高 賽，劉 佳，唐玉情，唐中華，張 捷

（1.東北林業(yè)大學(xué) a.園林學(xué)院；b.化學(xué)化工與資源利用學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.中國(guó)科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，黑龍江 哈爾濱 150081）

花色作為觀賞植物的重要品質(zhì)性狀，其形成受到多方面因素的共同影響。其中，花瓣作為花色素的物質(zhì)載體其直接接受光源的照射，內(nèi)部結(jié)構(gòu)及表皮細(xì)胞構(gòu)造等物理特性均會(huì)影響花瓣的呈色[1-2]。此外，花瓣細(xì)胞內(nèi)的重要環(huán)境因子（如色素細(xì)胞介質(zhì)環(huán)境的pH 值、金屬元素含量等）均會(huì)影響花色素的呈色，進(jìn)而影響花色[3-4]。花色素是花瓣呈色的物質(zhì)基礎(chǔ)，不同的色素種類(lèi)及其含量差異是花色形成的直接影響因素。植物體內(nèi)可產(chǎn)生不同類(lèi)型的化合物200 000 余種，其中包括許多有色化合物，有關(guān)研究結(jié)果表明，參與花色形成的色素類(lèi)型主要包括類(lèi)胡蘿卜素、類(lèi)黃酮和甜菜堿這三大類(lèi)。類(lèi)胡蘿卜素屬萜類(lèi)化合物的一個(gè)子類(lèi)，是黃色、橙色花形成的重要色素。類(lèi)黃酮是屬于苯丙烷類(lèi)的一類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物，其化合物眾多，對(duì)花色的影響范圍也更廣，顏色可由淺黃到藍(lán)色；其中的花青素作為花色形成中最重要的基礎(chǔ)色素化合物，其可為植物花瓣提供多種顏色，從紅色、橙色到紫色、藍(lán)色。甜菜素屬含氮類(lèi)化合物，其僅存在于石竹科等少數(shù)植物譜系中，可賦予花瓣以黃色至紅色[5-6]。由于不同植物合成和積累的色素類(lèi)型不同，花色多樣性差異很大。如草莓Fragaria ananassa和楊梅Myrica rubra通常只能產(chǎn)生并積累一種色素，因此其僅能呈現(xiàn)單種顏色[7-8]；而如玫瑰Rosa rugosa、菊花Chrysanthemum morifolium、月季Rosa chinensis等花色豐富，是因?yàn)槠浠ò曛型瑫r(shí)存在多種花青素苷和類(lèi)胡蘿卜素[9-11]。

長(zhǎng)春花Catharanthus roseus為夾竹桃科Apocynaceae 長(zhǎng)春花屬Catharanthus多年生草本或亞灌木植物。近年來(lái)，針對(duì)不同的園林用途及應(yīng)用地域，國(guó)內(nèi)外特別是美國(guó)和歐洲的一些國(guó)家的育種專(zhuān)家及園藝公司已選育出不少不同花色、株型的新品種，擴(kuò)大了長(zhǎng)春花的應(yīng)用范圍，極大地提高了其觀賞價(jià)值。近年來(lái)，我國(guó)從國(guó)外引進(jìn)了不少長(zhǎng)春花的新品種用于盆栽和園林中，主栽品種包括太平洋系列（Pacifica）、地中海系列（Mediterranean）、清涼系列（Cooler）、熱浪系列（Heat Wave）、太陽(yáng)風(fēng)暴系列（Sun Storm）、大力神系列（Titan）及中國(guó)（主要是海南?。┲髟缘钠贩N等。目前，針對(duì)長(zhǎng)春花的相關(guān)研究?jī)?nèi)容主要集中于長(zhǎng)春花生活史型的形成、逆境脅迫下相關(guān)生理代謝特性、不同品種相關(guān)農(nóng)藝性狀及品種資源遺傳關(guān)系等方面[12-14]；此外，長(zhǎng)春花是研究萜類(lèi)吲哚生物堿（Terpenoid indole alkaloids,TIA）生物合成與調(diào)控的模式物種，因此更多更深的研究?jī)?nèi)容主要集中于其成分提取及藥用價(jià)值方面[15]。長(zhǎng)春花作為我國(guó)南、北方園林中的重要觀賞花卉，其在園林應(yīng)用中的相關(guān)研究?jī)H見(jiàn)于其引種栽培技術(shù)與景觀設(shè)計(jì)方面，尚未見(jiàn)到有關(guān)長(zhǎng)春花花色形成及新花色品種培育的相關(guān)研究報(bào)道。為此，本研究對(duì)長(zhǎng)春花部分品種的花色表型、花瓣結(jié)構(gòu)、花瓣細(xì)胞液pH 值、金屬元素含量和花色素的組分與含量進(jìn)行了測(cè)定及分析，以研究長(zhǎng)春花花色形成與細(xì)胞內(nèi)重要理化環(huán)境的關(guān)系，為深入研究長(zhǎng)春花花色形成的機(jī)理及新花色品種的培育奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料包括4個(gè)紅色長(zhǎng)春花品種‘Cranberry’‘Red Halo’‘Burgundy’‘Lilac’與1個(gè)白花品種‘White with Eye’和1個(gè)藍(lán)花品種‘Light Blue’，其花色如圖1所示。供試的長(zhǎng)春花品種種子購(gòu)自高美（Goldsmith seeds）育種公司，于2020年7月29日播于試驗(yàn)用的溫室中，1 周后陸續(xù)上盆進(jìn)行水培。10月中下旬其陸續(xù)達(dá)到盛花期，于此期隨機(jī)采集各品種不同單株生長(zhǎng)良好且著色充分的新鮮花瓣，將采集的一部分花瓣樣品立即用于花色表型的測(cè)定和解剖結(jié)構(gòu)特征的觀察，將其余花瓣樣品保存于-80 ℃的冰箱中以用于后續(xù)花瓣細(xì)胞液pH 值、金屬元素含量及花色素組分含量的測(cè)定。

