匡秀華，王秋珍,2,樊克鋒，張夢(mèng)涵，張春輝

(1 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450000；2 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100000)

植物精油又稱揮發(fā)油、香精油，是芳香植物次生代謝產(chǎn)物。植物精油為油狀液體，不溶于水，有香味，相對(duì)分子量小、且具有一定的生物活性[1]，由100種以上的成分構(gòu)成。一般而言，植物精油含有醇類、醛類、酸類、酚類、丙酮類、萜烯類[2]，主要有提供細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)、凈化空氣和殺菌、天然防腐、提高免疫等功能[3]。在畜禽生產(chǎn)領(lǐng)域，植物精油不僅可以減少畜禽用飼料營(yíng)養(yǎng)成分損失，增強(qiáng)畜禽體內(nèi)消化酶活性及機(jī)體免疫力，而且還可以增強(qiáng)畜禽生產(chǎn)性能、抗應(yīng)激能力，降低畜禽生產(chǎn)成本損耗[4]。

茶樹(shù)精油(tea tree oil,TTO)是從互葉白千層的新鮮枝葉中提取出來(lái)的一種無(wú)色至淡黃色的植物精油。研究表明，茶樹(shù)精油具有抗細(xì)菌和真菌[5-7]、抗病毒[7-9]、抗炎[10-11]、抗腫瘤[11]、抗氧化[12]和殺蟲(chóng)作用[13-15]，其抑菌作用強(qiáng)于薰衣草[16]。國(guó)內(nèi)外對(duì)茶樹(shù)精油的應(yīng)用多集中在食品添加劑和洗護(hù)用品領(lǐng)域[10]，對(duì)其在動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中對(duì)細(xì)菌的抗菌及藥用機(jī)理研究甚少。

沙門氏菌(Salmonella)屬腸桿菌科，是一種常見(jiàn)的食源性致病菌和人畜共患病病原菌，能夠引起傷寒、急性腸胃炎、敗血癥等多種疾病?？股厥桥R床治療各種細(xì)菌感染性疾病的常用藥物，在畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中不合理使用抗生素不僅會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性，而且還存在食品安全和公共衛(wèi)生安全風(fēng)險(xiǎn)。2020年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部的減抗限抗政策，使中獸藥的應(yīng)用和研究成為熱點(diǎn)。本研究對(duì)茶樹(shù)精油的抗沙門氏菌SH17活性進(jìn)行初步分析，為茶樹(shù)精油作為藥物開(kāi)發(fā)與推廣應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 本試驗(yàn)所用的沙門氏菌SH17，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)藥理教研室提供。通過(guò)PCR擴(kuò)增與測(cè)序分析、血清學(xué)鑒定、耐藥因子與毒力因子檢測(cè)，結(jié)果表明沙門氏菌SH17為鼠傷寒沙門氏菌(Typhimurium)，攜帶TEM、DHA、gyrA、gyrB、parC、parE、oqxA、oqxB耐藥因子，含有invH、fimA、spvB毒力因子。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC，T8170B，Beijing Solarbio Science)，甘油(20190112，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)，總蛋白定量(考馬斯亮藍(lán)法，A045-2-2，南京建成生物工程研究所)，堿性磷酸酶(AKP)檢測(cè)試劑盒(A059-2-2，南京建成生物工程研究所)，磷酸二氫鉀(20191107，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，磷酸氫二鈉 (20191107，天津市風(fēng)船化學(xué)科技有限公司)，氫氧化鈉 (20191009，天津市化學(xué)試劑三廠)，二甲基亞砜(DMSO,20191008，天津市大茂化學(xué)試劑廠)。Mueller-Hinton瓊脂(2017114，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)，Mueller-Hinton肉湯(20180828，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3 試驗(yàn)藥物 茶樹(shù)精油，(密度0.906，純度98%，吉安林業(yè)科學(xué)研究所)，恩諾沙星(批號(hào)E0786，純度>98%，TCI)，氟苯尼考(批號(hào)F0811，純度>98%，TCI)，慶大霉素(批號(hào)G0383，純度≥99%，TCI)，阿莫西林(批號(hào)A129660，純度≥98%，阿拉丁)，克拉維酸鉀(批號(hào)C10190946，純度50%，麥克林)，磺胺異噁唑(批號(hào)U0098，純度>98%，TCI)，甲氧芐啶(批號(hào)C10404816，純度98%，麥克林)，頭孢噻呋(純度≥98%，河南牧翔動(dòng)物藥業(yè)有限公司)，四環(huán)素(批號(hào)824G022，純度≥98%，Solarbio)。

