王丹丹，王 星，周翹楚

(遼東學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，遼寧 丹東 118000)

紅光熊蜂(BombusignitesSmith)是一類重要的傳粉昆蟲，具嚼吸式口器，吻喙長，接觸植物柱頭頻率高，除大顎可用作咀嚼或塑蠟外，中舌、小顎外葉和下唇須合并構(gòu)成復(fù)雜的食物管吸食花蜜。紅光熊蜂為典型的全變態(tài)社會性昆蟲，具狹溫性[1-2]，生活溫度10～30 ℃，最適溫度25 ℃。低溫脅迫會影響其發(fā)育歷期，以及羽化后成蜂的死亡率、行為、外部形態(tài)和理化特性等，如翅脈發(fā)育、神經(jīng)突觸數(shù)量等，主要表現(xiàn)在糖、脂類、氨基酸、嘌呤和硫胺素等代謝通路上相關(guān)基因的富集化差異表達(dá)[3]。

糖原合成酶(glycogen synthase，GS)為胰島素作用的關(guān)鍵酶，也為糖原生物合成過程中的限速酶，磷酸化GS失活，糖原被分解；去磷酸化GS被激活，糖原合成[4]。Akt由Akt1、Akt2和Akt3共3個亞型組成，序列同源率達(dá)85%，3個亞型生理功能各不相同，亦有重疊。其中Akt1缺失可導(dǎo)致胎盤營養(yǎng)缺失、生長發(fā)育延遲或體質(zhì)量下降；Akt2位于胰島素效應(yīng)組織中，參與葡萄糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，Akt2缺失可導(dǎo)致胰島素分泌或血糖異常；Akt3缺失可誘發(fā)大腦萎縮。Akt約有100 余種底物，參與機體多種信號通路，如通過調(diào)控FoxO亞家族蛋白或CREB等轉(zhuǎn)錄因子[5]，調(diào)控新陳代謝與生長發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)；通過抑制Bcl-2家族的Bax、Bad等成員達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的目的[6]；通過調(diào)控Mtor參與蛋白質(zhì)合成、抗細(xì)胞調(diào)亡與保護神經(jīng)細(xì)胞的功能[7]；亦可通過磷酸化糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK3β)，調(diào)控糖代謝、細(xì)胞生長、增殖以及細(xì)胞調(diào)亡等過程[8]?；罨腁kt2通過磷酸化多種酶及轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能，如Akt磷酸化GSK3β而抑制其活性，促進葡萄糖代謝、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期；如GSK-3β為Akt2的底物，調(diào)控細(xì)胞的凋亡過程，即胰島素激活A(yù)kt2磷酸化GSK3β，使GSK3β失活，GS去磷酸化而被激活，糖原合成，反之糖原合成被抑制[9]。當(dāng)紅光熊蜂機體葡萄糖含量升高，胰島素通過激活PI3K/Akt通路刺激組織攝取葡萄糖，抑制GSK3β激酶活性，使GS去磷酸化，合成糖原，降低血糖含量，維持個體穩(wěn)態(tài)[10]。

溫度在動物生存、繁殖、行為等方面具有深遠(yuǎn)的影響，目前為止，尚無研究從分子水平探討紅光熊蜂適應(yīng)低溫脅迫的防御機制。為了深入研究低溫脅迫對紅光熊蜂相關(guān)糖代謝基因的差異表達(dá)趨勢，本研究采用RT-PCR與RACE技術(shù)克隆紅光熊蜂GS和Akt2基因全長cDNA，采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析不同溫度和不同時間低溫脅迫下，GS和Akt2基因的動態(tài)表達(dá)規(guī)律，旨在探究紅光熊蜂在低溫環(huán)境下的防御機制，糖代謝通路特點及高糖狀態(tài)的形成機制，為培育抗寒紅光熊蜂奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取繁育旺盛、18日齡健康無病的紅光熊蜂(BombusignitesSmith)工蜂200只放入無光照、溫度25 ℃，相對濕度(relative humidity，RH)55%的恒溫恒濕箱(型號：HPX-160BS-Ⅱ)中培育5 d。將培養(yǎng)后的紅光熊蜂工蜂二等分，一部分分別置于RH 55%，溫度25，18，15，10，8，和5 ℃的低溫環(huán)境中培養(yǎng)2 d后取材，另一部分在RH 55%，8 ℃低溫下脅迫4，8，12，16，24，48和72 h后取材，對照組處理為RH 55%，8 ℃培養(yǎng)0 h，每個處理采用3只紅光熊蜂工蜂，3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 總RNA提取與cDNA第一鏈的合成