圖1 6個(gè)長(zhǎng)春花品種的花色表型Fig.1 Petal phenotypes of six vinca cultivars

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花色表型的觀測(cè)

取新鮮花瓣，于室內(nèi)靠近北面的自然散射日光光源下，將不同品種長(zhǎng)春花花瓣的中間部分與英國(guó)皇家園藝學(xué)會(huì)比色卡（Royal Horticultural Society Color Chart,RHSCC）進(jìn)行比對(duì)，以判斷花色的類(lèi)型[16]。同時(shí)，為了將不同品種長(zhǎng)春花花瓣的顏色數(shù)量化，以便進(jìn)行量化分析，根據(jù)國(guó)際照明委員會(huì)（Commission Internationale De L’Eclairage,CIE）的CIELab 色空間系統(tǒng)，使用CR-400 便攜式色差儀測(cè)定各品種的花色參數(shù)明度（L*）、紅度（a*）、黃度（b*）值[17-18]。觀測(cè)時(shí)應(yīng)注意將色差儀的集光孔對(duì)準(zhǔn)長(zhǎng)春花花瓣的中間部分進(jìn)行測(cè)量，每個(gè)品種各取5個(gè)不同單株的盛花期花瓣，每個(gè)樣品的觀測(cè)各設(shè)3個(gè)技術(shù)重復(fù)，取其平均值。

1.2.2 花瓣解剖結(jié)構(gòu)的觀察

采用徒手切片法，分別制作長(zhǎng)春花花瓣上、下表皮細(xì)胞及橫截面的臨時(shí)水裝片。制片后立即進(jìn)行光學(xué)顯微觀察，利用尼康制冷DS 顯微鏡相機(jī)及顯微圖像分析軟件NIS-Elements 進(jìn)行拍照，觀察色素細(xì)胞在花瓣結(jié)構(gòu)中的排列分布狀況及花色素在細(xì)胞中的呈色類(lèi)型。同時(shí)，用目鏡測(cè)微器測(cè)量6 種花瓣橫截面的厚度及其單層上、下表皮細(xì)胞的高寬比，每個(gè)品種各選取3 張照片觀測(cè)，每張照片至少測(cè)定5個(gè)細(xì)胞，取其平均值。

1.2.3 花瓣細(xì)胞液pH 值的測(cè)定

取2 g 新鮮花瓣，在液氮中迅速研磨成粉末，充分均質(zhì)化后盛入10 mL 的離心管中，于4 ℃的溫度條件下以12 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心10 min，將上層細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，采用pH 計(jì)在25 ℃的溫度條件下測(cè)定各個(gè)品種的細(xì)胞液pH 值，每個(gè)品種的測(cè)定各設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定4 次，取其平均值。

1.2.4 花瓣金屬元素含量的測(cè)定

參照Qi 等[19]的操作方法測(cè)定花瓣中各種金屬元素的含量。每個(gè)品種各取適量花瓣，用去離子水洗凈，置于105 ℃的烘箱中殺青15 min，再置于70 ℃的溫度條件下干燥12 h。精確稱(chēng)取干燥花瓣1 g，充分研磨后，分別加入5 mL 的HNO3和1 mL 的HClO4，使用高效微波消解儀進(jìn)行消解，經(jīng)過(guò)消解及脫酸后，采用去離子水溶解稀釋樣品。然后，采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICPOES）分別測(cè)定各個(gè)樣品中鉀（K）、鈣（Ca）、鈉（Na）、鎂（Mg）、鐵（Fe）、銅（Cu）、鋅（Zn）、錳（Mn）、硼（B）、鉬（Mo）這10 種金屬元素的含量。測(cè)定前將所需的玻璃及塑料制品均放在5%的HNO3水溶液中浸泡3 d，并用超純水沖洗3 遍以上。每個(gè)品種各設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)樣品各重復(fù)測(cè)定3 次，取其平均值。

1.2.5 長(zhǎng)春花不同花色素含量的測(cè)定

花色苷含量的測(cè)定：取長(zhǎng)春花新鮮花瓣，剪碎后混勻，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2 g 置于15 mL 的離心管中，向離心管中加入1%的鹽酸-甲醇（1∶99，V∶V）溶液10 mL，擰緊管塞后用錫箔紙包嚴(yán)，于室溫下浸提24 h，期間振蕩幾次，直至樣品組織變白[20-22]。取過(guò)濾后的長(zhǎng)春花花色苷提取液，稀釋后置于光徑為1 cm 的比色杯中，以1%的鹽酸-甲醇溶液為空白對(duì)照，使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定530 nm 處的吸光值。根據(jù)如下公式計(jì)算花青素苷含量：