茶樹(shù)精油的配制：將茶樹(shù)精油與DMSO按照1∶19體積比混合時(shí)，DMSO對(duì)菌液的生長(zhǎng)狀況無(wú)影響[12]。取茶樹(shù)精油溶于DMSO，質(zhì)量濃度為843 500 μg/mL。

按照CLSI方法[17]，將恩諾沙星、氟苯尼考、慶大霉素、四環(huán)素、頭孢噻呋、阿莫西林均配制成質(zhì)量濃度為5 120 μg/mL備用；磺胺異噁唑/甲氧芐啶配制成質(zhì)量濃度為48 640/2 560 μg/mL備用；阿莫西林/克拉維酸配制成質(zhì)量濃度為5 120/2 560 μg/mL備用。

1.1.4 試驗(yàn)設(shè)備 生化培養(yǎng)箱(LDZX-75KBS)，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；多功能酶標(biāo)儀(Varioskan Thermo Scientific)、小型高速離心機(jī)(5K24R Eppendof)、電導(dǎo)儀(DDS-12DW)，上海般特儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌菌液的制備 將沙門氏菌SH17接種至Mueller-Hinton肉湯中，37 ℃下過(guò)夜培養(yǎng)，用新鮮Mueller-Hinton肉湯將其濁度調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠁挝?，再?∶100繼續(xù)稀釋，稀釋后的菌液備用。

1.2.2 藥物敏感性試驗(yàn) 用微量二倍肉湯稀釋法進(jìn)行。在96孔中先加入沙門氏菌SH17菌液260 μL，再分別加入茶樹(shù)精油或質(zhì)量濃度不同的抗生素30 μL，然后再加入2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)10 μL，混合均勻，37 ℃培養(yǎng)18～20 h。將大腸桿菌ATCC25922作為陽(yáng)性對(duì)照，不含任何藥物和茶樹(shù)精油的沙門氏菌SH17作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)參考CLSL M11-A7[17]，茶樹(shù)精油最小抑菌濃度(MIC)的判定以TTC變色為準(zhǔn)。

1.2.3 茶樹(shù)精油最小殺菌濃度(MBC)測(cè)定 根據(jù)MIC的測(cè)定結(jié)果，以不含任何抗生素和茶樹(shù)精油的沙門氏菌SH17作為對(duì)照，取無(wú)菌生長(zhǎng)的茶樹(shù)精油質(zhì)量濃度分別為10 540，21 090，42 180，84 350 μg/mL的4個(gè)孔里面的液體100 μL涂布在Mueller-Hinton瓊脂板上，37 ℃培養(yǎng)24 h。 以在Mueller-Hinton瓊脂板上細(xì)菌生長(zhǎng)減少99%所對(duì)應(yīng)的茶樹(shù)精油質(zhì)量濃度為MBC值[18]。

1.2.4 茶樹(shù)精油對(duì)沙門氏菌SH17耐藥性的影響 (1)含不同質(zhì)量濃度茶樹(shù)精油沙門氏菌SH17菌液的準(zhǔn)備。用Mueller-Hinton肉湯將過(guò)夜復(fù)蘇的沙門氏菌SH17菌液濁度調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠁挝唬僖?∶100的比例用Mueller-Hinton肉湯將菌液稀釋，備用。