將1.1節(jié)中不同低溫(5～25 ℃)培養(yǎng)以及8 ℃低溫脅迫不同時間的工蜂分別放入液氮研磨，按照Qiagen通用總RNA提取試劑盒(RNeasy Plus Universal Mini Kit)抽提總RNA，120 V、1%瓊脂糖電泳檢測RNA完整性；按照試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，4 ℃保存?zhèn)溆肹11-12]，每處理取3只工蜂，3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 紅光熊蜂GS、Akt2基因全長克隆

以意大利蜜蜂(GenBank登錄號:XM_001120954.5)GS基因序列設(shè)計引物(表1)，以1.2節(jié)中RH 55%，25 ℃培養(yǎng)的紅光熊蜂工蜂RNA反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA第一鏈為模板，克隆紅光熊蜂GS基因核心序列。PCR反應(yīng)體系(20 μL)： cDNA 1 μL， LA緩沖液 (10×) 2.0 μL，dNTP Mix 3.0 μL，20 μmol/L上下游引物各1 μL，5 U/μL LA聚合酶混合液0.5 μL，滅菌ddH2O加至20 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，59 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物回收送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表1 本研究所用引物信息

以GS核心片段設(shè)計特異性引物，與GS 3’CDS引物按照SMARTerTMRACE cDNA Amplication試劑盒說明書克隆紅光熊蜂GS基因3’端，反應(yīng)條件同上；紅光熊蜂Akt2基因全長克隆步驟同GS基因。

1.4 紅光熊蜂GS、Akt2全長基因生物信息學(xué)分析

根據(jù)GS、Akt2基因全長序列，采用ORF Finder預(yù)測基因開放閱讀框；Prot Param在線軟件分析其理化特性；Prot Scale分析氨基酸序列的疏水性和親水性；SOPMA在線軟件預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)[13]；GenBank數(shù)據(jù)庫Blastp程序預(yù)測氨基酸保守域及同源性分析；采用TBtools軟件對GS、Akt2基因進行染色體定位。

1.5 紅光熊蜂GS、Akt2互作蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析

為驗證紅光熊蜂GS、Akt2蛋白的生理作用及其代謝信號通路，采用在線軟件String(http://string-db.org/)構(gòu)建GS、Akt2蛋白的互作蛋白網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置高可信度值為0.7。

1.6 紅光熊蜂GS、Akt2基因的低溫脅迫表達(dá)分析

1.6.1 不同溫度脅迫下GS、Akt2基因表達(dá)水平分析 采用Primer Premier 6設(shè)計特異性引物GS-qF/R與Akt2-qF/R，以GAPDHF/R為內(nèi)參引物(表1)，采用RTQ-960 Pro實時熒光定量PCR儀，按照TaKaRa試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMⅠ說明書進行實時熒光定量PCR，分析GS、Akt2基因在25，18，15，10，8和5 ℃培養(yǎng)下表達(dá)水平的差異。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：cDNA模板1.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.5 μL，SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，ddH2O加至20 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性10 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。每處理取3只工蜂，3次生物學(xué)重復(fù)。

