基于FT-MIR的三七粉末摻偽成分的定量檢測(cè)模型研究

何鳳蕓，楊曉東，周勝靈，謝林，李光林

西南大學(xué) 工程技術(shù)學(xué)院，重慶 400715

三七又稱田七、人參三七、金不換等，為五加科植物，主要產(chǎn)于云南、廣西、四川，是一種應(yīng)用于臨床治療的中藥材[1]．通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，三七不僅可以治療咯血、衄血、外傷性出血、腫痛等癥狀[2]，對(duì)冠心病、心絞痛、糖尿病、血栓等疾病也具有良好療效[3]．大量的科學(xué)研究表明，三七有效成分中不僅含有Rb1，Rd，Re，Rg1，Rg2，Rh1，R1，R2，R3，R4，R6，R7等人參皂苷，還包括77種揮發(fā)油、17種氨基酸、丹參堿、三七黃酮類和多糖等[4]．三七的藥用加工方式分為精加工(提煉萃取物)和粗加工(研磨成粉末)兩類．為了盡可能降低成本和牟取最大化的利益，不法商人選擇將三七粉與幾種中藥材粉末混合，在醫(yī)藥市場(chǎng)上以相同甚至更低的價(jià)格出售，不僅擾亂了市場(chǎng)秩序，還損害了消費(fèi)者的利益和健康．為解決摻假問(wèn)題，找出能夠快速精確地鑒別三七粉末純度的方法是非常必要的[5]．

中國(guó)傳統(tǒng)藥材的光譜鑒定主要使用特定波長(zhǎng)的光照射或掃描樣品，獲取特定的圖譜數(shù)據(jù)．中藥材光譜鑒別主要包括紫外光譜、紅外光譜、熒光光譜、核磁共振和質(zhì)譜等方法[6-7]．傅利葉中紅外光譜技術(shù)(Fourier transform mid-infrared，F(xiàn)T-MIR)能檢測(cè)多組分因素，還具有掃描速度快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，不需要與KBr等混合制樣，無(wú)需壓片，比近紅外掃描獲得的數(shù)據(jù)具有更高的完整度．由于FT-MIR具有檢測(cè)精度高、分辨率高、應(yīng)用范圍廣以及不需要對(duì)樣品做預(yù)處理等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于預(yù)防醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、生殖生物學(xué)等領(lǐng)域?qū)悠愤M(jìn)行定量分析．

圖1為實(shí)驗(yàn)流程，實(shí)驗(yàn)使用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換(Standard normal variate，SNV)、基線校準(zhǔn)(Baseline)等方法單獨(dú)或組合進(jìn)行原始光譜數(shù)據(jù)降噪及平滑； 協(xié)同區(qū)間(Synergy interval，Si)、競(jìng)爭(zhēng)自適應(yīng)加權(quán)算法(Competitive adaptive reweighted sampling，CARS)、連續(xù)投影算法(Successive projection algorithm，SPA)等方法用于挑選建模使用的特征變量； 最后分別建立偏最小二乘回歸(Partial least squares regression，PLSR)模型及支持向量回歸(Support vector regression，SVR)模型，再比較建模效果．甘草、合歡樹皮以及向日葵花盤等藥材粉末具有與三七粉末相似的外觀和物理性質(zhì)，僅憑肉眼幾乎無(wú)法分辨他們的差別，這些藥材的價(jià)格也遠(yuǎn)比三七低廉，因此常用于配制三七偽品．實(shí)驗(yàn)將20頭純?nèi)叻勰┡c甘草、合歡樹皮和向日葵花盤等藥材粉末分別按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的10個(gè)摻比混合，并采集所有樣品的FT-MIR光譜數(shù)據(jù)[8-9]．

圖1 三七粉末及其混合物偽品成分定量檢測(cè)模型建立流程圖

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用樣品包括采集于文山產(chǎn)區(qū)的20頭三七1 000 g，購(gòu)買于中藥材市場(chǎng)的純甘草超細(xì)粉末、純向日葵花盤超細(xì)粉末、純合歡樹皮超細(xì)粉末各1 000 g．所有樣本收集完成后均放置于50 ℃恒溫環(huán)境中至質(zhì)量保持恒定．使用研磨機(jī)將烘干后的三七樣品粉碎后過(guò)200目篩，純甘草超細(xì)粉末、純向日葵花盤超細(xì)粉末、純合歡樹皮超細(xì)粉末烘干后也分別過(guò)200目篩，用精天FA1004A萬(wàn)分之一精度電子天平按表1的比例分別稱取甘草、合歡樹皮和向日葵花盤粉末與三七粉末放入瑪瑙研缽中，用缽杵研磨使粉末混合均勻，每種比例制備35份樣品，每個(gè)樣品總質(zhì)量為1 g，用于光譜數(shù)據(jù)采集．建立基于FT-MIR的三七粉末摻偽成分的定量檢測(cè)模型，以實(shí)驗(yàn)樣品摻偽成分的不同質(zhì)量作為濃度變量，保持每一份實(shí)驗(yàn)樣品總質(zhì)量不變，以100%偽品藥物粉末含量為基準(zhǔn)，每次以0.1 g為增量梯度摻入三七粉末，同時(shí)減少0.1 g的偽品．