以藥敏試驗(yàn)的結(jié)果為基礎(chǔ)，取上述菌液于試管中，再分別向試管中加入茶樹(shù)精油，使其質(zhì)量濃度分別為0，2 635，5 270，10 540 μg/mL。然后于37 ℃搖床中160 r/min振蕩培養(yǎng)，分別在振蕩培養(yǎng)0，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8 h取樣。

(2)茶樹(shù)精油對(duì)沙門氏菌SH17生長(zhǎng)曲線的影響。參照文獻(xiàn)[19]的方法，用1.2.4(1)中制備的菌液，在600 nm處測(cè)定細(xì)菌的吸光度(OD)，以不加藥的沙門氏菌SH17菌液作為對(duì)照，繪制沙門氏菌SH17的生長(zhǎng)曲線。

(3)茶樹(shù)精油對(duì)沙門氏菌SH17細(xì)胞壁的影響。正常情況下堿性磷酸酶(alkaline phosphatas,AKP)不能透過(guò)細(xì)胞壁滲出至細(xì)胞外，檢測(cè)不到其活性，因而其活性可以作為反映沙門氏菌SH17細(xì)胞壁是否完整的依據(jù)。

用1.2.4(1)中制備的菌液，按照參考文獻(xiàn)[20]的方法，依據(jù)堿性磷酸酶(AKP)檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明方法進(jìn)行加樣。在520 nm處測(cè)定混合液的OD值，以AKP活性的變化反映藥液對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁的影響。

(4)茶樹(shù)精油對(duì)沙門氏菌SH17胞外蛋白質(zhì)量濃度的影響。用1.2.4(1)中制備的菌液，參照參考文獻(xiàn)[20]，用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測(cè)定，按試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行試驗(yàn)操作。

(5)茶樹(shù)精油對(duì)沙門氏菌電導(dǎo)率的影響。電導(dǎo)率是電解質(zhì)溶液導(dǎo)電能力的表現(xiàn)，與溶液中離子濃度成正比。因而可以通過(guò)測(cè)定電導(dǎo)率來(lái)探究菌體細(xì)胞內(nèi)容物的外溢情況，間接反映細(xì)胞壁的破壞情況[21]。按參考文獻(xiàn)[21]的方法并改良，用1.2.4(1)中制備的菌液，用電導(dǎo)儀測(cè)不同時(shí)間茶樹(shù)精油與沙門氏菌SH17共孵育的電導(dǎo)率，反映細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的變化，探究茶樹(shù)精油對(duì)沙門氏菌SH17細(xì)胞壁的影響。

(6)茶樹(shù)精油對(duì)沙門氏菌SH17生物膜的影響。按參考文獻(xiàn)[22]的方法，將1.2.4(1)中制備的菌液與藥物吹打混勻，分別取300 μL于96孔板中，以肉湯作為空白對(duì)照，37 ℃恒溫培養(yǎng)36 h。之后吸棄96孔板中的液體，每孔加入200 μL甲醇靜置15 min。吸棄甲醇，每孔加入300 μL無(wú)菌PBS進(jìn)行清洗，重復(fù)3次。PBS清洗后，待其自然晾干，每孔加入250 μL 10 g/L的結(jié)晶紫溶液，靜置15 min。吸棄結(jié)晶紫溶液，用無(wú)菌PBS清洗3次，每孔加入250 μL體積分?jǐn)?shù)30%乙酸溶解，30 min后，570 nm波長(zhǎng)下測(cè)其OD，分析茶樹(shù)精油對(duì)沙門氏菌SH17生物膜的影響。

1.2.5 茶樹(shù)精油對(duì)沙門氏菌SH17鞭毛動(dòng)力的影響 參照文獻(xiàn)[23]的方法并改良。菌液制備：用Mueller-Hinton肉湯將過(guò)夜復(fù)蘇的菌液濁度調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠁挝?，再?∶100的比例用Mueller-Hinton肉湯將菌液稀釋，備用。取10 μL槍頭吸取上述備用的沙門氏菌SH17菌液，扎在含不同質(zhì)量濃度(0,2 635,5 270,10 540 μg/mL)茶樹(shù)精油的半固體培養(yǎng)基中央，靜置3～5 min后，于37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)18～20 h，觀察并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 最小抑菌濃度(MIC)與最小殺菌濃度(MBC)