1.6.2 低溫脅迫不同時間GS、Akt2基因表達(dá)水平分析 采用Primer Premier 6設(shè)計特異性引物GS-qF/R與Akt2-qF/R，以GAPDHF/R為內(nèi)參引物(表1)，采用RTQ-960 Pro實時熒光定量PCR儀，按照TaKaRa試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMⅠ說明書進行實時熒光定量PCR，分析GS、Akt2基因在8 ℃培養(yǎng)不同時間(0，4，8，12，16，24，48和72 h)的表達(dá)水平差異，探究紅光熊蜂低于生活溫度不出蜂房工作時，其機體對低溫刺激的反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同1.6.1節(jié)。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2010統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù)并制圖，利用SPSS 21.0軟件進行基因相對表達(dá)量統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅光熊蜂GS、Akt2基因克隆

以GS-cF/R為引物RT-PCR擴增獲得892 bp基因片段，經(jīng)Blastp比對表明該片段編碼氨基酸與較多昆蟲GS基因均具較高的同源性(85%～98%)，可見，擴增得到的基因片段為紅光熊蜂GS基因核心序列?；贕S基因核心序列，進行5’-RACE與3’-RACE PCR擴增，分別得到378和197 bp的明亮條帶，采用SeqMan程序?qū)?’-RACE、核心序列與3’-RACE 3段DNA序列進行拼接，獲得長度為1 417 bp DNA片段，即GS基因(圖1-A)。

以Akt2-cF/R為引物RT-PCR擴增獲得674 bp基因片段，經(jīng)Blastp比對表明該片段編碼氨基酸與較多昆蟲Akt2基因均具較高的同源性(92%～96%)，可見，擴增得到的基因片段為紅光熊蜂Akt2基因核心序列?；贏kt2基因核心序列，進行5’-RACE與3’-RACE PCR擴增，分別得到168和488 bp的明亮條帶，采用SeqMan程序?qū)?’-RACE、核心序列與3’-RACE 3段DNA序列進行拼接，獲得長度為926 bp DNA片段，即Akt2基因(圖1-B)。

A.GS基因克隆;B.Akt2基因克隆

2.2 紅光熊蜂GS、Akt2基因序列分析

紅光熊蜂GS基因全長為1 417 bp，包含一個1 020 bp的完整開放閱讀框(ORF)，編碼339個氨基酸，其5’-UTR 291 bp，3’-UTR 106 bp(圖2)。

Prot Param分析表明，GS蛋白分子式為C1594H2530N530O494S9，分子相對質(zhì)量為37.31 ku，等電點(pI)為8.31，脂肪系數(shù)61.56。Prot Scale分析表明GS蛋白為親水性蛋白；PSORT Prediction亞細(xì)胞定位該蛋白可能存在于線粒體中；SOPMA預(yù)測GS蛋白二級結(jié)構(gòu)包括無規(guī)則卷曲(51.92%)、α-螺旋(23.89%)、延伸鏈(12.09%)和β-轉(zhuǎn)角(12.09%)；NetPhos 3.1預(yù)測其具有12個Ser、6個Thr、2個Tyr，可能成為GS蛋白激酶磷酸化位點。

紅光熊蜂Akt2基因全長為926 bp，ORF為837 bp，編碼278個氨基酸，其5’-UTR 48 bp， 3’-UTR 57 bp(圖3)。Prot Param 分析表明，Akt2蛋白質(zhì)分子式為C1427H2227N369O423S13，分子相對質(zhì)量為31.74 ku，等電點(pI)為5.29，脂肪系數(shù)89.42；Prot Scale分析表明Akt2蛋白為親水性蛋白。PSORT Prediction亞細(xì)胞定位該蛋白可能存在于細(xì)胞核或線粒體中；SOPMA預(yù)測Akt2蛋白二級結(jié)構(gòu)包括無規(guī)則卷曲(33.45%)、α-螺旋(34.89%)、延伸鏈(23.74%)和β-轉(zhuǎn)角(7.91%)；NetPhos 3.1預(yù)測其具有7個Ser、8個Thr、5個Tyr，可能成為Akt2蛋白激酶磷酸化位點。

SignalP4.1 在線預(yù)測紅光熊蜂GS、Akt2蛋白均不具信號肽序列，故二者均為非分泌蛋白。染色體定位結(jié)果顯示，GS、Akt2基因分別分布在紅光熊蜂1H和3H號染色體上。