AMF=A530×V×N/(98.2×m)。

式中，AMF表示花瓣中花青素苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其計(jì)量單位為mg·g-1；A530表示530 nm 處的吸光值；V表示定容體積，其計(jì)量單位為mL；N表示稀釋倍數(shù)；98.2 為平均消光系數(shù)；m為花瓣質(zhì)量，其計(jì)量單位為g。每個(gè)品種的測(cè)定各設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，取其平均值。

葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素含量的測(cè)定：準(zhǔn)確稱(chēng)取不同花色長(zhǎng)春花品種的新鮮花瓣粉末0.2 g，置于15 mL 的離心管中，向離心管中加入10 mL 的無(wú)水乙醇-丙酮（1∶2，V∶V）浸提液，擰緊管塞后用錫箔紙包嚴(yán)，置于常溫下避光環(huán)境中浸提24 h，期間振蕩幾次，直至樣品組織變白。取過(guò)濾后的提取液，稀釋后置于光徑為1 cm 的比色杯中，以無(wú)水乙醇-丙酮（1∶2，V∶V）的混合液為空白對(duì)照，使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)分別為635、649 及470 nm 處的吸光值。每個(gè)品種的測(cè)定各設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，取其平均值。根據(jù)以下公式分別計(jì)算葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素的含量：

Ca=13.95A665-6.88A649；

Cb=24.96A649-7.32A665；

C(a+b)=(1000A470-2.05Ca-114.8Cb)/245。

式中：Ca表示葉綠素a 的濃度，Cb表示葉綠素b的濃度，Ca與Cb相加即為總?cè)~綠素的濃度；C(a+b)表示類(lèi)胡蘿卜素的濃度（mg·L-1）。

色素含量(mg·g-1)=C×V×N/(1 000×W)。式中：C表示色素濃度，其計(jì)量單位為mg·L-1；V表示提取液體積，其計(jì)量單位為mL；N表示稀釋倍數(shù)；W表示樣品質(zhì)量，其計(jì)量單位為g。

總黃酮含量的測(cè)定：稱(chēng)取不同花色長(zhǎng)春花花瓣粉末0.10 g 放入15 mL 的離心管中，加入10 mL的甲醇浸提48 h，將浸提液定容至10 mL[23]。采用氯化鋁顯色法，黃酮化合物與AlCl3發(fā)生反應(yīng)后會(huì)生成黃色的黃酮鋁絡(luò)合物。將標(biāo)準(zhǔn)樣品蘆?。≧utin，蕓香苷為C27H30O16·3H2O，純度≥95%，Sigma 試劑公司）于105 ℃的烘箱中烘干1 h[24]，準(zhǔn)確稱(chēng)取蘆丁樣品20.30 mg，用1%的鹽酸甲醇（1∶99，V∶V）溶液定容至25 mL，配成0.812 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液。分別取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的標(biāo)準(zhǔn)液加入1%的鹽酸甲醇溶液至4 mL，再分別加入1%的AlCl3·6H2O 甲醇溶液6 mL，平衡10 min。使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在220 ～700 nm 的波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在波長(zhǎng)分別為330 和270 nm 處各有一個(gè)吸收峰，以330 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的吸光值（A330），根據(jù)A330的吸光值和標(biāo)準(zhǔn)樣品蘆丁溶液的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到的線(xiàn)性回歸方程為：C=0.076A330+0.001，R2=0.997。式中，C為蘆丁濃度（mg·mL-1），A330為330 nm 處的吸光值。分別取不同品種的提取液2 mL，加入1%的AlCl3·6H2O 甲醇溶液3 mL，平衡10 min，上機(jī)測(cè)定A330，將其代入回歸方程中，計(jì)算各個(gè)長(zhǎng)春花樣品溶液的濃度，并計(jì)算樣品中總黃酮的含量（mg·g-1）。每個(gè)品種的測(cè)定各設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，取其平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2013、SPSS 22.0 及Canoco 5.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均為（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）。