茶樹(shù)精油和抗生素對(duì)沙門氏菌SH17的MIC見(jiàn)表1。由表1可以看出，沙門氏菌SH17對(duì)茶樹(shù)精油的MIC為10 540 μg/mL；對(duì)阿莫西林/克拉維酸、恩諾沙星、四環(huán)素敏感；對(duì)磺胺異噁唑/甲氧芐啶、氟苯尼考、頭孢噻呋、慶大霉素的敏感性較低，表現(xiàn)出耐藥性。

表1 沙門氏菌SH17對(duì)茶樹(shù)精油和抗生素敏感性試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)MIC的試驗(yàn)結(jié)果，吸取無(wú)菌生長(zhǎng)的茶樹(shù)精油質(zhì)量濃度分別為10 540，21 090，42 180，84 350 μg/mL的孔中100 μL菌液,分別涂布Mueller-Hinton瓊脂平板。結(jié)果顯示，從茶樹(shù)精油質(zhì)量濃度為10 540 μg/mL的孔中取出的菌液涂布瓊胎平板上培養(yǎng)后僅有微量菌生長(zhǎng)；涂市其余茶樹(shù)精油質(zhì)量濃度的瓊脂平板無(wú)菌生長(zhǎng)，推斷茶樹(shù)精油對(duì)沙門氏菌SH17的MBC為10 540 μg/mL。

2.2 茶樹(shù)精油對(duì)沙門氏菌SH17耐藥性的影響

2.2.1 茶樹(shù)精油對(duì)沙門氏菌SH17生長(zhǎng)曲線的影響 茶樹(shù)精油對(duì)沙門氏菌SH17生長(zhǎng)曲線的影響如圖1所示。由圖1可知，在培養(yǎng)0～1 h，沙門氏菌SH17在4種含不同質(zhì)量濃度茶樹(shù)精油的菌液中的生長(zhǎng)曲線無(wú)明顯差別；培養(yǎng)1～6 h，含2 635 μg/mL茶樹(shù)精油對(duì)沙門氏菌SH17的抑制作用較小，遠(yuǎn)不如茶樹(shù)精油質(zhì)量濃度為5 270 和10 540 μg/mL處理；在6 h后，2 635 μg/mL茶樹(shù)精油對(duì)沙門氏菌SH17的抑菌作用增強(qiáng)；在1～8 h，茶樹(shù)精油質(zhì)量濃度為5 270和10 540 μg/mL處理對(duì)沙門氏菌SH17的生長(zhǎng)抑制作用較強(qiáng)，其菌液OD600浮動(dòng)較小，一直在0.05～0.15浮動(dòng)。茶樹(shù)精油質(zhì)量濃度為10 540 μg/mL時(shí)，仍有極少量細(xì)菌生長(zhǎng)，和MIC、MBC的定義相符[18]。

圖1 茶樹(shù)精油對(duì)沙門氏菌SH17生長(zhǎng)曲線的影響

2.2.2 茶樹(shù)精油對(duì)沙門氏菌SH17細(xì)胞壁的影響 由圖2可知，加入茶樹(shù)精油的菌液中堿性磷酸酶活性高于不加茶樹(shù)精油的菌液，這表明，茶樹(shù)精油破壞了沙門氏菌SH17的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使菌體內(nèi)的堿性磷酸酶釋放，從而起到抑菌作用。從圖2還可以看出，在培養(yǎng)1～3 h，在茶樹(shù)精油質(zhì)量濃度為0，2 635，5 270，105 40 μg/mL時(shí)，沙門氏菌SH17堿性磷酸酶活性呈上升趨勢(shì)；在3～4 h，各質(zhì)量濃度茶樹(shù)精油處理的沙門氏菌SH17堿性磷酸酶活性呈下降趨勢(shì)。