2.3 紅光熊蜂GS、Akt2互作蛋白網(wǎng)絡(luò)分析

為驗證紅光熊蜂GS、Akt2蛋白的生理作用，采用在線軟件String(http://string-db.org/)搜索互作蛋白網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，結(jié)果顯示與GS、Akt2互作的蛋白質(zhì)共有9個(圖4)，即：糖原合成酶激酶-3β、叉頭轉(zhuǎn)錄因子、絲/蘇氨酸蛋白激酶、4,5-二磷酸磷脂酰肌醇3激酶、磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1、促分裂素原活化蛋白激酶5、TBC1結(jié)構(gòu)域家族蛋白成員4等，這些蛋白均為PI3K/Akt/Mtor、PI3K/Akt/Mtor以及PI3K/Akt/Foxo信號通路的重要蛋白酶類，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運等多種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)。GS直接參與糖原合成與分解過程，Akt2是胰島素信號通路中重要的蛋白激酶，調(diào)控糖代謝過程，當(dāng)個體處于低溫刺激時可抑制細(xì)胞凋亡，調(diào)控機體累積大量抗凍保護物質(zhì)葡萄糖以抵御低溫?fù)p傷，可見，GS、Akt2是紅光熊蜂低溫脅迫糖代謝過程中的關(guān)鍵酶。

Gsk3b.糖原合成酶激酶-3β；Gs.糖原合酶；Foxo3.叉頭轉(zhuǎn)錄因子3；Foxo1.叉頭轉(zhuǎn)錄因子1；Mtor.絲/蘇氨酸蛋白激酶；Tsc2.抑癌基因2；Pik3ca.4,5-二磷酸磷脂酰肌醇3激酶；Pdpk1.磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1；Map3k5.促分裂素原活化蛋白激酶5；Tbc1d4.TBC1結(jié)構(gòu)域家族蛋白成員4

2.4 紅光熊蜂GS、Akt2基因低溫脅迫表達(dá)分析

2.4.1 不同溫度脅迫下GS、Akt2基因的表達(dá)水平 不同溫度脅迫下紅光熊蜂GS、Akt2基因的相對表達(dá)量如圖5所示。

由圖5可知，GS基因的相對表達(dá)量隨溫度降低呈下降趨勢，15 ℃時表達(dá)量下降顯著，5 ℃時表達(dá)量是25 ℃的16.1 %；而紅光熊蜂Akt2基因表達(dá)水平隨溫度降低呈明顯上升趨勢，15 ℃時Akt2基因的表達(dá)量顯著升高，5 ℃達(dá)到峰值，約為25 ℃時表達(dá)量的3.7倍，推測紅光熊蜂為適應(yīng)低溫環(huán)境，機體通過糖原合成過程中的關(guān)鍵限速酶GS限制糖原的合成，使機體呈高糖狀態(tài)，這種高糖狀態(tài)源自于糖原降解，即通過抑制GS活性，促進GP活性，導(dǎo)致體內(nèi)葡萄糖積累，因此，低溫環(huán)境下GS表達(dá)一直處于較低水平，說明低溫條件下紅光熊蜂機體可產(chǎn)生大量葡萄糖作為抗凍物質(zhì)，保護自身免受低溫?fù)p傷，對紅光熊蜂抵御低溫環(huán)境起重要作用。

