱大量保留嘧菌酯，造成過晚出峰；相反，如果配比中，丙酮在混合物中的占比分別高于總?cè)芤罕壤?0%，會(huì)導(dǎo)致色譜柱大量保留嘧菌酯，造成過早出峰。如果出現(xiàn)過早或者過晚出峰，都會(huì)分離不充分，出現(xiàn)嚴(yán)重雜質(zhì)干擾。綜合這些影響因素，確定丙酮與水之間的比例為6:4的流動(dòng)相是最佳混合物比例。土壤樣品優(yōu)化后混合溶液色譜圖如圖2所示。

圖2 溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of solution

經(jīng)過優(yōu)化后的色譜圖出現(xiàn)比較尖銳的堆成峰型，保證雜質(zhì)被較好分離，且時(shí)間恰當(dāng)，符合土壤嘧菌酯殘留分析需求，經(jīng)過分析，嘧菌酯保留時(shí)間約為12.5 min。

2.3 定性篩查結(jié)果

通過高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)開展定性篩查，馬鈴薯種植土壤中嘧菌酯殘留篩查色譜與質(zhì)譜圖如圖3所示。

圖3a是在全掃描模式下，在5 mg/kg質(zhì)量數(shù)偏差范圍中嘧菌酯離子色譜圖，在此基礎(chǔ)上可以開展精確碎片離子分析與同位素峰型匹配。圖3b是經(jīng)過質(zhì)譜篩查獲得的嘧菌酯同位素峰286.366與母離子精確質(zhì)量數(shù)285.363。圖3c統(tǒng)計(jì)母離子精確質(zhì)量數(shù)下發(fā)生的ddMS2掃描情況，由此進(jìn)一步獲得高能量碰撞情況下獲得的嘧菌酯保留時(shí)間二級(jí)質(zhì)譜圖，由此得到圖3d的二級(jí)質(zhì)譜碎片離子結(jié)果：69.799、87.187、158.227和188.274。

圖3 色譜圖與質(zhì)譜圖Fig.3 Chromatogram and mass spectrum

根據(jù)以上篩查過程，定性篩查土壤樣品嘧菌酯殘留，篩查結(jié)果如表1所示。

表1 定性篩查結(jié)果Tab.1 Qualitative screening results

2.4 定量下限與線性范圍結(jié)果

土壤樣品中嘧菌酯濃度情況(線性范圍、定量下限、加標(biāo)濃度差異下標(biāo)準(zhǔn)偏差與回收率)范圍如表2所示。

表2 濃度范圍Tab.2 Concentration range

按設(shè)定的色譜條件與質(zhì)譜條件，使用高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)開展標(biāo)準(zhǔn)溶液分析，繪制得到的嘧菌酯標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。

圖4 嘧菌酯標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of azoxystrobin

由圖4可知，在0.02～5.10 mg/L嘧菌酯濃度范圍，嘧菌酯標(biāo)準(zhǔn)濃度與峰面積之間存在較為均勻的線性關(guān)系。在色譜儀檢測(cè)條件下嘧菌酯最低檢出量標(biāo)識(shí)為1×10-11g。依據(jù)10倍信噪比確定嘧菌酯定量下限為0.9 μg/kg。歐盟規(guī)定農(nóng)藥的最低定量下限水平為10 μg/kg，本文篩查結(jié)果為0.9 μg/kg，說明該部分試驗(yàn)中馬鈴薯種植土壤中嘧菌酯符合最低報(bào)告水平。

2.5 嘧菌酯在馬鈴薯種植土壤中的消解動(dòng)態(tài)

在馬鈴薯種植土壤中嘧菌酯的消解動(dòng)態(tài)情況如表3所示。

表3 馬鈴薯種植土壤中嘧菌酯殘留消解動(dòng)態(tài)Tab.3 Degradation dynamics of azoxystrobin residues in potato planting soil

由表3可知，馬鈴薯種植土壤中嘧菌酯呈現(xiàn)緩慢消解狀態(tài)，施藥1 d嘧菌酯殘留量為0.526 6 mg/kg，當(dāng)施藥天數(shù)達(dá)到120 d以后，嘧菌酯殘留量降至0.046 7 mg/kg，降解率為93.35%，半衰期約為33.87 d。土壤中嘧菌酯類農(nóng)藥消解快慢情況受到氣候因素和土壤性質(zhì)等多種外部因素影響，由表3可知，馬鈴薯種植土壤中的嘧菌酯消解速度較慢，符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)消解模式情況。

2.6 不同濃度嘧菌酯消解情況

不同嘧菌酯濃度與施藥次數(shù)下馬鈴薯種植土壤最終殘留情況如表4所示。

由表4可知，嘧菌酯濃度與施藥次數(shù)上升都會(huì)增加土壤中初始嘧菌酯殘留情況，隨著間隔時(shí)間的增長(zhǎng)，殘留濃度也會(huì)適當(dāng)下降，嘧菌酯施藥濃度越高，殘留量也就越高，因此實(shí)際種植時(shí)需要控制嘧菌酯的使用次數(shù)與使用濃度。而且實(shí)際種植時(shí)，考慮不同土壤與氣候特征影響，應(yīng)該適當(dāng)調(diào)整嘧菌酯用量。

表4 不同嘧菌酯濃度下殘留量統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.4 Statistical results of residue under different azoxystrobin concentrations

3 結(jié)論

研究基于高分辨質(zhì)譜法的馬鈴薯種植土壤嘧菌酯殘留快速篩查方法，使用高分辨質(zhì)譜法結(jié)合四級(jí)桿串聯(lián)與高效液相色譜法篩查馬鈴薯種植土壤中的嘧菌酯殘留情況，對(duì)馬鈴薯種植土壤中嘧菌酯殘留開展定性和定量分析。經(jīng)過試驗(yàn)表明，高分辨質(zhì)譜法能夠有效提取出嘧菌酯的詳細(xì)質(zhì)量色譜圖，還能同時(shí)開展二級(jí)質(zhì)譜碎裂，獲得比較準(zhǔn)確的碎片質(zhì)量數(shù)，經(jīng)過試驗(yàn)進(jìn)一步研究還能獲得嘧菌酯隨著時(shí)間推移，嘧菌酯消解殘留情況，以及不同嘧菌酯濃度下消解殘留量，由此能夠看出，實(shí)際種植過程中適當(dāng)調(diào)整嘧菌酯用量，不但不會(huì)造成過多的嘧菌酯殘留還能提升馬鈴薯?yè)搅?，降低病蟲害。