2 結(jié)果與分析

2.1 花色表征

不同品種長(zhǎng)春花花色的分類(lèi)結(jié)果見(jiàn)表1。以RHSCC 植物標(biāo)準(zhǔn)比色卡比對(duì)后判斷，6個(gè)品種的花色可以分為4個(gè)色系：‘White with Eye’為白色系；‘Red Halo’‘Burgundy’‘Lilac’均為紅紫色系；‘Cranberry’為紅色系；‘Light Blue’為紫羅蘭色系。由表1 可知，6個(gè)長(zhǎng)春花品種之間花色值的差異顯著。其中，明度L*值表示花色的明暗程度，其度量值為0 ～100，顏色表現(xiàn)為從黑色到白色的變化狀態(tài)，L*值越小則花色越暗，反之則花色越亮。白色系品種‘White with Eye’花瓣的明度L*值最高，而紅色系品種‘Cranberry’花瓣的明度L*值最低；除‘White with Eye’外，其他5個(gè)品種花瓣正面的L*值均小于其背面的L*值，且其花色均由白色變至正紅色，隨著花色的加深，其L*值均呈逐漸下降趨勢(shì)。色相a*值反映花瓣的紅綠程度，其度量值為-128 ～127，正值表示顏色偏紅，負(fù)值表示顏色偏綠。6個(gè)品種花瓣正面的a*值均大于其反面的，除白花品種‘White with Eye’的a*值為負(fù)值外，其他品種的a*值均為正值，且紅、紫色系品種花瓣的a*值比藍(lán)白色系品種的明顯偏高，因此，依據(jù)a*值可以有效區(qū)分長(zhǎng)春花紅、紫色系與其他色系，隨著a*值的逐漸增大，長(zhǎng)春花的花色逐漸變?yōu)檎t色。色相b*值的正、負(fù)值分別代表黃度和藍(lán)度，其度量值亦為-128 ～127。長(zhǎng)春花品種中缺少黃色系花，因此各品種的黃度值普遍較低，其中‘Light Blue’‘Lilac’‘Burgundy’這3個(gè)品種花瓣的b*值均為負(fù)值，說(shuō)明其花色相對(duì)更偏藍(lán)色。

表1 不同長(zhǎng)春花品種的花色類(lèi)別及花色值?Table 1 Classification and value of floral color of different vinca cultivars

2.2 長(zhǎng)春花花瓣呈色的相關(guān)理化指標(biāo)分析

2.2.1 花瓣解剖結(jié)構(gòu)分析

長(zhǎng)春花花瓣橫截面及上、下表皮細(xì)胞解剖結(jié)構(gòu)如圖2所示。由圖2 可知，長(zhǎng)春花花瓣橫截面結(jié)構(gòu)包括上表皮、中層組織及下表皮，中層組織部分未觀察到柵欄組織和海綿組織的明顯分化。在‘White with Eye’花瓣的各個(gè)組織中，沒(méi)有觀察到明顯的有色物質(zhì)的積累，白色花表型可能是由入射光線(xiàn)在花瓣內(nèi)部連續(xù)折射而形成的一種光學(xué)現(xiàn)象。其他5個(gè)長(zhǎng)春花品種的有色細(xì)胞均集中分布于花瓣的上表皮，而中層組織及下表皮細(xì)胞中基本觀察不到色素物質(zhì)的存在，這種色素分布方式可能有助于長(zhǎng)春花花色的呈現(xiàn)。

圖2 長(zhǎng)春花花瓣橫截面及上、下表皮細(xì)胞解剖結(jié)構(gòu)Fig.2 Anatomical structure of petal cross section and upper and lower epidermal cells of vinca

續(xù)圖2Continuation of Fig.2

不同花色品種長(zhǎng)春花花瓣厚度的觀測(cè)結(jié)果如圖3所示。圖3 表明，6個(gè)品種長(zhǎng)春花的花瓣厚度為193.10 ～200.47 μm，不同品種間其花瓣厚度存在顯著差異。紅色系‘Cranberry’的花瓣最厚，紅紫色系‘Red Halo’和‘Burgundy’的花瓣均較厚，而白色系‘White with Eye’的花瓣最薄。不同花色品種長(zhǎng)春花花瓣表皮細(xì)胞高寬比的測(cè)量結(jié)果如圖4所示。圖4 表明，6個(gè)品種長(zhǎng)春花上表皮細(xì)胞的高寬比均高于其下表皮的。結(jié)合圖2 的花瓣解剖結(jié)構(gòu)分析可知，長(zhǎng)春花花瓣上表皮細(xì)胞呈圓錐狀，向上凸起，且相鄰細(xì)胞間略有間隙，其上無(wú)角質(zhì)層覆蓋；中層組織細(xì)胞為不規(guī)則長(zhǎng)橢圓形，大小不一，且排列較為疏松；下表皮細(xì)胞為不規(guī)則多邊形，扁平狀無(wú)凸起，排列較為緊密。

圖3 不同花色品種長(zhǎng)春花花瓣厚度的觀測(cè)結(jié)果Fig.3 Petal thickness values of vinca varieties with different floral colors

圖4 不同花色品種長(zhǎng)春花花瓣表皮細(xì)胞高寬比的觀測(cè)結(jié)果Fig.4 The ratio of height to width of petal epidermal cells in different floral colors of vinca varieties

2.2.2 細(xì)胞液的pH 值

不同花色品種長(zhǎng)春花花瓣細(xì)胞液pH 值的測(cè)定結(jié)果如圖5所示。圖5 表明，6個(gè)品種長(zhǎng)春花的花瓣細(xì)胞液pH 值為4.58 ～5.68，其平均值為5.12，說(shuō)明其細(xì)胞液均呈偏酸性，且不同花色品種間其差異顯著。其中，紫羅蘭色系‘Light Blue’的花瓣細(xì)胞液pH 值最高，白色系‘White with Eye’的次之，紅、紫色系的花瓣細(xì)胞液pH 值普遍低于藍(lán)、白色系的。