2.4.2 低溫脅迫不同時間GS、Akt2基因的表達(dá)水平 紅光熊蜂生活溫度為10～30 ℃，溫度低于10 ℃便不出蜂房工作，本研究探究低于生活溫度時，紅光熊蜂機體對低溫刺激的反應(yīng)。圖6為8 ℃低溫處理不同時間紅光熊蜂GS、Akt2基因的相對表達(dá)量。由圖6可知，與對照(0 h)相比，8 ℃脅迫8 h 時GS基因的相對表達(dá)量顯著下降；脅迫12 h相對表達(dá)量最低，約為對照組的11%；脅迫12 h后GS相對表達(dá)量隨脅迫時間的增加有所回升，24 h后基本平穩(wěn)，表明低溫脅迫下紅光熊蜂GS基因相對表達(dá)量隨脅迫時間延長呈先顯著下降后緩慢上升逐漸趨于平穩(wěn)的趨勢。8 ℃低溫脅迫下，紅光熊蜂Akt2基因表達(dá)水平隨脅迫時間延長呈先上升后下降的趨勢。與對照(0 h)相比，脅迫4 h時Akt2基因相對表達(dá)量顯著升高，12 h時達(dá)到峰值，約為對照組的1.7倍，隨后其相對表達(dá)量隨脅迫時間延長緩慢下降，脅迫72 h時基本恢復(fù)正常水平，說明在遇到低溫刺激時，紅光熊蜂機體快速做出應(yīng)答反應(yīng)，但可通過自身調(diào)節(jié)恢復(fù)且維持在一個穩(wěn)定的狀態(tài)。

圖6 低溫脅迫不同時間紅光熊蜂GS、Akt2基因表達(dá)量變化

3 討 論

3.1 低溫脅迫對紅光熊蜂的危害

紅光熊蜂是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的傳粉昆蟲，其傳粉能力遠(yuǎn)超過蜜蜂，所以熊蜂采蜜是農(nóng)業(yè)增產(chǎn)的重要渠道[14]。蜂群耐低溫脅迫或安全越冬對第二年熊蜂的生產(chǎn)、作物產(chǎn)量至關(guān)重要。低溫冷害一直作為嚴(yán)峻的非生物逆境脅迫影響著紅光熊蜂的壽命，溫度低于10 ℃紅光熊蜂便不出蜂房工作，所以，了解紅光熊蜂耐低溫脅迫的生理機制及生存策略對保護和培育抗寒蜂種至關(guān)重要[15]。低溫環(huán)境對昆蟲身體各器官及其新陳代謝水平影響較大，如低溫脅迫下，昆蟲機體新陳代謝水平顯著下降，營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與利用、缺氧缺血、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜流動性均會發(fā)生改變，昆蟲則通過減慢代謝水平來降低能量的消耗，也可通過提高或降低糖代謝相關(guān)基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)量(如GS、Akt基因)來抵御低溫脅迫[16]。低溫脅迫時體液結(jié)冰，器官遭物理壓迫，而自由水是維持生命正常新陳代謝不可或缺的物質(zhì)，當(dāng)紅光熊蜂體溫低于體液的冰點溫度時，滲透壓降低，致使細(xì)胞內(nèi)液外流，自由水含量顯著下降，細(xì)胞發(fā)生皺縮，細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度升高，新陳代謝紊亂，機體處于低代謝缺氧狀態(tài)，造成氧化損傷[17-18]，可見，細(xì)胞產(chǎn)生冰晶不但損傷機體細(xì)胞，形成氧化損傷，亦可產(chǎn)生溶質(zhì)中毒現(xiàn)象威脅紅光熊蜂的生存。研究表明，昆蟲在低溫環(huán)境下能夠自我提高體內(nèi)結(jié)合水的含量，同時降低自由水含量，以避免體液結(jié)冰，而紅光熊蜂體內(nèi)葡萄糖、游離水含量的增加可提高過冷卻點溫度。過冷卻現(xiàn)象是低溫狀態(tài)下紅光熊蜂體內(nèi)抗寒物質(zhì)所表現(xiàn)出來的一種抵御低溫環(huán)境的生理現(xiàn)象，過冷卻點越低，表明昆蟲的抗寒能力越強[19]。