從圖2還可以看出，堿性磷酸酶變化具有周期性，可能是由于沙門氏菌SH17生長(zhǎng)的周期性所導(dǎo)致的。隨著茶樹(shù)精油質(zhì)量濃度的增加，堿性磷酸酶活性升高且變化趨勢(shì)類似，表明茶樹(shù)精油的質(zhì)量濃度與沙門氏菌SH17堿性磷酸酶活性具有一定關(guān)系，即隨著茶樹(shù)精油濃度的增加，沙門氏菌SH17的堿性磷酸酶活性也隨之增加。

2.2.3 茶樹(shù)精油對(duì)沙門氏菌SH17胞外蛋白質(zhì)量濃度的影響 茶樹(shù)精油對(duì)沙門氏菌SH17胞外蛋白質(zhì)量濃度的影響如圖3所示。由圖3可知，當(dāng)茶樹(shù)精油質(zhì)量濃度為0，2 635，5 270，10 540 μg/m L時(shí)，沙門氏菌SH17胞外蛋白質(zhì)量濃度具有初始值。在0～1 h，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，沙門氏菌SH17胞外蛋白質(zhì)量濃度呈急劇上升趨勢(shì)。雖然1～2 h和3～4 h，2 635，5 270，10 540 μg/mL茶樹(shù)精油使沙門氏菌SH17胞外蛋白質(zhì)量濃度呈下降趨勢(shì)；但隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)沙門氏菌SH17胞外蛋白質(zhì)量濃度總體緩慢上升。隨著茶樹(shù)精油質(zhì)量濃度的升高，沙門氏菌SH17胞外蛋白質(zhì)量濃度也隨之增加。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度的茶樹(shù)精油作用于沙門氏菌SH17后，可能會(huì)對(duì)其細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致其胞外蛋白質(zhì)量濃度增加。

圖3 茶樹(shù)精油對(duì)沙門氏菌SH17胞外蛋白質(zhì)量濃度的影響

2.2.4 茶樹(shù)精油對(duì)沙門氏菌SH17電導(dǎo)率的影響 由圖4可以看出，所有處理沙門氏菌SH17菌液的電導(dǎo)率變化曲線基本一致，均隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)整體呈上升趨勢(shì)；在培養(yǎng)3～4 h時(shí)，各菌液的電導(dǎo)率都有所下降，這主要是受沙門氏菌SH17的生長(zhǎng)周期影響所致。加入茶樹(shù)精油之后菌液的電導(dǎo)率明顯高于不加茶樹(shù)精油菌液，且隨著茶樹(shù)精油質(zhì)量濃度的增加，菌液的電導(dǎo)率逐漸上升。

2.2.5 茶樹(shù)精油對(duì)沙門氏菌SH17生物膜的影響 茶樹(shù)精油對(duì)沙門氏菌SH17生物膜的影響如圖5所示。

圖5 茶樹(shù)精油對(duì)沙門氏菌SH17生物膜的影響

由圖5可知，隨著茶樹(shù)精油質(zhì)量濃度的增大，其對(duì)沙門氏菌SH17形成生物膜的清除作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng)茶樹(shù)精油質(zhì)量濃度為10 540 μg/mL時(shí)，對(duì)沙門氏菌SH17的生物膜抑制最為明顯；與0 μg/mL茶樹(shù)精油相比，其對(duì)沙門氏菌SH17生物膜形成抑制率提高大約50%。有研究表明，茶樹(shù)精油對(duì)表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌生物膜的清除作用較強(qiáng)，且隨著茶樹(shù)精油質(zhì)量濃度越大，對(duì)表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌生物膜的清除能力越大[24]。這與本研究結(jié)果一致。