表1 三七粉末分別與向日葵花盤粉末、甘草粉末、合歡樹皮粉末混合的比例

圖2 三七及其偽品混合物的FT-MIR光譜

1.2 FT-MIR光譜數(shù)據(jù)采集

光譜數(shù)據(jù)采集使用的設(shè)備為傅里葉變換紅外光譜儀(Thermo Fisher Scientific 5225 Verona Rd.Madison，WI 53711)，光譜采集設(shè)備配套軟件為OMNIC，初始化設(shè)置如下：分辨率設(shè)置4 cm-1； 設(shè)置自動(dòng)大氣背景扣除； 每間隔30 min重新采集一次背景信息； 掃描次數(shù)為32次，最終掃描結(jié)果取平均光譜．如圖2所示，單個(gè)樣品通過(guò)實(shí)驗(yàn)最終得到一條FT-MIR光譜．模型建立使用Random Sampling算法劃分?jǐn)?shù)據(jù)集，訓(xùn)練集與預(yù)測(cè)集劃分比例為3∶1，訓(xùn)練集共787條光譜數(shù)據(jù)，預(yù)測(cè)集共262條光譜數(shù)據(jù)．光譜數(shù)據(jù)分析處理使用的軟件包括MATLAB2018a，The Unscrambler X10.4，OriginPro 8等．

1.3 數(shù)據(jù)預(yù)處理和異常值剔除

原始光譜數(shù)據(jù)中常存在一些與待測(cè)樣品性質(zhì)無(wú)關(guān)的噪聲信息，這些干擾信息會(huì)直接造成光譜數(shù)據(jù)的基線漂移．因此，有必要采用預(yù)處理方法消除噪聲，將儀器或環(huán)境的干擾而隨機(jī)引起的噪聲信息最小化，提高樣品光譜的信噪比．SNV和Baseline等方法[10-11]可有效地校正紅外光譜數(shù)據(jù)，消除顆粒大小和分布不均勻?qū)?shù)據(jù)的影響，實(shí)驗(yàn)分別應(yīng)用這兩種光譜預(yù)處理方法及其組合方法對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理后建立回歸模型．

異常值是指樣本中的個(gè)別值[12]，其數(shù)值明顯偏離所屬樣本的其余觀測(cè)值，不屬于同一總體，因此需要通過(guò)數(shù)據(jù)預(yù)處理及特征變量挑選減少它對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾．實(shí)驗(yàn)通過(guò)計(jì)算F值(F-residuals)和T值(Hotelling’s T2)并將此結(jié)果作為評(píng)判變量是否為異常值的標(biāo)準(zhǔn)．F值的大小即為樣本和模型之間的差值，而T值則是表征模型對(duì)樣本描述效果的評(píng)估．當(dāng)F值和T值的計(jì)算結(jié)果超出置信區(qū)間[13]的5%，那么這個(gè)樣本就可被視為異常值．實(shí)驗(yàn)中剔除了一條異常光譜，總計(jì)使用1 049條樣品光譜，每條光譜含7 468個(gè)變量．

1.4 偏最小二乘回歸原理及支持向量回歸建模

PLSR是一種基于因子分析的多元校正方法，廣泛應(yīng)用于定量分析，集成了主成分分析、典型相關(guān)分析、線性回歸分析的優(yōu)點(diǎn)[14]； SVR[15]是在研究二分類問(wèn)題的基礎(chǔ)上提出的，旨在使所有樣本點(diǎn)離超平面的總偏差最?。畬?shí)驗(yàn)中全光譜數(shù)據(jù)、特征波段和特征變量被分別用于建立各自的PLSR和SVR模型，評(píng)價(jià)變量選擇方法主要通過(guò)比較基于不同方法建立的模型效果，依據(jù)均方根誤差(RMSE)和決定系數(shù)(R2)進(jìn)行評(píng)估．