圖5 不同花色品種長(zhǎng)春花花瓣細(xì)胞液pH 值的測(cè)定結(jié)果Fig.5 The pH of petal cell fluid of different floral varietals of vinca

2.2.3 金屬元素的含量分析

不同花色品種長(zhǎng)春花花瓣中10 種金屬元素含量的測(cè)定結(jié)果如圖6所示。6個(gè)品種長(zhǎng)春花花瓣內(nèi)的大量元素中，鉀（K）元素含量均最高，為2.25 ～3.45 mg·g-1，平均為2.72 mg·g-1，是其他9 種元素含量總和的3.7 倍；紅紫色系‘Red Halo’花瓣中的K 含量最高，紅紫色系色系‘Burgundy’花瓣中的K 含量最低。其次為鈣（Ca）元素，其含量為0.16 ～0.40 mg·g-1，平均為0.26 mg·g-1；白色系‘White with Eye’花瓣中的Ca 含量最高，紅色系‘Cranberry’花瓣中的Ca 含量最低。含量排在第三位的是鎂（Mg）元素，其含量為0.09 ～0.13 mg·g-1，平均為0.11 mg·g-1；紅紫色系‘Red Halo’花瓣中的Mg含量最高，紅紫色系色系‘Lilac’花瓣中的Mg 含量最低。6個(gè)品種長(zhǎng)春花花瓣中的鈉（Na）元素含量為0.07 ～0.12 mg·g-1，平均為0.10 mg·g-1；紅色系‘Cranberry’花瓣中的Na 含量最高，紅紫色系‘Red Halo’花瓣中的Na 含量最低。6個(gè)品種長(zhǎng)春花花瓣內(nèi)的微量元素中，鐵（Fe）元素含量明顯高于其他元素的含量，為99.00 ～247.23 mg·g-1，平均為167.13 mg·g-1；紅紫色系色系‘Burgundy’花瓣中的Fe 含量最高，紅紫色系色系‘Red Halo’花瓣中的Fe 含量最低。6個(gè)品種長(zhǎng)春花花瓣中其他5 種金屬元素的含量由高到低依次為錳（Mn）、鋅（Zn）、硼（B）、銅（Cu）、鉬（Mo）。6個(gè)品種長(zhǎng)春花花瓣中的Mn 含量為21.17 ～52.03 mg·g-1，其平均值為35.52 mg·g-1；其Zn 含量為16.07 ～31.77 mg·g-1，其平均值為23.62 mg·g-1；其B 含量為13.27 ～26.47 mg·g-1，其平均值為19.84 mg·g-1；其Cu 含量為2.87 ～7.00 mg·g-1，其平均值為4.51 mg·g-1；其Mo 含量為0.73 ～1.70 mg·g-1，其平均值為1.13 mg·g-1。各品種間所測(cè)10 種金屬元素的含量差異均顯著。

圖6 不同花色長(zhǎng)春花品種花瓣中不同金屬元素的含量Fig.6 Different contents of metal elements in petals of vinca varieties with different colors

2.2.4 花色素含量的測(cè)定結(jié)果

不同花色品種長(zhǎng)春花結(jié)果盛花期的花瓣中均含有四大類(lèi)色素，且各種類(lèi)型的色素在不同品種中的含量均存在明顯差異，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。表2表明，‘Red Halo’與‘Cranberry’這2個(gè)品種花瓣中的葉綠素與類(lèi)胡蘿卜素的含量均顯著高于其他品種的；6個(gè)品種長(zhǎng)春花的花瓣中，葉綠素的平均含量?jī)H為0.025 mg·g-1，類(lèi)胡蘿卜素的平均含量?jī)H為0.006 5 mg·g-1，此二者在長(zhǎng)春花花瓣中都表現(xiàn)為痕量存在?；ㄉ帐腔ò曛闹饕仡?lèi)型。6個(gè)品種長(zhǎng)春花花瓣中的花色苷含量，白色系‘White with Eye’的含量最低，為0.203 mg·g-1；紅色系‘Cranberry’的含量最高（22.577 mg·g-1），是‘White with Eye’含量的111 倍。4個(gè)色系的花色苷含量由高至低依次為紅色系＞紅紫色系＞紫羅蘭色系＞白色系。黃酮類(lèi)化合物也是影響花瓣著色的重要物質(zhì)。6個(gè)品種長(zhǎng)春花花瓣中黃酮類(lèi)化合物的平均含量為38.275 mg·g-1；其中，‘Cranberry’的含量最高，‘Red Halo’的含量次之，‘White with Eye’的含量最低。

表2 不同花色品種長(zhǎng)春花花瓣中不同色素含量?Table 2 Different pigment content in petals of different color vinca varieties mg·g-1

