呂東燦，侯婧霞，姜廣策，李演鑫，李程鵬，王志敏,

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，河南鄭州 450002；2.商丘市中醫(yī)院，河南商丘 476000）

我國是世界上最大的花生生產(chǎn)國，年產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量約40%，花生加工業(yè)規(guī)模居世界之首?；ㄉ鷼ふ蓟ㄉ偖a(chǎn)量的30%左右，年產(chǎn)量近500 萬噸，為花生殼的高附加值利用提供了豐富的資源[1]。但目前花生殼除少部分用于食用菌栽培、飼料加工、塑料填料和粘合劑等，大部分被燃燒或廢棄，造成了資源的浪費(fèi)和環(huán)境污染?；ㄉ鷼ぶ饕纱掷w維[2]、碳水化合物和蛋白質(zhì)等組成，還含有具有生理活性的黃酮類物質(zhì)[3]，其中以木犀草素含量最高[4-5]。黃酮化合物在臨床上具有止咳、祛痰、消炎、抗氧化、增強(qiáng)免疫功能、降血脂與膽固醇等藥理作用，在醫(yī)藥、保健品和食品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[6]?；ㄉ鷼S酮的提取能夠提高農(nóng)副產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)效益，減少環(huán)境污染，對花生資源的綜合利用具有重要意義。

黃酮類化合物難溶于水，易溶于有機(jī)溶劑如乙醇、乙醚和稀堿溶液中，從天然生物質(zhì)原料中提取黃酮的工藝有溶劑提取法[7]、超臨界提取法[8]、微波輔助提取法[9]、堿浸提法[10]、超聲輔助提取法[11]、液-液微萃取[12]、酶輔助提取法[13]和協(xié)同提取法[14]等。現(xiàn)存的溶劑提取、微波輔助提取等技術(shù)由于提取過程溫度較高，會部分抑制黃酮類的生物活性[15]；而超臨界提取、微波等適用于工業(yè)化生產(chǎn)的設(shè)備研發(fā)相對滯后，僅限于實(shí)驗(yàn)室研究[6]。球磨法近年來被應(yīng)用于材料合成[16]、改性[17]和膳食纖維的提取[18]等。機(jī)械輔助提取原理是高強(qiáng)度研磨促進(jìn)細(xì)胞壁的破裂，促進(jìn)有效成分的溶解[19]。Xie 等[20]的研究結(jié)果表明，球磨輔助提取獲得的竹葉黃酮有更強(qiáng)的親水性，竹葉黃酮的提取量為16 mg/g，證明了球磨對天然產(chǎn)物提取過程的促進(jìn)作用。He 等[15]研究了球磨輔助提取中草藥牛樟芝中的三萜類物質(zhì)。與乙醇回流提取相比，球磨輔助提取三萜類物質(zhì)的效率更高，相同濃度條件下的抗氧化活性也更高。Talekar 等[21]以水為溶劑采用球磨法成功地提取出石榴皮中的抗氧化物質(zhì)安石榴甙。球磨法提取過程能量消耗少、提取效率高，是一種非常有前景的天然產(chǎn)物提取方法。然而，目前尚未發(fā)現(xiàn)球磨法應(yīng)用于花生殼黃酮提取的研究。

基于此，本研究創(chuàng)新性地使用球磨法提取花生殼黃酮，以總黃酮提取量為考察指標(biāo)，通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化花生殼總黃酮的提取工藝，同時考察球磨提取花生殼總黃酮的抗氧化活性，并使用紫外光譜和液相高分辨質(zhì)譜分析花生殼黃酮中化合物。與其它方法相比，球磨法無需高溫高壓，生產(chǎn)成本較低；另一方面，低溫提取過程能夠保留黃酮類物質(zhì)的活性，獲得高效、抗氧化性能良好的黃酮，為提高花生殼的綜合價值以及生物質(zhì)資源的開發(fā)利用提供了理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生殼 品種為魯花9 號大殼花生，產(chǎn)地為河南省寧陵縣，10 月份采收，經(jīng)水洗、干燥、粉碎后，過100 目篩備用；蘆丁（>95%）、氫氧化鈉、無水乙醇、三氯化鋁、三氯化鐵、冰醋酸、無水醋酸鈉 均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；木犀草素（≥95%）分析標(biāo)準(zhǔn)品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鄰苯三酚 分析純，上海麥克林生化科技有限公司。