圖3 三七、甘草、向日葵花盤、合歡樹皮粉末光譜

2 結(jié)果與分析

2.1 FT-MIR特征

實(shí)驗(yàn)中使用FT-MIR數(shù)據(jù)，因此采集了波長(zhǎng)范圍400～4 000 nm的反射譜，用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析和建模．全光譜可分為4個(gè)寬區(qū)域：X—H延伸區(qū)(2 500～4 000 nm)、三鍵區(qū)(2 000～2 500 nm)、雙鍵區(qū)(1 500～2 000 nm)和指紋區(qū)(400～1 500 nm)．圖3為純?nèi)叻?、純向日葵盤粉、純甘草粉、純合歡皮粉的FT-MIR光譜，所有藥材粉末的光譜特征都呈現(xiàn)出相似的趨勢(shì)，有明顯吸收峰的波長(zhǎng)約1 008.84 nm和3 285.43 nm，這可能與C—H—O鍵和O—H鍵的對(duì)稱振動(dòng)有關(guān)．當(dāng)樣品受到紅外輻射時(shí)，會(huì)產(chǎn)生反射、吸收等作用，所以物質(zhì)濃度差的變化可以直接反映在能量變化上．

2.2 建模的特征變量選取方法

2.2.1 協(xié)同區(qū)間算法(Si)

Si可以結(jié)合多個(gè)高精度的局部區(qū)間來(lái)最小化模型中的變量數(shù)量[17]．對(duì)于每個(gè)區(qū)間組合，以RMSE作為模型精確度的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，選取RMSE最小的獨(dú)立子區(qū)間建立PLSR模型進(jìn)行預(yù)測(cè)．校正集RMSE為0.014 4，預(yù)測(cè)集RMSE為0.015 1，全光譜劃分為20個(gè)子區(qū)間，此時(shí)經(jīng)Si選擇出的特征波段為第14，15，16，17，18個(gè)子區(qū)間，波長(zhǎng)范圍為759.815 9～1 658 nm，其中共含有1 864個(gè)變量．Si-PLSR方法選擇的特征變量數(shù)與原光譜數(shù)據(jù)的全部變量數(shù)相比已大幅減少，但樣本總量與壓縮后的變量綜合后，對(duì)于建模而言仍然是非常龐大的運(yùn)算量，因此有必要對(duì)樣品光譜的特征變量數(shù)進(jìn)一步壓縮．

2.2.2 競(jìng)爭(zhēng)自適應(yīng)加權(quán)算法(CARS)

與Si相比，CARS[18]是一種變量選擇方法，因此覆蓋面更廣．CARS算法對(duì)于同樣的數(shù)據(jù)集單次運(yùn)行的結(jié)果會(huì)有些差異，即挑選出的變量及其數(shù)量略有不同，在此基礎(chǔ)上建立的定量模型也會(huì)得出略微不同的評(píng)價(jià)結(jié)果．為得到盡可能精確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)120次CARS算法計(jì)算，綜合計(jì)算結(jié)果選取RMSE值最小的變量選擇結(jié)果為后續(xù)建模使用的理想數(shù)據(jù)．圖4即為運(yùn)行120次CARS算法后采用的最優(yōu)結(jié)果，表示隨采樣次數(shù)增加，算法選擇的特征變量在數(shù)量上會(huì)逐漸縮減； 圖4(b)中曲線表示的是RMSE隨采樣次數(shù)的增加而改變的趨勢(shì)，可以看出采樣次數(shù)小于20次時(shí)，預(yù)測(cè)集RMSE穩(wěn)定小于0.05，對(duì)應(yīng)圖4(a)特征變量數(shù)較多，而當(dāng)采樣次數(shù)大于20后，預(yù)測(cè)集RMSE明顯增大，對(duì)應(yīng)圖4(a)顯示變量總數(shù)趨于極小值，說(shuō)明迭代過(guò)多后選擇的特征變量過(guò)少，導(dǎo)致PLSR模型欠擬合； 圖4(c)回歸系數(shù)，展示了每次迭代各變量的回歸系數(shù)值會(huì)隨采樣次數(shù)增加而波動(dòng)的情況，每條曲線都代表著一個(gè)變量的回歸系數(shù)，迭代結(jié)束后回歸系數(shù)不為0的變量被CARS選中．