3.2 紅光熊蜂抵御低溫的分子機制

糖原是動物體內(nèi)儲存葡萄糖的一種形式，由多個葡萄糖組成的生物大分子，低溫脅迫下，糖原分解葡萄糖來維持血液中的葡萄糖含量，為機體新陳代謝提供能量，而機體內(nèi)過多的葡萄糖按能量代謝方式轉(zhuǎn)化為糖原儲存在紅光熊蜂體內(nèi)，以確保在逆境脅迫下維持其機體正常的生命活動[20-21]。本研究分析了8 ℃低溫脅迫下紅光熊蜂GS基因的表達(dá)量，結(jié)果表明，脅迫4 h 時GS基因的相對表達(dá)量顯著下降，12 h相對表達(dá)量最低，約為對照組的11%，而后GS相對表達(dá)量隨脅迫時間的延長有所回升，24 h后基本平穩(wěn)，推測紅光熊蜂為適應(yīng)低溫脅迫，機體通過降低糖原合成過程中的關(guān)鍵限速酶GS表達(dá)水平來抑制糖原合成，使機體產(chǎn)生大量葡萄糖提供能量，以提高過冷卻點溫度抵御低溫，葡萄糖的產(chǎn)生來源于機體糖原降解，即通過抑制GS活性，促進糖原磷酸酶(glycogen phosphorylase,GP)的活性，導(dǎo)致體內(nèi)葡萄糖大量積累，體內(nèi)葡萄糖含量與溫度降低呈正相關(guān)，即溫度越低體內(nèi)葡萄糖含量越高[22-23]。低溫脅迫下，紅光熊蜂Akt2基因相對表達(dá)量呈先上升后降低的趨勢，脅迫4 h時Akt2基因的相對表達(dá)量顯著升高，12 h達(dá)到峰值，約為對照的1.7倍，而后通過自身調(diào)節(jié)，其相對表達(dá)量隨脅迫時間延長緩慢下降，72 h基本恢復(fù)正常水平。Akt2屬于胰島素信號通路中的重要激酶，低溫脅迫下，Akt通過調(diào)節(jié)下游分子GSK3β和GS活性，降解和轉(zhuǎn)化糖原產(chǎn)生大量葡萄糖來維持機體血糖平衡抵御低溫[24]。按照PI3K-Akt信號通路原理，Akt2磷酸化GSK3β后，抑制了GSK3β的活性，而促進GS活性，GS基因的表達(dá)量應(yīng)該隨著Akt2上調(diào)，但事實GS基因的表達(dá)量卻是下調(diào)，說明其不僅僅是調(diào)控糖代謝，也可通過PI3K/Akt/Mtor、PI3K/Akt/Mtor以及PI3K/Akt/Foxo等信號通路，調(diào)節(jié)Mtor參與抗凍蛋白質(zhì)合成、調(diào)控Bad等，進而達(dá)到調(diào)控細(xì)胞調(diào)亡或通過調(diào)節(jié)FoxO亞家族調(diào)控能量代謝等過程，如PI3K- AKT - FoxO1信號通路中FoxO1作為機體調(diào)控代謝的重要因子，受胰島素負(fù)調(diào)控，胰島素缺乏時，F(xiàn)oxO1集中于細(xì)胞核，啟動靶基因胰島素反應(yīng)元件(insulin response element,IRE)的表達(dá)促進糖異生；胰島素充足時，F(xiàn)oxO1激活PI3K-AKT通路，導(dǎo)致下游分子AKT磷酸化活化，進而使FoxO1磷酸化從細(xì)胞核易位到細(xì)胞質(zhì)失去活性[25]。與Xu等[26]研究結(jié)果一致，即在0 ℃低溫脅迫下，中華蜜蜂(Apisceranacerana)成蜂(20日齡)與生態(tài)環(huán)境相關(guān)的Ca2+信號通路、FoxO信號通路、Hippo信號通路，及其絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、熱激蛋白以及鋅指蛋白等均存在顯著的差異表達(dá)現(xiàn)象。可見，在低溫脅迫過程中Akt2參與多種信號通路行使多種功能，以達(dá)到紅光熊蜂抵抗低溫傷害的目的。此外，紅光熊蜂GS、Akt2基因在15 ℃時表達(dá)量波動較大，相對其體溫波動也很大，推測15 ℃是紅光熊蜂體溫調(diào)節(jié)的臨界值，可能與紅光熊蜂的能量代謝密切相關(guān)。