林旗華，鐘秋珍，張澤煌

(福建省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所，福州，350013)

楊梅Myricarubra為楊梅科楊梅屬植物，是中國特色果樹之一，在我國栽培歷史悠久，主要分布于長江流域以南、海南省以北的山地，以浙江、福建等地為主[1-3]。與葡萄和柑桔等大宗果樹相比，楊梅種植面積和產(chǎn)量相對較小，中國楊梅種植面積約30萬hm2[4]。

楊梅果實色澤通常依據(jù)果實中花青苷含量及類別的差異可分為白色、紅色、深紅色、紫紅色和紫黑色等[2，5-6]。東魁楊梅果實紫紅色，研究楊梅資源過程中，我們在東魁楊梅群體中發(fā)現(xiàn)了1個粉色果實的楊梅變異株系，暫定名為白東魁；其植株形態(tài)、葉片形狀及物候期等與東魁楊梅相同，成熟果實淺粉紅，與東魁楊梅及其他楊梅品種存在顯著性差異，具有較好的推廣應用價值[7]。因此本研究分析了東魁和白東魁3個不同發(fā)育階段果實花青苷組分及相對含量，為闡述其色澤形成及推廣應用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

漳州市龍海市浮宮鎮(zhèn)楊梅園12年生東魁，砧木為野生楊梅，白東魁為同批次東魁高接換種植株，在幼果期(花后55 d)、轉(zhuǎn)色期(花后70 d)和成熟期(花后85 d)3個不同發(fā)育階段采樣。兩個品種(系)各選擇樹勢及結(jié)果情況較一致植株3株，每株采集果實20個，為3次重復，果實采摘后迅速切取果肉放置于凍存管中，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 樣品提取 樣品真空冷凍干燥后，利用研磨儀研磨至粉末狀，稱取粉末100 mg，溶解于1.0 mL提取液(70%甲醇水溶液)中，溶解后的樣品4 ℃冰箱過夜，期間渦旋3次，提高提取率；轉(zhuǎn)速10 000×g離心10 min后，吸取上清液，用微孔濾膜(孔徑0.22 μm)過濾樣品，并保存于進樣瓶中，用于LC-MS/MS分析。

1.2.2 色譜質(zhì)譜采集 數(shù)據(jù)采集儀器系統(tǒng)主要包括超高效液相色譜(UPLC，Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A，http：//www.shimadzu.com.cn/)和串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS，Applied Biosystems 6500 QTRAP，http：//www.appliedbiosystems.com.cn/)。

1.2.3 花青苷的定性與相對定量 基于自建數(shù)據(jù)庫MWDB(metware database)及代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫，對質(zhì)譜檢測的一級譜、二級譜數(shù)據(jù)進行定性分析。其中部分物質(zhì)定性，分析時去除同位素信號，含K+離子、Na+離子、NH4+離子的重復信號，以及本身是其他更大分子量物質(zhì)的碎片離子重復信號。花青苷種類結(jié)構(gòu)解析參考了MassBank(http：//www.massbank.jp/)、KNAPSAcK(http：//kanaya.naist.jp/KNApSAcK/)、HMDB(http：//www.hmdb.ca/)、MoTo DB(http：//www.ab.wur.nl/moto/)和METLIN(http：//metlin.scripps.edu/index.php)等已有的質(zhì)譜公共數(shù)據(jù)庫[8]。相對定量利用三重四級桿質(zhì)譜的多反應監(jiān)測模式(multiple reaction monitoring，MRM)分析完成，相對計量單位為收集到的光子個數(shù)/s。

1.2.4 花青苷含量定量分析 花青苷含量測定參照張澤煌等[6]的方法。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和Excel分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 花青苷組分分析