2.3 影響長(zhǎng)春花花瓣呈色的各項(xiàng)理化指標(biāo)間的相關(guān)性分析

長(zhǎng)春花花色值、花瓣結(jié)構(gòu)與各項(xiàng)理化指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3，花瓣中不同金屬元素含量及各種花色素間的相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表4。由表3 可知，不同花色品種長(zhǎng)春花花瓣的L*值與a*值之間均呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），而與b*值之間均無(wú)顯著相關(guān)性。長(zhǎng)春花花瓣的明度L*值與花瓣厚度、上表皮細(xì)胞高寬比、總花色苷及總黃酮含量之間均存在極顯著負(fù)相關(guān)性（P＜0.01），而與花瓣細(xì)胞液pH 值、Ca 元素和Mn 元素含量之間均存在極顯著正相關(guān)，同時(shí)與葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量之間均存在顯著負(fù)相關(guān)性（P＜0.05）；反之，紅度a*值與花瓣厚度、上表皮細(xì)胞高寬比、總花色苷及總黃酮含量之間均存在極顯著正相關(guān)，而與花瓣細(xì)胞液pH 值、Ca 元素和Mn 元素含量之間均呈極顯著負(fù)相關(guān)，與葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量之間均存在顯著正相關(guān)。由此可知，花瓣厚度、上表皮細(xì)胞的高寬比、總花色苷及總黃酮含量的增加可明顯提高長(zhǎng)春花花瓣的紅度，在花瓣紅度增加的同時(shí)，花瓣表面的光澤度卻隨之降低，花色加深變暗；而細(xì)胞液pH 值、Ca 元素和Mn 元素含量的增加會(huì)降低花瓣的紅度值，而有效提高花瓣的亮度。葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素的含量都很少，但對(duì)于花瓣的花色值也都有一定程度的影響。6個(gè)品種的b*值與花瓣細(xì)胞液pH 值之間均呈極顯著負(fù)相關(guān)，而與花瓣厚度及色素含量間均呈顯著正相關(guān)。此外，長(zhǎng)春花花瓣的各項(xiàng)理化指標(biāo)之間也存在著明顯的相關(guān)性。其中，葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素、花色苷和總黃酮四大類(lèi)色素含量彼此之間存在極顯著的正相關(guān)性（表4），且四者與花瓣細(xì)胞液pH 值和Ca、Mn 元素含量之間均呈極顯著負(fù)相關(guān)。此外，花瓣厚度、表皮細(xì)胞高寬比與細(xì)胞液pH 值三者彼此之間也具有顯著的相關(guān)性。

表3 長(zhǎng)春花花色值、花瓣結(jié)構(gòu)與各項(xiàng)理化指標(biāo)值之間的相關(guān)系數(shù)?Table 3 Correlation coefficient between flower color value,petal structure and physicochemical indexes of vinca

以上分析結(jié)果表明，長(zhǎng)春花花瓣中葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素、花色苷及黃酮類(lèi)化合物之間彼此相互促進(jìn)，而花瓣細(xì)胞液pH 值和Ca、Mn 元素含量與四大類(lèi)花色素含量間卻相互抑制。細(xì)胞液pH 值與Ca、Mn 元素含量間相互促進(jìn)，而與表皮細(xì)胞高寬比之間卻相互抑制。由此可知，影響長(zhǎng)春花花瓣呈色的各項(xiàng)理化指標(biāo)之間既相互聯(lián)系又彼此影響，共同決定了長(zhǎng)春花花瓣顏色的呈現(xiàn)。其中，色素作為花瓣呈色的物質(zhì)基礎(chǔ)，葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素、花色苷及總黃酮含量直接影響著長(zhǎng)春花的花色，而花瓣厚度、表皮細(xì)胞高寬比與細(xì)胞液pH值和Ca、Mn 元素含量可能通過(guò)影響光線(xiàn)的吸收折射及花色素的組分含量從而間接影響了長(zhǎng)春花花色的改變。