圖4 CARS算法特征變量選擇結(jié)果

從圖4可以看到，隨著CARS算法迭代次數(shù)在1～15區(qū)間時(shí)，特征變量數(shù)會(huì)急劇減少，預(yù)測(cè)集RMSE值則處于較低水平，回歸系數(shù)此時(shí)同樣沒(méi)有明顯變化； 當(dāng)?shù)螖?shù)處于15～30區(qū)間內(nèi)，特征變量數(shù)量已降至最低，預(yù)測(cè)集RMSE在此階段無(wú)明顯變化，回歸系數(shù)開始劇烈波動(dòng)； 當(dāng)?shù)螖?shù)處于30～40區(qū)間內(nèi)，預(yù)測(cè)集RMSE值急劇上升，這表明隨著特征變量的減少，模型會(huì)欠擬合，大量回歸系數(shù)經(jīng)歷振蕩后波動(dòng)幅值減小，逐漸收斂于零，也存在少量回歸系數(shù)波動(dòng)幅值持續(xù)增大．總體來(lái)看，當(dāng)CARS迭代11次時(shí)，預(yù)測(cè)集RMSE的值最小，回歸系數(shù)也處于穩(wěn)定水平，對(duì)應(yīng)圖4(a)中選出的特征變量總數(shù)為321．

圖5 SPA算法特征變量篩選結(jié)果

2.2.3 連續(xù)投影算法(SPA)

SPA是前向特征變量選擇方法[19]，變量選擇的最終結(jié)果是最小共線性的變量組合，利用向量的投影分析，將波長(zhǎng)投影到其他波長(zhǎng)上，投影向量的大小決定其是否能夠作為待選波長(zhǎng)．實(shí)驗(yàn)在經(jīng)過(guò)Si和CARS選擇后每條樣品光譜留存了321個(gè)變量，使用SPA算法可以在保持建模性能良好的前提下最大限度地減少變量數(shù)．算法迭代最佳結(jié)果校正集RMSE值為0.0210，預(yù)測(cè)集評(píng)價(jià)指標(biāo)RMSE值為0.0286，這表明變量選擇結(jié)果是合理的．圖5為SPA算法特征變量篩選結(jié)果，此時(shí)樣品光譜的變量總數(shù)壓縮到了17個(gè)，分別為1 560.13，1 347.999，1 150.813，1 132.492，1 106.458，1 040.89，1 009.552，985.446 5，945.430 9，889.505 4，862.506 8，845.150 6，839.365 2，804.652 8，799.831 5，786.332 3，759.815 9．

2.3 PLSR與SVR模型比較

表2總結(jié)了不同變量選擇方法的建模結(jié)果．通過(guò)采用Si和CARS及SPA得到的光譜變量建立PLSR和SVR模型，并利用模型結(jié)果評(píng)價(jià)變量選擇的效果．所有模型的決定系數(shù)均在0.97以上，表明所建立的模型具有較好的預(yù)測(cè)效果，也表明中紅外光譜技術(shù)適用于三七粉末成分定量檢測(cè)．由表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比可知，SVR模型在各個(gè)變量選擇方法基礎(chǔ)上的性能表現(xiàn)均優(yōu)于PLSR模型．三七粉末PLSR模型預(yù)測(cè)性能最優(yōu)的是Si-CARS-PLSR模型，校正集RMSE值為0.024 4，R2值為0.992 8； 預(yù)測(cè)集RMSE為0.024 7，R2值為0.992 7．PLSR模型的校正集與預(yù)測(cè)集的RMSE均小于0.046，決定系數(shù)最小值為0.975 1．三七粉末SVR模型預(yù)測(cè)性能最優(yōu)的是CARS-SVR模型，校正集RMSE值為0.019 9，R2值為0.9955； 預(yù)測(cè)集RMSE為0.020 5，R2值為0.994 1．SVR模型的校正集與預(yù)測(cè)集的RMSE均小于0.024 0，R2最小值為0.983 3．在PLSR模型中，與其他變量選擇方法相比，CARS可以選擇回歸系數(shù)絕對(duì)值較大的波長(zhǎng)點(diǎn)去除權(quán)重較小的波長(zhǎng)點(diǎn)，通過(guò)交互驗(yàn)證選擇RMSE值最小的子集，可以有效地求出變量的最優(yōu)組合．在SVR模型中，CARS變量選擇方法對(duì)于三七粉末成分表現(xiàn)了最好的預(yù)測(cè)結(jié)果，顯著減少了模型的光譜變量數(shù)，同時(shí)提高了模型的效率和準(zhǔn)確性．