從表1可以看出，成熟期的白東魁和東魁果實中均檢測出7種花青苷，其中矢車菊素3種，分別為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷，矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷和矢車菊素-3-O-鼠李糖苷；飛燕草素2種，分別為飛燕草素-3-O-葡萄糖苷和飛燕草素-3，5-O-二葡萄糖苷；另外2種分別為天竺葵素-3-O-葡萄糖苷和芍藥色素-3-O-葡萄糖苷。在東魁和白東魁的幼果期和轉(zhuǎn)色期均未檢測出飛燕草素-3，5-O-二葡萄糖苷。

表1 白東魁和東魁楊梅不同成熟期果實色澤及花青苷種類

2.2 不同發(fā)育階段果實花青苷含量變化

2.2.1 矢車菊素類花青苷的變化 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷在東魁和白東魁果實3個不同發(fā)育階段均被檢測出，在成熟果實中含量最高，分別為4.76×108和6.63×107個光子/s，東魁是白東魁的7.18倍；在幼果期和轉(zhuǎn)色期，其含量東魁分別是白東魁的1.47倍和33.49倍。東魁果實中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的含量隨著果實成熟迅速提升，成熟期的含量分別是幼果期和轉(zhuǎn)色期的65.93倍和7.40倍。白東魁幼果期和轉(zhuǎn)色期果實中的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量均較低，成熟期迅速提升。

矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷與矢車菊素-3-O-葡萄糖苷相似，在東魁和白東魁果實3個不同發(fā)育階段均被檢測出，同樣在成熟果實中的含量最高，分別為1.21×108和5.42×106個光子/s，東魁是白東魁的22.32倍。在幼果期東魁和白東魁的矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷均維持在較低水平，東魁是白東魁的0.89；在轉(zhuǎn)色期東魁的矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷加速積累，達到白東魁的45.81倍。東魁果實中矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷的含量隨著果實成熟迅速提升，成熟期的含量分別是幼果期和轉(zhuǎn)色期的590.24倍和20.47倍(見圖1)。

圖1 兩個楊梅品種(系)矢車菊素類花青苷含量變化

矢車菊素-3-O-鼠李糖苷含量與其他兩個矢車菊素花青苷差別之處在于成熟果實中白東魁的含量高于東魁，是東魁的1.38倍，分別為2.39×107和1.73×107個光子/s。矢車菊素-3-O-鼠李糖苷同樣在東魁和白東魁果實3個不同發(fā)育階段均被檢測出，成熟果實中含量最高；在幼果期和轉(zhuǎn)色期，東魁中含量分別是白東魁的1.48倍和18.26倍。東魁果實中矢車菊素-3-O-鼠李糖苷含量在果實轉(zhuǎn)色期迅速提升，之后緩慢積累，成熟期的含量為轉(zhuǎn)色期的1.31倍。白東魁與之相反，在成熟階段迅速累積，成熟期的含量是轉(zhuǎn)色期的33.06倍。

2.2.2 飛燕草素類花青苷的變化 飛燕草素-3-O-葡萄糖苷與3個矢車菊素花青苷最明顯的差異是，其在東魁和白東魁幼果期的含量顯著高于轉(zhuǎn)色期，分別是轉(zhuǎn)色期的14.26倍和6.12倍。但在成熟階段，東魁果實中飛燕草素-3-O-葡萄糖苷含量加速累積，超過了幼果期，達到了1.85×107；而白東魁果實的飛燕草素-3-O-葡萄糖苷含量為3.10×106，仍顯著低于幼果期，且只有東魁成熟果實的16.76%。

飛燕草素-3，5-O-二葡萄糖苷均只在東魁和白東魁的成熟果實中檢出，幼果期和轉(zhuǎn)色期均未檢出，東魁成熟果實中的含量是白東魁的10.15倍(見圖2)。

圖2 兩個楊梅品種(系)飛燕草素類花青苷含量變化

2.2.3 其他類花青苷的變化 白東魁和東魁幼果中天竺葵素-3-O-葡萄糖苷含量差異較小，東魁為白東魁的1.31倍；在轉(zhuǎn)色期，東魁中天竺葵素-3-O-葡萄糖苷含量開始迅速累積，增加了26.21倍，而白東魁不升反降，至成熟階段才開始加速累積。在成熟果實中，東魁和白東魁的天竺葵素-3-O-葡萄糖苷含量分別為6.87×107和3.83×107，東魁是白東魁的1.79倍。