2.4 冗余分析

冗余分析（RDA 排序）能夠針對(duì)多項(xiàng)理化指標(biāo)有效地進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與檢驗(yàn)，并可確定對(duì)于長(zhǎng)春花花瓣呈色多樣性變化具有最大解釋率的最少變量的組成，能夠有效地簡(jiǎn)化變量個(gè)數(shù)，從而進(jìn)一步地作簡(jiǎn)化分析。對(duì)長(zhǎng)春花的花色值（L*、a*、b*值）與花瓣內(nèi)各項(xiàng)相關(guān)理化指標(biāo)之間的相關(guān)性進(jìn)行冗余分析，結(jié)果如圖7所示。圖7 中的實(shí)心箭頭表示花色值指標(biāo)，空心箭頭表示理化指標(biāo)；箭頭連線(xiàn)的長(zhǎng)短表示花色值與理化指標(biāo)間關(guān)聯(lián)度的大小，長(zhǎng)度越長(zhǎng)表示相關(guān)性越大，反之則相關(guān)性越小；兩個(gè)箭頭間的夾角表示花色值與理化指標(biāo)間相關(guān)性的大小，角度越小則相關(guān)性越大[25-26]。由圖7可知，花色值與各項(xiàng)理化指標(biāo)之間均顯著相關(guān)。其中，第Ⅰ軸（即RDA1，約束排序模型中的第1個(gè)約束軸）解釋了不同品種花色值的81.94%的變異信息，第Ⅱ軸（即RDA2，約束排序模型中的第2個(gè)約束軸）解釋了其16.57%的變異信息，前兩軸累計(jì)解釋量達(dá)到98.51%；第Ⅲ軸與第Ⅳ軸的解釋量之和僅為1.48%。因此，前兩軸可以很好地說(shuō)明長(zhǎng)春花花色值指數(shù)與各項(xiàng)理化指標(biāo)之間的關(guān)系，且其主要取決于第Ⅰ軸。為將理化因子變量對(duì)花色值的貢獻(xiàn)率進(jìn)行量化分析，同時(shí)進(jìn)行了蒙特卡羅檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5 可知，長(zhǎng)春花花色值與花瓣中的花色苷含量、總黃酮含量、上表皮細(xì)胞高寬比、Mn 元素含量、Ca 元素含量、花瓣厚度、細(xì)胞液pH 值與下表皮細(xì)胞高寬比之間均呈現(xiàn)出極顯著的相關(guān)性。其中，Mn 元素含量、Ca 元素含量、細(xì)胞液pH 值與RDA1 軸之間均呈極顯著正相關(guān)，而總花色苷含量、總黃酮含量、上表皮細(xì)胞高寬比、花瓣厚度及下表皮細(xì)胞高寬比與RDA1 軸之間均呈極顯著負(fù)相關(guān)。由表4 還可知，花色苷含量與總黃酮含量對(duì)于長(zhǎng)春花花色值的解釋率最高，分別為71.9%（F=40.9，P＜0.01）和70%（F=37.3，P＜0.01）。因此，花色苷與總黃酮含量的差異是長(zhǎng)春花不同花色形成的主要影響因子，而花瓣厚度、表皮細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞液pH 值及Mn、Ca 之值等作為輔助因子也都會(huì)影響其呈色。

表5 各項(xiàng)理化指標(biāo)的蒙德卡羅檢驗(yàn)結(jié)果Table 5 Monde Carlo test for physical and chemical factors

圖7 長(zhǎng)春花花色值與各項(xiàng)理化指標(biāo)之間關(guān)系的冗余分析結(jié)果Fig.7 Redundancy analysis of the relationship between folwer color value and physicochemical index of vinca

表4 長(zhǎng)春花花瓣中不同金屬元素含量與各種花色素含量間的相關(guān)系數(shù)Table 4 Correlation coefficients of different metal elements and anthocyanidins in vinca petals

3 討論與結(jié)論

花色的系統(tǒng)分類(lèi)及量化對(duì)于種質(zhì)資源的標(biāo)準(zhǔn)化評(píng)價(jià)和新花色品種的培育都十分重要。采用RHSCC 標(biāo)準(zhǔn)比色及CIELab 顏色系統(tǒng)可以對(duì)花瓣顏色進(jìn)行專(zhuān)業(yè)性描述及數(shù)量化表征處理，不同花色品種長(zhǎng)春花的花色值L*與a*值之間均呈現(xiàn)極顯著的負(fù)相關(guān)性，這與Akbari 等[27]和吳靜等[28]的研究結(jié)果均一致。紅色系和紅紫色系是長(zhǎng)春花品種資源的主要色系，因此，在對(duì)其花色進(jìn)行定量分析時(shí)，紅度a*值相較于黃度b*值的參考價(jià)值更大。

研究結(jié)果表明，長(zhǎng)春花白花品種的花瓣組織中無(wú)明顯色素細(xì)胞的分布，而在其他5個(gè)品種花瓣的上表皮細(xì)胞中均可明顯地觀察到花色素的大量積累，色素在細(xì)胞中的呈色類(lèi)型與花瓣表型幾近一致。這種色素分布方式與岳娟[29]對(duì)藍(lán)色鳶尾與紫色鳶尾的相關(guān)研究結(jié)果一致，而與葡萄風(fēng)信子、非洲菊等[1]花卉不同的是，長(zhǎng)春花花色素的分布更加集中，這種色素分布方式可能更有助于長(zhǎng)春花的呈色。研究中發(fā)現(xiàn)，花瓣厚度、上表皮細(xì)胞形態(tài)與長(zhǎng)春花花色值L*、a*值之間均有顯著的相關(guān)性，這與殷涵泰等[2]對(duì)秋石斛的研究結(jié)果相同。花瓣呈色過(guò)程中，光線(xiàn)由外部環(huán)境首先照射至花瓣表面，其在穿透色素層時(shí)一部分會(huì)被吸收，而另一部分則在海綿組織層中被反射折回，而后再次通過(guò)色素層最終進(jìn)入觀察者的眼睛中。在此過(guò)程中，花瓣厚度與表皮細(xì)胞的形態(tài)對(duì)光線(xiàn)均會(huì)造成影響，進(jìn)而影響花色的呈現(xiàn)。