2.3 茶樹(shù)精油對(duì)沙門氏菌SH17鞭毛動(dòng)力的影響

茶樹(shù)精油對(duì)沙門氏菌SH17鞭毛動(dòng)力的影響如圖6所示。

圖6 茶樹(shù)精油對(duì)沙門氏菌SH17鞭毛動(dòng)力的影響

由圖6可知，沙門氏菌SH17在不含茶樹(shù)精油的空白對(duì)照培養(yǎng)基表面呈圓環(huán)狀生長(zhǎng)，基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，且向下在瓊脂中心部位沿著插入位置向外周擴(kuò)散；當(dāng)茶樹(shù)精油質(zhì)量濃度為2 635 μg/mL時(shí)，沙門氏菌SH17仍有一定程度的運(yùn)動(dòng)性，但相對(duì)于不含茶樹(shù)精油的空白對(duì)照而言，其在培養(yǎng)基表面的生長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)痕跡明顯縮小，且沙門氏菌SH17僅沿著插入培養(yǎng)基的位置生長(zhǎng)；當(dāng)茶樹(shù)精油質(zhì)量濃度為5 270，10 540 μg/mL時(shí)，在培養(yǎng)基平面觀察不到沙門氏菌SH17的運(yùn)動(dòng)痕跡，說(shuō)明茶樹(shù)精油對(duì)沙門氏菌SH17鞭毛動(dòng)力有明顯抑制作用，且隨著茶樹(shù)精油質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)沙門氏菌SH17鞭毛動(dòng)力的抑制作用增強(qiáng)。

3 討 論

研究表明，茶樹(shù)精油對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌均有抑制作用，其對(duì)雞沙門氏菌、綠膿桿菌MIC分別為0.3%，0.25%～2%[25]；對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的MBC分別是0.25%和2～4 mg/mL[6-7]，茶樹(shù)精油對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)[7]；茶樹(shù)精油對(duì)單增李斯特菌的MIC為1～2 mg/mL[8]。本試驗(yàn)中，茶樹(shù)精油對(duì)臨床分離有耐抗生素表型的沙門氏菌SH17的MIC和MBC均為10 540 μg/mL，提示茶樹(shù)精油抑菌作用和殺菌作用可同時(shí)發(fā)揮作用。與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)值上的差異，可能與選用的菌株有關(guān)。研究表明，不同產(chǎn)地的2種茶樹(shù)精油對(duì)大腸桿菌、白色念珠菌、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用，但存在差異，廣西產(chǎn)TTO的MIC為2.64～41.18 mg/mL，澳大利亞產(chǎn)TTO的MIC為1.32～21.09 mg/mL，二者都含有較多的4-萜烯醇[20]。茶樹(shù)精油含松油烯-4-醇(44.4%)、檸檬烯、γ-松油烯、α-松油烯等[26]；通過(guò)GC-MS從3個(gè)廠家的茶樹(shù)精油中共分離鑒定出22種化合物，其主要成分為(-)-α-蒎烯、α-松油烯、1,2,3,5-四甲基苯、 D-檸檬烯、桉葉油醇、γ-萜品烯、α-萜品烯、(-)-4-萜品醇、α-松油醇等，且3個(gè)廠家的茶樹(shù)精油均對(duì)金黃色葡萄球、大腸桿菌和白色念珠菌有較強(qiáng)的抑菌效果，且α-松油醇、α-萜品烯、γ-萜品烯、D-檸檬烯含量的高低會(huì)影響抑菌效果[27]。