東魁和白東魁幼果中，芍藥色素-3-O-葡萄糖苷含量均非常低，基本一致。與天竺葵素-3-O-葡萄糖苷一樣，東魁中芍藥色素-3-O-葡萄糖苷含量在轉(zhuǎn)色期開始迅速累積，增加了13.44倍；而白東魁基本維持不變，至成熟階段才開始加速累積。成熟果實中，東魁和白東魁的芍藥色素-3-O-葡萄糖苷含量分別為2.15×108和1.72×107，東魁是白東魁的12.50倍(見圖3)。

圖3 兩個楊梅品種(系)兩類花青苷含量變化

3 結(jié)論與討論

3.1 楊梅果實花青苷種類分析

花青苷是經(jīng)由苯丙氨酸代謝途徑產(chǎn)生的一類類黃酮化合物，通過糖苷化、羥基化、甲基化和?；刃纬啥喾N穩(wěn)定的花青苷，不同色澤楊梅果實間的花青苷含量差異顯著[9]。葉興乾等[10]和張望舒等[11-12]的研究表明，紅色和紫黑色等楊梅果實中的花青素以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷為主，達85%以上，另還有少量的飛燕草色素和天竺葵色素，但未獲得具體組分。本研究通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術分析，共鑒定出7種花青苷，其中矢車菊素3種，分別為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷和矢車菊素-3-O-鼠李糖苷；飛燕草素2種，分別為飛燕草素-3-O-葡萄糖苷和飛燕草素-3，5-O-二葡萄糖苷；另還檢測到天竺葵素-3-O-葡萄糖苷和芍藥色素-3-O-葡萄糖苷，而芍藥色素-3-O-葡萄糖苷是鮮少在楊梅果實中檢測到。本研究豐富了楊梅果實花青苷的研究寬度與深度，為后續(xù)深入開展楊梅果實色澤形成的分子調(diào)控機理研究以及育種工作打下基礎。

3.2 不同品種(系)果實中花青苷種類及含量差異

本研究發(fā)現(xiàn)，白東魁成熟果實中，除矢車菊素-3-O-鼠李糖苷外，其他6種花青苷的含量均顯著低于東魁，東魁成熟果實中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷、芍藥色素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素-3，5-O-二葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-葡萄糖苷和天竺葵素-3-O-葡萄糖苷含量依次分別是白東魁的7.18倍、22.32倍、12.50倍、10.15倍、5.97倍、1.79倍，推測這是導致白東魁粉色果實最主要的原因。除飛燕草素-3-O-葡萄糖苷外，其他6種花青苷的含量在白東魁和東魁的幼果期含量均極少，轉(zhuǎn)色期加速累積，在成熟期達到最高值，這與牛姍姍[4]和張望舒等[11]對紅色類楊梅果實的研究結(jié)果基本一致。

飛燕草素-3，5-O-二葡萄糖苷在東魁和白東魁的幼果期和轉(zhuǎn)色期均未檢測到，可能在這兩個發(fā)育階段，其含量均非常微小，未達到本研究技術檢測的閾值。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，一是飛燕草素-3-O-葡萄糖苷含量在東魁和白東魁的幼果期即保持在較高水平，顯著有別于其他6種花青苷；二是矢車菊素-3-O-鼠李糖苷和天竺葵素-3-O-葡萄糖苷在東魁轉(zhuǎn)色期果實中即迅速累積，區(qū)別于其他花青苷，這幾種花青苷在楊梅果實發(fā)育過程中的調(diào)控機制有待于進一步研究。