鄧凌帆, 邱珊姍, 劉苗苗, 張建強, 王顏波, 劉齊元, 王建革

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江西 南昌 330045；2.南昌工程學(xué)院水利與生態(tài)工程學(xué)院，江西 南昌 330029； 3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045)

植物育種的重要目標(biāo)之一是利用雜種優(yōu)勢[1].作為避免近交和促進異交的繁育機制，自交不親和(self-incompatibility, SI)是開花植物中廣泛存在的現(xiàn)象，但在育種中，此機制是雜種優(yōu)勢利用的主要障礙，親本雜合導(dǎo)致許多自交不親和物種中自交不親和與自交親和現(xiàn)象非常普遍，這種轉(zhuǎn)換為自交不親和物種增添了新的育種途徑.

一般地，自交不親和分為配子體自交不親和(gametophytic SI, GSI)、孢子體不親和(sporophytic SI, SSI)和遲發(fā)性自交不親和(late-acting SI, LSI)，其中，遲發(fā)性自交不親和專指花粉管生長到胚珠或穿透胚珠后又表現(xiàn)自交不親和類型[2].研究表明[3,4]，自交不親和受S位點控制，該位點有2個連鎖的S基因：花粉S基因和雌蕊S基因，連鎖打破會造成自交不親和向自交親和轉(zhuǎn)變.雖然自交不親和有多種類型，但深入開展自交不親和機制研究的物種并不多，主要局限在5個科內(nèi)，其機制已呈現(xiàn)復(fù)雜特征.在車前科(Plantaginaceae)、茄科(Solanaceae)、薔薇科(Rosaceae)配子體自交不親和植物中，雌蕊S決定因子為S核糖核酸酶(S-ribonuclease, S-RNase)，花粉決定因子為S位點F-box(S-locus F-box, SLF)或S單倍型特有F-box(S-haplotype-specific F-box, SFB)[5,6].罌粟科(Papaveraceae)配子體自交不親和植物中雌蕊決定因子為柱頭乳頭細胞分泌蛋白(stigma-expressed secreted protein, PrsS)，花粉決定因子為花粉表達跨膜受體蛋白(pollen-expressed transmembrane protein, PrpS)[7].在十字花科孢子體自交不親和植物中，花粉決定因子為富含半胱氨酸S位點蛋白(S-locus cysteine rich protein, SCR)，雌蕊決定因子為S位點受體激酶(S-locus receptor kinase, SRK)[8,9].自花授粉時，SCR與SRK互作，激活SRK，然后在M位點受體激酶(M-locus protein kinase, MLPK)參與下，觸發(fā)下游級聯(lián)反應(yīng)，引起自交不親和反應(yīng).關(guān)于遲發(fā)性自交不親和的研究較少，機理尚不清楚.目前研究表明，遲發(fā)性自交不親和通常在同科屬中分布，在基部類群中較多.

木蘭科珍稀植物華木蓮(Sinomanglietiaglauca)處于木蘭屬和木蓮屬連接位置，在演化上具有重要科學(xué)價值[10].與其它木蘭科植物一樣，華木蓮極具觀賞價值，但其自我更新能力較差，無性繁殖困難，只能靠種子繁殖，表現(xiàn)自交不親和.研究表明，華木蓮傳粉、結(jié)實正常，說明華木蓮生殖保障不存在問題，瀕危原因在于生存競爭力弱.如果能使華木蓮從自交不親和轉(zhuǎn)換為自交親和，充分利用最大雜種優(yōu)勢，將為華木蓮育種開辟新的途徑.因此，了解華木蓮自交不親和機理對于華木蓮育種具有重要意義.

華木蓮呈現(xiàn)遲發(fā)性自交不親和特征.在木蘭科中，除華木蓮?fù)猓子裉m(Magnoliadenudata)也呈現(xiàn)遲發(fā)性自交不親和特征[11].研究表明[12,13]，表現(xiàn)遲發(fā)性自交不親和特征的山茶科山茶屬植物茶樹(Camelliasinensis)也有SRK基因.