QM-3SP2 型行星式球磨機(jī) 南京大學(xué)儀器廠；ZLGJ-10 型真空冷凍干燥機(jī) 杭州瑞佳精密科學(xué)儀器有限公司；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；SB-600DTY 型超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；TU-1901 型雙光束紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；CS-700 型高速多功能粉碎機(jī) 永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司；AE124 型電子天平 舜宇光學(xué)科技有限公司；LC-20AT 高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 花生殼黃酮的提取工藝 稱取2.0 g 花生殼和60.0 g 球磨珠加入到瑪瑙球磨罐中，按照一定的料液比、乙醇濃度和球磨時間進(jìn)行球磨，提取液分離出球磨珠后，減壓蒸餾以收集濃縮液，于4000 r/min離心10 min，收集上清液用75%乙醇定容至100 mL，于4 °C 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 花生殼黃酮提取量的測定 參考趙星等[22]的方法對黃酮進(jìn)行定量。精確稱取20.00 mg 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，溶解于75%乙醇溶液并定容至100 mL，經(jīng)稀釋得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確量取0.5 mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品液于5 mL 刻度試管中，加入0.25 mL 0.1 mol/L 的氯化鋁溶液和0.5 mL pH5.5 的乙酸鈉-乙酸緩沖溶液，用75%乙醇定容至5.0 mL，搖勻靜置15 min，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后在420 nm 測定吸光度值。以蘆丁濃度c 為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ) 為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的曲線方程為A=0.00626c+0.02949，決定系數(shù)R2=0.9997。花生殼中黃酮提取量的測定公式為：

式中，Y 為花生殼黃酮的提取量（mg/g）；c 為樣品中黃酮的質(zhì)量濃度（mg/mL）；V 為樣品溶液總體積（mL）；m 為花生殼樣品的質(zhì)量（g）。

1.2.3 花生殼黃酮提取工藝單因素實(shí)驗(yàn) 影響花生殼黃酮提取量的主要因素有料液比、球磨時間和乙醇濃度。固定乙醇濃度為70%，球磨時間為60 min，料液比為1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 g/mL ；固定乙醇濃度為70%、料液比為1:20 g/mL，球磨時間為20、40、60、80、100 min；固定料液比為1:20 g/mL、球磨時間60 min，乙醇濃度為30%、45%、60%、75%、90%進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 花生殼黃酮提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以花生殼黃酮提取量（mg/g）為響應(yīng)面指標(biāo)設(shè)計Box-Behnken 試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)的因素和水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計Table 1 Factors and levels of response surface test

1.2.5 不同提取方法的比較 為探索球磨輔助方法的有效性，進(jìn)行了超聲提取[11]和加熱回流提取[23]對比實(shí)驗(yàn)，料液比、提取時間和乙醇濃度分別為1:25 g/mL、60 min 和60%，超聲輔助提取的功率為300 W，回流提取溫度為70 °C。

1.2.6 花生殼黃酮的抗氧化活性測定 在堿性條件下，鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生超氧自由基陰離子O2-·，在320 nm 下有較強(qiáng)的吸光度。測定花生殼黃酮對鄰苯三酚自氧化反應(yīng)產(chǎn)生超氧自由基的清除能力，配制3 mmol/L 的鄰苯三酚溶液，參照陳仕學(xué)等[24]和延莎等[25]的測定方法評價花生殼黃酮的抗氧化能力。