3 討論

光譜技術(shù)已經(jīng)較為廣泛應(yīng)用于三七質(zhì)量檢測(cè)方面，Nie P C等[20]將三七粉末摻入苦參粉和玉米粉，使用可見光光譜和近紅外光譜分別建立了PLS模型和最小二乘—支持向量機(jī)(LS-SVM)模型．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，近紅外光譜技術(shù)適用于三七粉末的定量檢測(cè)，然而針對(duì)不同批次的檢測(cè)樣品，使用近紅外數(shù)據(jù)建立的判別模型泛化能力有待提升．Chen H等[21]使用了苦參粉、玉米粉分別依照不同比例摻入純?nèi)叻勰┲校杉t外光譜數(shù)據(jù)，在此基礎(chǔ)上建立CARS-PLSR模型進(jìn)行定量分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，基于特征變量建立的PLSR模型效果優(yōu)于基于全光譜變量建立的PLSR模型．三七粉幾乎不溶于水，而玉米粉加入水中溶液會(huì)變渾濁，因此可通過(guò)觀察粉末加水后的溶液清澈程度進(jìn)行判斷．目前，適用于光譜數(shù)據(jù)的定量分析模型多種多樣，如人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(Artificial neural network，ANN)、多元線性回歸(Multivariable linear regression，MLR)、極限學(xué)習(xí)機(jī)(Extreme learning machine，ELM)、BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[22]、PLSR和SVR等，使用的PLSR和SVR模型具有穩(wěn)定性好、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)．三七及其偽品的光譜數(shù)據(jù)特征選擇過(guò)程是：首先將原始光譜劃分為20個(gè)子區(qū)間，使用Si選出特征波段，使用CARS從特征波段中選擇初始特征變量，使用SPA選出最終特征變量，使定量模型盡可能精簡(jiǎn)．

每條原始光譜往往包含幾千個(gè)變量，其中大多數(shù)都是不表示研究對(duì)象特征的冗余信息，使用原始光譜建模會(huì)降低模型預(yù)測(cè)效果，選用的特征變量選擇可以較好地保留原始數(shù)據(jù)中潛在的語(yǔ)義信息，減少建模運(yùn)算量．三七及其偽品的光譜數(shù)據(jù)特征變量選擇過(guò)程即首先將原始光譜劃分為20個(gè)子區(qū)間，使用Si選出特征波段，再結(jié)合CARS從中選擇特征變量，最后利用SPA將特征變量數(shù)壓縮至盡可能?。畬?shí)驗(yàn)完成了快速識(shí)別以及三七粉末及其偽品混合物的定量檢測(cè)，包括數(shù)據(jù)預(yù)處理、特征波段提取、特征變量選擇以及定量模型評(píng)估等，SNV和Baseline等方法單獨(dú)或組合用于原始光譜數(shù)據(jù)降噪及平滑； Si，CARS，SPA等用于挑選建模使用的特征變量； 最后分別建立PLSR及SVR模型．

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)T-MIR是定量檢測(cè)三七粉末摻入偽品的有效方法．實(shí)驗(yàn)采用Si，CARS和SPA 3種變量選擇方法來(lái)提高模型的穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)精度，其中基于CARS方法挑選的特征變量訓(xùn)練的SVR和PLSR模型對(duì)三七粉成分檢測(cè)都有較好的預(yù)測(cè)效果．對(duì)比兩種建模結(jié)果可知，SVR在使用相同變量時(shí)建模精度優(yōu)于PLSR，實(shí)驗(yàn)中建立的所有三七粉末及其混合物偽品成分定量檢測(cè)模型準(zhǔn)確率最高的是CARS-SVR模型，評(píng)估參數(shù)校正集R2值為0.995 5，校正集RMSE值為0.019 9； 預(yù)測(cè)集R2值為0.995 2，預(yù)測(cè)集RMSE值為0.020 5，該模型的建立基于254個(gè)特征變量，數(shù)據(jù)量仍有進(jìn)一步壓縮的空間．CARS-SPA-PLSR/SVR模型使用了數(shù)量最少的特征變量，與原始光譜的建模結(jié)果比對(duì)，即使是變量數(shù)從7 468減至12個(gè)，其建模效果仍優(yōu)于全光譜．原始光譜數(shù)據(jù)在經(jīng)過(guò)特征變量選擇后，不僅可提升建模精度，還能優(yōu)化建模速度，為實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供了可行穩(wěn)固的方案．SNV-Baseline作為數(shù)據(jù)預(yù)處理方法有效消除了原始光譜數(shù)據(jù)中的噪聲信息，使用變量選擇方法CARS方法可以極大地壓縮特征變量數(shù)目，優(yōu)化建模效果．實(shí)驗(yàn)表明，CARS-SPA-SVR模型具有實(shí)際應(yīng)用潛力，對(duì)今后的三七粉末質(zhì)量分級(jí)、檢測(cè)和篩選具有重要意義．