遲發(fā)性自交不親和與孢子體自交不親和是兩類差別較大的自交不親和類型，而SRK和MLPK基因都是參與孢子體自交不親和反應(yīng)的重要基因.因此，存在的問題有：(1)SRK和MLPK基因是否參與華木蓮的自交不親和響應(yīng)；(2)如果參與，何時何處參與自交不親和反應(yīng)以及作用如何；(3)如果不參與，兩基因為什么如此保守，其功能是什么？基因克隆和亞細胞定位觀察是研究基因功能的前提，本研究目標(biāo)：(1)SgMLPK基因編碼蛋白質(zhì)理化如何？(2)編碼蛋白質(zhì)的亞細胞定位在何處？以期為解決SgMLPK基因在華木蓮自交不親和中的作用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2019年3月至2021年4月進行.華木蓮種植于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，花期分別對自花授粉和異花授粉心皮于授粉前、授粉后0.5 h取樣，取樣后樣品用液氮迅速固定，-80 ℃冰箱凍存，用于RNA提取.用于瞬時的表達材料為煙草k326，種子處理后萌發(fā)1～2 d置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光/暗周期16 h/8 h，光/暗溫度24 ℃，光強1 500 lx，相對濕度85%，60 d后葉片用于瞬時表達.

1.2 RNA提取及華木蓮SgMLPK基因克隆

RNA提取和反轉(zhuǎn)錄采用試劑盒進行，試劑盒TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit和PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit購自TAKARA公司.提取的RNA用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，利用Oligo dT和隨機6-mer引物進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA.在課題組前期三代測序基礎(chǔ)上設(shè)計引物擴增SgMLPK， 前引物序列：5′-ATGGGGAATTGCTGGAGC-3′， 后引物序列：5′-TCATGTATA AAGGGGGGAAGC-3′. 反應(yīng)體系為20 μL： 2×T5 Super PCR Mix for PAGE 10 μL，正向、反向引物各1 μL，模板1 μL，Nuclease-Free Water 7 μL.擴增程序：94 ℃ 5 min變性，然后94 ℃ 1 min，57 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共30個循環(huán)，最后72 ℃ 10 min，4 ℃保存.目的產(chǎn)物克隆采用PROMEGA公司克隆載體pGME-T Easy載體，感受態(tài)大腸桿菌DH5α購自擎科生物公司，具體方法按照試劑盒說明書.對PCR產(chǎn)物低熔點瓊脂糖進行電泳，切取相應(yīng)條帶回收.回收后與pGME-T Easy載體連接，然后通過熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α.挑選克隆進行PCR擴增，被證實的陽性克隆送擎科生物公司測序.

1.3 序列分析

蛋白的理化性質(zhì)與功能相關(guān).為了解SgMLPK基因編碼蛋白的理化性質(zhì)，利用ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)推測蛋白的氨基酸組成；利用Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)分析蛋白結(jié)構(gòu)域，并利用hmmer(https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer)驗證，利用ExPASy(https://web.expasy.org/protscale/)預(yù)測蛋白疏水性，基于TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)對編碼蛋白跨膜區(qū)進行推斷，利用SignalP 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)研究蛋白信號肽，利用Cell-PLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)預(yù)測蛋白亞細胞定位.

1.4 進化分析

基于MLPK同源蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹研究不同物種MPLK基因之間的演化關(guān)系.MLPK同源蛋白序列從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索，去除不完整序列，同一物種蛋白取最長序列，通過hmmer(https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer)鑒定，利用IQ-TREE軟件基于最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap 1 000次，進化樹用Evolview(https://www.evolgenius.info/evolview)展示.

1.5 重組表達載體構(gòu)建

瞬時表達采用表達載體pCAMBIA1302進行，表達載體、質(zhì)粒提取試劑盒及NcoⅠ酶購自擎科生物公司.選取測序證實的陽性克隆用LB液體培養(yǎng)基(10 g·L-1Tryptone、5 g·L-1Yeast extract、10 g·L-1NaCl)培養(yǎng)6 h后，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒.用NcoⅠ酶切割含目的基因片段克隆載體pGME-T Easy，用低瓊脂糖電泳回收目的片段，同時用NcoⅠ酶在多克隆位點NcoⅠ-SpeⅠ處切割表達載體，然后將目的基因與之相連，構(gòu)建目的基因與熒光蛋白基因融合的重組表達載體.將重組表達載體轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞擴增，最后提取質(zhì)粒對構(gòu)建好的重組載體用KpnⅠ/SpeⅠ酶切驗證連接正確性.