1.2.7 花生殼黃酮的結(jié)構(gòu)鑒定 分別取0.5 mL 170 μg/mL 的蘆丁標(biāo)液和花生殼黃酮提取液，加75%乙醇定容至10 mL，在200～800 nm 范圍掃描紫外光譜。

將花生殼黃酮提取液冷凍干燥處理，取樣用70%乙醇稀釋并經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，參照唐麗萍等[26]的方法進(jìn)行花生殼黃酮樣品定性測定，因花生殼黃酮主要成分為木犀草素[10]，采用木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對照分析，色譜柱為C18柱，流動相為甲醇-水-乙酸（50:50:1），檢測波長為254 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對黃酮提取量的影響 在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、球磨時間為60 min 條件下，考察料液比對黃酮提取量的影響，結(jié)果如圖1 所示?；ㄉ鷼S酮化合物提取量隨料液比的增大而增大，料液比從1:10 到1:20 大幅度增加，之后提取量增加幅度平緩。這是因?yàn)殡S著料液比增大，黃酮類化合物在乙醇中充分溶解出來。但乙醇溶液過多會導(dǎo)致除黃酮類化合物外其它溶于乙醇的物質(zhì)被提取[27]或影響傳質(zhì)速率[28]，因此，當(dāng)料液比大于1:30（g/mL）時，隨著料液比的增加，黃酮類化合物提取量增加不明顯。同時考慮成本問題，故選擇料液比1:20、1:30、1:40（g/mL）為響應(yīng)面分析的三個水平。

圖1 料液比對花生殼中黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of material to liquid ratio on the yield of flavonoids

2.1.2 球磨時間對黃酮提取量的影響 在料液比1:20 g/mL、乙醇濃度為70%，考察球磨時間對黃酮提取量的影響（圖2）。花生殼黃酮提取量隨球磨時間增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。球磨時間為60 min時的提取量接近20 min 時提取量的2 倍，增加幅度明顯；球磨時間在60～80 min 時提取量增幅較小，球磨時間繼續(xù)增加，花生殼黃酮提取量呈下降趨勢。球磨時間相對較短時，時間的延長可加強(qiáng)花生殼細(xì)胞的破碎程度，更易釋放出黃酮類化合物。但球磨時間過長時，黃酮類化合物可能受到破壞或發(fā)生氧化[27,29]，從而導(dǎo)致提取量降低。因此，選擇球磨時間為50、60、70 min 作為響應(yīng)面分析的三個水平。

圖2 球磨時間對花生殼中黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of ball milling time on the yield of flavonoids

2.1.3 乙醇濃度對黃酮提取量的影響 在料液比為1:20 g/mL、球磨時間為60 min 條件下，考察乙醇濃度對黃酮提取量的影響。由圖3 可知，花生殼黃酮類化合物提取量隨乙醇濃度的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，這與范金波等[30]的研究結(jié)果一致。乙醇濃度從45%到60%提取量有大幅度的增加，黃酮類化合物提取量在乙醇濃度為60%時達(dá)最高，為31.02 mg/g，這可能是因?yàn)辄S酮類化合物的極性與60%乙醇的極性相差較小，利于黃酮類物質(zhì)的溶出[24]；當(dāng)乙醇濃度超過60%，黃酮提取量反而下降，原因是乙醇濃度過高增大了體系的滲透壓，從而影響黃酮的提??；另一方面，乙醇濃度增加使得醇類和脂類等物質(zhì)的溶出[30]。由此選擇乙醇濃度為50%、60%和70%作為響應(yīng)面分析的三個水平。

圖3 乙醇濃度對花生殼中黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on the yield of flavonoids

2.2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計和結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果 以花生殼黃酮提取量為評價指標(biāo)的響應(yīng)值，選擇料液比（A）、球磨時間（B）、乙醇濃度（C）進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計，Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計和結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計和結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiment

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of analysis variance

2.2.2 回歸模型的建立及方差分析 以花生殼黃酮類化合物提取量為響應(yīng)值，通過Design-Expert 軟件進(jìn)行回歸分析，得二次多項(xiàng)回歸方成為：Y=31.55-0.3625A+0.1687B-0.2562C-0.0375AB+0.2375AC+0.4000BC-0.6233A2-0.6358B2-1.81C2。由表3 可知，模型P=0.0010<0.01，表明模型極顯著；失擬項(xiàng)P=0.5063>0.05，表明擬合方程可用于預(yù)測花生殼黃酮提取量的最佳工藝；方程的決定系數(shù)R2=0.9801>0.9，調(diào)整決定系數(shù)RAdj2=0.9444，表明此回歸方程可以解釋94.44%黃酮提取量的變化。此外，回歸方程中一次項(xiàng)料液比（A）和乙醇濃度（C）對花生殼黃酮提取量的影響顯著（P<0.05），球磨時間（B）的P值為0.1237，對花生殼黃酮提取量的影響不顯著；交互項(xiàng)中球磨時間（B）和乙醇濃度（C）的交互作用對花生殼黃酮提取量的影響顯著；二次項(xiàng)中A2、B2、C2的P<0.01，對花生殼黃酮提取量的影響極顯著。由F值判斷，料液比、球磨時間、乙醇濃度三個因素對花生殼黃酮提取量的影響程度為料液比（A）>乙醇濃度（C）>球磨時間（B）。

2.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)中交互項(xiàng)作用分析 為分析因素的交互影響作用，對交互項(xiàng)作響應(yīng)曲面圖和等高線圖。如圖4，響應(yīng)曲面越陡、弧度越大、等高線越密集、橢圓程度越大、紅點(diǎn)靠近內(nèi)圓的中心處，表明交互的兩因素作用越顯著[29]，對花生殼黃酮提取量的影響越大。其中，乙醇濃度和球磨時間的響應(yīng)曲面較陡，等高線較最為密集，且橢圓程度較大，紅點(diǎn)距離圓內(nèi)中心較近，說明兩因素間的交互作用顯著。

圖4 乙醇濃度和球磨時間對花生殼黃酮提取量的交互影響Fig.4 Response surface diagram of the effect between ethanol concentration and ball milling time on the yield of flavonoids

2.2.4 優(yōu)化工藝的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過Design-Expert 軟件設(shè)計響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化花生殼黃酮提取量的條件，結(jié)果顯示球磨輔助最佳提取工藝為料液比1:26.915 g/mL、球磨時間61.174 min、乙醇濃度59.220%，對應(yīng)的黃酮提取量為31.623 mg/g。為了實(shí)際操作可行，球磨輔助最佳工藝條件修正為料液比1:25 g/mL、球磨時間60 min、乙醇濃度60%。在修正工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證，得到提取量為（32.1±0.13）mg/g，預(yù)測值與實(shí)際值誤差為1.48%，表明該模型具有一定的可行性。

2.3 花生殼黃酮提取量對比

本研究中，球磨法提取花生殼黃酮的最大提取量為32.1 mg/g，高于超聲方法得到的黃酮提取量（23.2 mg/g），略低于回流提取法得到的黃酮提取量（32.9 mg/g）。與文獻(xiàn)報道相比，球磨法的黃酮提取量遠(yuǎn)高于微波輔助法的花生殼黃酮提取量（2.165 mg/g）[30]、鄭州大殼花生的黃酮提取量（19.6 mg/g）[31]和微波提取工藝黃酮提取量（29.18 mg/g）[32]，稍低于永州江永小殼型花生殼黃酮提取量（38.8 mg/g）[31]和乙醇回流提取的安徽花生殼黃酮提取量（39.8 mg/g）[23]。盡管花生殼品種和產(chǎn)地不同，會對花生殼黃酮提取量造成一定的影響。本研究中相對較高的黃酮提取量證明了球磨法的可行性。