研究中發(fā)現(xiàn)，6個(gè)長(zhǎng)春花品種的花瓣細(xì)胞液均呈偏酸性，且其細(xì)胞液pH 值與花色值a*值之間均存在顯著負(fù)相關(guān)性。細(xì)胞液酸堿性的強(qiáng)弱是花瓣呈色穩(wěn)定與否的重要影響因素。有關(guān)研究者[30-31]在對(duì)矮牽牛的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)花瓣細(xì)胞液呈偏酸性時(shí)，花色則趨向紅色；當(dāng)花瓣細(xì)胞液呈近中性或呈弱堿性時(shí)，花色則呈現(xiàn)藍(lán)色。細(xì)胞液pH 值是通過(guò)影響花色苷的穩(wěn)定性而影響花色呈現(xiàn)的。在強(qiáng)酸性環(huán)境中，花色苷的化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定，一般呈紅色；而在高pH 值的介質(zhì)環(huán)境中，其性質(zhì)趨于不穩(wěn)定，花色苷最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生紅移，花色偏藍(lán)；隨著環(huán)境堿性的繼續(xù)增強(qiáng)，花色苷結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，顏色發(fā)生褐變[32-33]。因此，長(zhǎng)春花花瓣細(xì)胞液的酸性環(huán)境有利于花色素苷的保存與積累，這使得長(zhǎng)春花花色的呈現(xiàn)更為穩(wěn)定。

長(zhǎng)春花花瓣中Ca、Mn 元素含量與花色值L*、a*值之間均顯著相關(guān)，隨著Ca、Mn 元素含量的升高，花瓣的亮度逐漸升高，而紅度值隨之逐漸降低，花色變淺。白新祥[34]在對(duì)菊花的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e3+、Mg2+、Al3+和Ca2+對(duì)紅色品種‘龍卷狂飆’的花青素均可起到增色作用，而對(duì)白色品種‘圣光白雪姬’的黃酮類(lèi)化合物卻沒(méi)有明顯的影響。Razieh 等[35]在對(duì)非洲菊的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e2+和Ca2+對(duì)黃色花非洲菊花色的影響均顯著，而Mg2+的影響并不顯著?；ò曛薪饘僭睾考捌浯嬖跔顟B(tài)對(duì)于不同物種、不同花色植物的影響復(fù)雜且各有差異。Goto 等[36]提出，金屬元素可以不同離子態(tài)形式與花色苷的發(fā)色團(tuán)或是黃酮醇核進(jìn)行分子堆疊，這種螯合機(jī)制抑制了花色素發(fā)色團(tuán)的水合作用，促進(jìn)其增色。Kazuaki 等[37]在對(duì)郁金香‘Murasakizuisho’的研究中發(fā)現(xiàn)，其花被底部顯示出與花被不同的顏色的原因是其Fe3+含量有差異。本研究對(duì)各種金屬元素僅進(jìn)行了定量分析，在長(zhǎng)春花花色苷呈色過(guò)程中，是否有Ca2+、Mn2+的參與及其是否存在特殊的絡(luò)合機(jī)制，仍需進(jìn)一步研究。

花色苷作為紅色和藍(lán)、紫色花形成的決定性色素，也是決定花瓣紅度值的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。長(zhǎng)春花花色苷含量與明度L*值和紅度a*值之間均存在顯著的量效關(guān)系。Wan 等[38]在對(duì)現(xiàn)代月季的研究中發(fā)現(xiàn)，黃酮類(lèi)物質(zhì)不僅其自身可呈色，而且可與花色苷產(chǎn)生共色效應(yīng)，從而加強(qiáng)花色苷的顯色。黃酮類(lèi)物質(zhì)是長(zhǎng)春花花色形成的重要輔助色素，6個(gè)品種的總黃酮含量均較高。此外，黃酮類(lèi)物質(zhì)作為花青素苷的直接前體物質(zhì)，研究中還發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)春花花瓣中總花色苷和總黃酮的含量之間呈現(xiàn)出極顯著的正相關(guān)關(guān)系。此前已有研究者[39]報(bào)道，花瓣中含有葉綠素。在6個(gè)花色品種長(zhǎng)春花的花瓣中也檢測(cè)到了葉綠素及類(lèi)胡蘿卜素，但二者僅表現(xiàn)為痕量存在，冗余分析結(jié)果表明，其對(duì)花瓣呈色的影響均較小。分析當(dāng)前相關(guān)研究的現(xiàn)狀，后續(xù)研究可以利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS）對(duì)花色苷及黃酮類(lèi)單體進(jìn)行鑒定及定量分析，從次生代謝水平上對(duì)長(zhǎng)春花花瓣中的差異化合物進(jìn)行表征，以揭示其色素代謝機(jī)理。

綜上所述，不同品種長(zhǎng)春花的花色差異不是單一指標(biāo)作用的結(jié)果，而是多項(xiàng)理化指標(biāo)共同作用、相互影響的結(jié)果。類(lèi)黃酮化合物作為長(zhǎng)春花花瓣呈色的化學(xué)基礎(chǔ)，其組分與含量的差異是決定長(zhǎng)春花不同花色形成的主要因素。其中，花色苷是影響長(zhǎng)春花花瓣著色的主要色素，黃酮類(lèi)作為輔助色素協(xié)同花色苷共同呈色。此外，花瓣厚度、表皮細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞液pH 值及Mn 或Ca 元素含量等指標(biāo)作為輔助因子協(xié)助參與了花瓣的呈色。該研究結(jié)果可為長(zhǎng)春花花色形成機(jī)制的研究及新花色品種的培育提供一定的理論依據(jù)。