1.6 基因瞬時表達與編碼蛋白亞細胞定位

瞬時表達采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染的k326煙草葉片進行，感受態(tài)農(nóng)桿菌GV3101購自上海唯地生物技術(shù)有限公司，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化參照唯地公司程序進行.含有重組表達載體的DH5α細菌用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組表達載體.通過熱激法將重組表達載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101中，于28 ℃振蕩培養(yǎng)2～3 h，在含卡那霉素和潮霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3 d(28 ℃)，利用PCR篩選陽性克隆.對確證的陽性克隆，用含卡那霉素和潮霉素的LB液體培養(yǎng)基，在恒溫28 ℃下振蕩培養(yǎng)菌液 ，并調(diào)至D600 nm=1.0. 然后通過注射法侵染煙草葉片，36 h后用Olympus熒光顯微鏡檢測，共檢測6個葉片，每個葉片3個視野.

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆及序列分析

SgMLPK基因長1 254 bp，命名為SgMLPK(GenBank登錄號：MW 139902)，編碼蛋白共417個氨基酸(圖1)，分子質(zhì)量45.836 ku，等電點9.15.

2.2 SgMLPK蛋白結(jié)構(gòu)分析

在大多數(shù)細胞活動中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)磷酸化是由蛋白激酶和磷蛋白磷酸酶介導(dǎo)的.蛋白激酶催化磷酸從三磷酸核苷酸(通常是ATP)轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)底物側(cè)鏈中的一個或多個氨基酸殘基上，導(dǎo)致影響蛋白質(zhì)功能的構(gòu)象變化.磷蛋白磷酸酶則催化相反的過程.蛋白激酶分為三大類，其特征在于底物特異性；絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、酪氨酸蛋白激酶和雙重特異性蛋白激酶.SgMLPK蛋白結(jié)構(gòu)中存在許多絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸蛋白激酶的催化結(jié)構(gòu)域(圖2a).它不包括雙重特異性激酶的催化域.ExPASy ProtScale分析表明，編碼蛋白存在疏水區(qū)(圖2b)，TMHMM分析未發(fā)現(xiàn)編碼蛋白存在跨膜區(qū)域(圖2c)，但SignalP 5.0分析表明，編碼蛋白有一信號肽，切點在29～30個氨基酸處(圖2d).上述分析表明，SgMLPK具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，為胞質(zhì)類受體激酶家族.

圖1 SgMLPK基因序列及氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence and protein sequence of SgMLPK

a:預(yù)測的SgMLPK結(jié)構(gòu)域;b:預(yù)測的SgMLPK疏水性；c:預(yù)測的SgMLPK跨膜域；d：預(yù)測的SgMLPK信號肽.圖2 SgMLPK結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Structure analysis of SgMLPK

2.3 SgMLPK系統(tǒng)進化分析

圖3 SgMLPK系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of SgMLPK

在NCBI上搜索自交不親和物種MLPK蛋白，去除不完整序列，每物種只取1個，加上SgMLPK,共得到12個序列.所有獲得序列的結(jié)構(gòu)都利用hmmer進行了驗證，均含有Pkinase_Tyr基序.在此基礎(chǔ)上，利用IQTREE構(gòu)建了進化樹(圖3).結(jié)果表明，最佳模型為JTT+G4.根據(jù)進化樹信息，木蘭分支、真雙子葉植物基部群、核心真雙子葉植物出現(xiàn)分支.木蘭分支中木蘭科華木蓮(Sinomanglietiaglauca)與樟科沉水樟(Cinnamomummicranthum)有同源性，其次是真雙子葉植物基部群的蓮科蓮(Nelumbonucifera)和罌粟科罌粟(Papaversomniferum)，超薔薇分支中的十字花科與蕓香科克萊門柚(Citrusclementina)支持率不同，超菊分支中茄科番茄(Solanumlycopersicum)、辣椒(Capsicumannuum)及旋花科牽牛(Ipomoeanil)處于頂端.MLPK系統(tǒng)發(fā)育樹呈現(xiàn)的關(guān)系與物種演化關(guān)系大致相應(yīng).