2.4 花生殼黃酮抗氧化活性

球磨法得到的花生殼黃酮對超氧自由基清除能力如圖5 所示。可見，球磨提取出的花生殼黃酮對超氧自由基陰離子形成具有明顯的抑制作用。在一定范圍內(nèi)，花生殼黃酮對超氧自由基的清除能力隨花生殼黃酮濃度的增大而增大，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)呈正相關(guān)?；ㄉ鷼S酮能夠提供活潑的氫質(zhì)子與自由基形成穩(wěn)定的物質(zhì)，阻斷了鄰苯三酚的自氧化過程。當(dāng)花生殼黃酮濃度為0.012 mg/mL 時，對超氧自由基陰離子的清除率為53.53%。綜上可知，球磨法提取花生殼黃酮除在降低能耗和提高提取量方面上有不可忽視的優(yōu)勢外，還保留了目標(biāo)物的抗氧化活性，是一種具有工業(yè)前景的花生殼黃酮提取方法。

圖5 花生殼黃酮對超氧自由基的清除能力Fig.5 Superoxide free radical scavenging ability of flavonoids in peanut shell

2.5 花生殼黃酮官能團(tuán)分析

為探究花生殼提取物的官能團(tuán)結(jié)構(gòu)和驗(yàn)證以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)檢測其提取量的可靠性，進(jìn)行了蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和花生殼黃酮的紫外-可見光譜分析。如圖6 所示，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和花生殼黃酮的出峰位置基本一致。位于240～280 nm 和330～400 nm 的峰分別是由C6-C3-C6（兩個苯環(huán)通過三個碳原子而連接成的化合物）結(jié)構(gòu)中A 環(huán)取代基和B 環(huán)取代基引起[33]?；ㄉ鷼ぬ崛∥锏淖贤夤庾V圖中波長258 nm 處有小波動可能因?yàn)锳 環(huán)上羥基或甲氧基取代基導(dǎo)致或是提取物未純化引起，花生殼黃酮在344 nm 處的波峰向短波移動的可能是B 環(huán)上的羥基甲基化后轉(zhuǎn)化成甲氧基所引起的?？梢姡ㄉ鷼ぬ崛∥锎嬖邳S酮類化合物代表性的C6-C3-C6結(jié)構(gòu)。

圖6 花生殼黃酮和蘆丁的紫外-可見光譜圖Fig.6 UV-Vis spectra of flavonoids in peanut shell and rutin

木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品和花生殼黃酮樣品的HPLC圖譜如圖7 所示。木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間為9.03 min；花生殼黃酮樣品的液相色譜中9.06 min 位置的峰證明了木犀草素的存在，這與文獻(xiàn)報道的花生殼黃酮的主要成分為木犀草素一致[26,34]。其它位置較小的峰是由于雜質(zhì)存在引起的。

圖7 木犀草素和花生殼黃酮樣品的HPLC 圖Fig.7 HPLC of luteolin and flavonoids in peanut shell

3 結(jié)論與展望

球磨輔助乙醇提取花生殼中黃酮的提取過程中，在一定范圍內(nèi)，料液比對花生殼黃酮的提取量影響最大，其次是乙醇濃度，球磨時間對黃酮提取量的影響最小。響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果表明，球磨輔助乙醇提取花生殼黃酮的最佳工藝為料液比1:25（g/mL），球磨時間60 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，總黃酮提取量為32.1 mg/g。花生殼黃酮對超氧自由基陰離子具有較強(qiáng)的抗氧化能力，隨著花生殼黃酮濃度的增加，抗氧化能力隨之增強(qiáng)。黃酮樣品經(jīng)鑒定，其主要成分為木犀草素。球磨輔助提取具有操作簡單、條件溫和、成本較低和效率較高等優(yōu)點(diǎn)，是一種非常有前景的花生殼黃酮提取方法，能夠?yàn)榛ㄉ鷼さ母吒郊又道锰峁┘夹g(shù)支持。