低質(zhì)量濃度(0.5 mg/mL)茶樹(shù)精油可抑制單增李斯特菌的生長(zhǎng)[8]，與本試驗(yàn)5 270 μg/mL茶樹(shù)精油對(duì)沙門氏菌SH17生長(zhǎng)曲線的抑制結(jié)果相似。茶樹(shù)精油不僅抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，而且也使菌體總蛋白含量降低，當(dāng)茶樹(shù)精油質(zhì)量濃度升至2 MIC時(shí)，這種抑制作用更明顯，呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系，推測(cè)可能是茶樹(shù)精油破壞了金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的完整性[28]。當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞壁的完整性被破壞時(shí)，AKP被釋放到培養(yǎng)介質(zhì)中；正常情況下，細(xì)菌細(xì)胞壁完整時(shí)無(wú)法檢測(cè)到AKP；因而可通過(guò)檢測(cè)細(xì)菌培養(yǎng)介質(zhì)中是否含有AKP來(lái)判斷細(xì)菌細(xì)胞壁是否受損[29]。當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞壁被破壞后，其內(nèi)容物被釋放出來(lái)，造成細(xì)菌菌體內(nèi)總蛋白含量下降，而胞外蛋白含量增加，電導(dǎo)率增加。茶樹(shù)精油可能破壞了沙門氏菌SH17的細(xì)胞壁，從而導(dǎo)致AKP活性、胞外蛋白質(zhì)量濃度和電導(dǎo)率均增加。這種現(xiàn)象在研究中藥和/或提取物對(duì)沙門氏菌的作用時(shí)也可觀察到，如肉桂醛對(duì)沙門氏菌的作用[30]。這提示中藥的提取物，包括精油類和單體活性成分，對(duì)細(xì)菌的作用機(jī)制可能是相似的。

本試驗(yàn)中，5 270和10 540 μg/mL茶樹(shù)精油對(duì)沙門氏菌SH17生物膜抑制較明顯。研究表明，19.2 μg/mL茶樹(shù)精油作用銅綠假單胞桿菌20 h后，其生物膜完全被清除[31]。缺失bapA基因可導(dǎo)致沙門氏菌失去生物被膜的形成能力，其編碼的bapA蛋白是生物膜形成的必需蛋白；在體外培養(yǎng)上皮細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型菌毛、Lpf和Pef也有助于生物膜的形成[32]。2～4 mg/mL茶樹(shù)精油有較好的抗金黃色葡萄球菌懸浮菌和生物被膜的活性，通過(guò)抑制PIA的合成及eDNA的釋放從而有效抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成，且茶樹(shù)油對(duì)icaA，sarA，cidA，hla等生物被膜相關(guān)基因有抑制作用[7]。這對(duì)下一步如何深入研究茶樹(shù)精油對(duì)革蘭氏陰性菌生物膜的抑制機(jī)制提供了思路。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，2 635 μg/mL茶樹(shù)精油可使沙門氏菌SH17運(yùn)動(dòng)力下降，5 270 和10 540 μg/mL茶樹(shù)精油則完全抑制了沙門氏菌SH17的運(yùn)動(dòng)，表明茶樹(shù)精油對(duì)沙門氏菌SH17的鞭毛動(dòng)力有抑制作用。沙門氏菌致病過(guò)程中需要bcfD、stfH、fimH等毒力基因發(fā)揮定殖、粘附作用[33-34]。這些毒力基因主要為沙門氏菌T3SS分泌系統(tǒng)，其中flgK、flhB、flhA、fgI、fliL和fliN同時(shí)影響鞭毛形成和運(yùn)動(dòng)性；motB影響運(yùn)動(dòng)性，但不影響鞭毛形成[35]。有研究表明，低質(zhì)量濃度(8～16 μg/mL)非抗生素舍曲林可有效降低沙門氏菌的體外生長(zhǎng)活力；0.2 μg/mL舍曲林可使沙門氏菌聚集運(yùn)動(dòng)能力顯著降低，致使舍曲林對(duì)T3SS的毒力基因hilA、invF、prgH的轉(zhuǎn)錄有顯著抑制作用[36]。沙門氏菌與丁香醛共孵育后，T3SS入侵效應(yīng)蛋白和調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)顯著下調(diào)；經(jīng)RT-PCR分析，丁香醛可抑制hilD-hilC-rstA-hilA基因調(diào)控路徑，降低下游效應(yīng)蛋白和調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)[32]。本試驗(yàn)僅觀察到了茶樹(shù)精油對(duì)沙門氏菌SH17鞭毛動(dòng)力有抑制作用，但具體對(duì)沙門氏菌SH17哪個(gè)基因有影響尚待進(jìn)一步研究。