2.4 重組表達載體構(gòu)建

構(gòu)建的重組表達載體如圖4所示.表達載體pCAMBIA1302含有35S強啟動子，并帶有潮霉素(HygR)和卡那霉素(Kan)抗性基因，SgMLPK基因連接在NcoⅠ-SpeⅠ多克隆位點處，與綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因形成融合基因.在構(gòu)建融合基因時，切除了SgMLPK基因終止密碼，插入位點處酶切識別位點發(fā)生變化，目的基因無法通過酶切回收，但利用PCR擴增可以獲得.對已構(gòu)建的重組表達載體進行KpnⅠ/SpeⅠ酶切(圖5a)，為確保轉(zhuǎn)化后農(nóng)桿菌含有目的基因，對培養(yǎng)后用于侵染的農(nóng)桿菌進行PCR驗證(圖5b)，結(jié)果表明，帶有目的基因的重組表達載體已成功轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌中.

圖4 含SgMLPK的重組表達載體Fig.4 Recombinant expression vector containing SgMLPK

a:重組表達載體酶切驗證；b:重組表達載體PCR驗證.圖5 重組表達載體驗證Fig.5 Validation of recombinant expression vector

2.5 SgMLPK基因的亞細胞定位

基因編碼蛋白亞細胞定位與基因發(fā)揮功能息息相關(guān).為了觀察SgMLPK亞細胞定位，將含有SgMLPK與GFP基因的農(nóng)桿菌直接注射煙草k326葉片進行瞬時表達，36 h后于熒光顯微鏡下觀察其亞細胞定位(圖6).在注射部位周圍，可看到明顯熒光信號，說明基因得到表達正常.進一步觀察表明，在細胞質(zhì)與細胞膜處均有熒光，相對來說，細胞膜處熒光較強.與生物信息學(xué)分析結(jié)果相符.

a:合并；b:熒光；c:明場.圖6 SgMLPK基因的亞細胞定位Fig.6 Subcellular localization of SgMLPK gene

3 討論

在三代轉(zhuǎn)錄組生信分析基礎(chǔ)上，本研究克隆出了SgMLPK基因，全長共1 254 bp，編碼417個氨基酸.編碼蛋白具有Pkinase_Tyr基序，有信號肽，但無跨膜結(jié)構(gòu)，具備磷酸化功能，亞細胞定位于細胞質(zhì)中，近細胞膜處較多.因此SgMLPK具備典型MLPK特征.

在十字花科植物中，MLPK蛋白具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，作為正調(diào)控元件參與孢子體自交不親和反應(yīng).同SRK一樣，MLPK也在開花期間，于柱頭表達， 二者與質(zhì)膜處發(fā)生互作.當(dāng)自花花粉落在柱頭上后，SCR與SRK互作，引起SRK構(gòu)象發(fā)生變化，在MLPK參與下，磷酸化ARC1，觸發(fā)自交不親和級聯(lián)反應(yīng)[14].有研究表明[15]，MLPK屬于胞質(zhì)類受體激酶家族，但產(chǎn)生兩類轉(zhuǎn)錄子MLPKf1和MLPKf2，二者功能相同，但N端膜定位信號肽存在差異，前者通過其N端的豆蔻酰化基序定位到膜上，后者通過N端的疏水區(qū)定位到膜上.也有研究表明[16]，野生型MLPK基因轉(zhuǎn)入乳突細胞能夠抑制自身花粉萌發(fā)和生長，MLPK與SRK可直接作用傳遞SI反應(yīng).本試驗結(jié)果表明，SgMLPK基因與孢子體不親和MLPK基因高度同源，且SgMLPK基因具有MLPK基因典型的特征.

遲發(fā)性自交不親和機理目前尚不清楚，孢子體自交不親和與遲發(fā)性自交不親和為兩種截然不同的類型，由于缺乏深入研究，尚不能確定SgMLPK基因在華木蓮自交不親和中的作用.但華木蓮MLPK基因不僅與十字花科中的MLPK基因高度同源，其編碼蛋白理化性質(zhì)和亞細胞定位也相同，說明在進化中受到了較強的自然選擇作用.基因同源，功能未必完全相同，因此，SgMLPK基因在自交不親和中是否發(fā)揮作用有待于進一步探討.

致謝：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院王義華教授、江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院邊建民教授、南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院羅時文教授、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院陳麗敏博士、中國林科院林研所張冰玉研究員對研究給予了幫助，謹(jǐn)致謝意!